LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR

MENENTUKAN JUMLAH & UKURAN MIKROBA

NAMA : Rifki Muhammad Iqbal

NIM : 1211702067

KELAS : III B

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) SUNAN GUNUNG DJATI

BANDUNG

2012

MENENTUKAN JUMLAH & UKURAN MIKROBA

Tanggal Praktikum : 30 November 2012

I. Tujuan Praktikum

- Melakukan pengukuran sel mikroorganisme.

- Melakukan perhitungan mikroba dengan cara Plate Count, MPN, dan

Haemotytometer.

II. Dasar Teori

Mikroorganisme adalah makhluk hidup yang mempunyai ukuran yang sangat kecil.

Untuk mengamati mikroba tidak bisa digunakan mata telanjang. Beberapa alat digunakan

untuk mengamatinya, seperti mikroskop dengan perbesaran yang beragam. Selain diamati,

mikroorganisme atau mikrobia tersebut juga dapat dihitung.Perhitungan ini diperlukan untuk

mengetahui seberapa banyak jumlah mikroba yangada di dalam sampel. Alat yang digunakan

untuk menghitung mikroba ini adalahcolony counter. Jumlah mikroorganisme dapat dihitung

melalui beberapa cara, namun secara mendasar dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu

perhitungan langsung dan tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui

beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada suatu saat tertentu tanpa

memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah organisme yang diketahui dari cara

tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan

perhitungan (Arya, 2008).

Perhitungan secara langsung, dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain adalah

dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai)

dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak

langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih

hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, adabeberapa cara yaitu : perhitungan pada

cawan petri (total plate count / TPC),perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah

terkecil atau terdekat (MPNmethode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri).

Metode perhitunganMPN sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung jumlah

bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis

bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan produksi

tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah

amonium menjadi nitrat (Lim, 1998).

Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif

koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa

dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap.Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan

analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform

dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak

langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan

berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang

dapat hidup yang terdapat pada sampel) seperti yang dilakukan pada percobaan ini. (Lay,

1994).

Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai

macam penelaahan mikrobiologis. Berbagai macam cara dapat dilakukan untuk menghitung

jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan

secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah

dengan membuat preparat dari austu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai)

dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak

langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih

hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada

cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah

terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri)

(Dwidjoseputro,1998).

III. Metode PraktikumIII.1. Alat dan Bahan

Alat Bahan

Mikroskop Alcohol 70 %

Cover glass Akuades

Chamber / haemochitometer Biakan bakteri

Tabung reaksi

III.2. Cara Kerja

Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung)

IV. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

IV.1.Hasil Pengamatan

Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70 % lalu keringkan dengan tissue.

Letakkan cover glass di atas alat hitung.

Tambahkan ± 50 µl suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan pada parit kaca pada alat hitung.

Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas).

Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran 40x10.

Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak.

Lukan pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10, apabila bertumpuk.

Hitung sampel, paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih baik).

Gambar Keterangan

Haemacytometer, merupakan sejenis alat yang digunakan untuk menghitung bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil.

Jarum ose, merupak alat yang digunakan untuk mengambil biakan bakteri.

Tabung reaksi, digunakan sebagai tempat

atau wadah bahan yang berisi bakteri.

Proses pemasukkan larutan Alkohol 70 %

kedalam tabung reaksi.

Proses pengambilan biakan bakteri yang nantinya akan dimasukkan kedalam tabung reaksi yang sudah berisi larutan alkohol 70 %.

Proses pemasukkan biakan bakteri kedalam tabung reaksi.

Menutup bagian atas Haemacytometer dengan kaca penutup sebelum diisi dengan biakan bakteri.

Proses pemasukan biakan bakteri kedalam celah-celah Haemacytometer.

Proses identifikasi dibawah mikroskop.

IV.2.Pembahasan

Penghitungan jumlah bakteri hidup terbagi atas dua, yaitu secara

(tidak langsung) Misalnya perhitungan pengurangan jumlah substrat dan

secara langsung. Penghitungan mikroba secara langsung antara lain:

1.      Plate Count (hitungan cawan)

Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel

mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni

setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang

sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan

merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam

suspensi tersebut.

2.      Turbidimetri

Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah

bakteri dalam suatu larutan menggunakan spektrofotometer. Bakteri

menyerap cahaya sebanding dengan volume total sel (ditentukan oleh

ukuran dan jumlah). Ketika mikroba bertambah jumlahnya atau semakin

besar ukurannya dalam biakan cair, terjadi peningkatan kekeruhan dalam

biakan. Kekeruhan dapat disebut optical density (absorbsi cahaya,

biasanya diukur pada panjang gelombang 520 nm – 700 nm). Untuk

mikroba tertentu, kurva standar dapat memperlihatkan jumlah

organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungan cawan) hingga

pengukuran optical density (ditentukan dengan spektrofotometer).

3.      Hemasitometer

Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis.Ruang

hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di

tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,05 mm. Satu

kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu

kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini

adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume

ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat

diketahui.

Perhitungan Bakteri Secara Langsung

Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah

dengan membuat preparat dari austu bahan (preparat sederhana

diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting

chamber) (Sutedjo, 1991).

Enumerasi mikroba dapat dilakukan secara langsung yaitu dengan

menghitung jumlahnya tanpa ditumbuhkan terlebih dahulu dalam suatu

medium, dalam teknik ini semua sel mikroba baik yang idup maupun yang

mati akan terhitung. Untuk melakukan enumerasi mikroba dalam suatu

bahan seringkali diperlukan pengenceran bertingkat(Waluyo 2010).

Pengenceran dilakukan untuk memenuhi syarat penghitungan

statistik, yaitu jumlah mikroba yang dihitung tidak boleh lebih dari 100

dengan demikian, kesalahan penghitungan dapat diminimalkan.

Perhitungan Bakteri Secara Tidak Langsung

Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk

mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup

saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu :

perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan

melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN

methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Sutedjo,

1991).

1. Berdasarkan kekeruhan

Mikroba dalam suatu bahan cair dapat dideteksi berdasarkan

kekeruhannya. Pertumbuhan sel bakteri didalam suatu medium cair akan

meningkatkan kekeruhan media, yang akan mempengaruhi jumlah sinar

yang dapat ditransmisikan menembus medium. (Waluyo, 2010).

2. Berdasarkan jumlah lempeng total (plate count)

Cara ini adalah cara yang paling umum digunakan untuk menentukan

jumlah mikroba yang masih hidup, berdasarkan jumlah koloni yang

tumbuh. Teknik ini diawali dengan pengenceran sampel secara seri,

dengan kelipatan 1 : 10. Masing-masing suspensi pengenceran ditanam

dengan metode tuang (pour plate) atau sebar (spread plate). Bakteri akan

bereproduksi pada medium agar dan membentuk koloni setelah 18-24

jam inkubasi. Untuk menghitung jumlah koloni dalam cawan petri dapat

digunakan alat ’colony counter’ yang biasanya dilengkapi dengan

pencatat elektronik. (Waluyo, 2010).

Hemasitometer

Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk

melakukan perhitungan sel secara cepat dan dapat digunakan untuk

konsentrasi sel yang rendah.Hemasitometer pada mulanya diperuntukkan

untuk menghitung sel darah, yang ditemukan oleh Louis-CharlesMalassez.

Penghitungan konsentrasi sel pada hemasitometer ini bergantung

pada volume dibawah coverslip. Pada chamber terdapat 16 persegi besar

yang memiliki persegi-persegi kecil di dalamnya, di mana sisi persegi kecil

besarnya 0,05 mm. Jika di atas bagian yang diasah tadi diletakkan sebuah

kaca penutup, maka akan terbentuk ruangan yang tingginya 0,1 mm.

Sehingga volume dari satu persegi kecil adalah 0,05*0,05*0,1

mm3=25.10-5 mm3.

Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer

adalah dapat menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati,

tergantung dari pewarna yang digunakan. Misalnya, bila pewarna trypan

blue dicampukan ke dalam larutan sel maka sel yang hidup tidak akan

berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru. Kelebihan lainnya adalah

morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan data

mendeteksi kontaminasi . (id.wikipedia.org).

Hemasitometer yang akan digunakan dalam percobaan adalah tipe

Neubauer-Improved.Sebelum dilakukan pengamatan, terlebih dahulu

harus dibersihkan hemasitometer dan cover glass dengan menggunakan

alkohol.Hal ini dimaksudkan agar hemasitometer bersih dari debu dan

kuman yang dapat mengganggu perhitungan.Setelah dibilas dengan

alkohol, hemasitometer dikeringkan dengan menggunakan tisu lensa.Pada

saat pengeringan, tisu lensa tidak boleh digosok-gosokkan pada

permukaan hemasitometer.Hal ini bertujuan agar garis-garis yang

terdapat pada hemasitometer tidak hilang.Permukaan lensa objektif dan

lensa okuler pada mikroskop harus dibersihkan terlebih dahulu dengan

menggunakan tisu lensa. Hal ini bertujuan untuk membersihkan debu dan

kotoran yang dapat mengganggu proses penghitungan mikroba.

Pengamatan dilakukan pada perbesaran 400X.

Kelemahan Dan Kelebihan Dari Metode Perhitungan Bakteri Secara Langsung

Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak

memerlukan banyak peralatan. Namun mempunyai kelemahan sebagai

berikut:

Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang

hidup. Karena itu keduanya terhitung. Dengan kata lain hasil yang

diperoleh ialah jumlah total sel yang ada di dalam populasi. Pada

beberapa macam sel eukariotik, penambahan zat warna tertentu

(misalnya biru metilen sebanyak 0,1 %) pada sampel yang akan

dihitung dapat membedakan sel hidup dari sel mati. Pada sel khamir

misalnya baik sel hidup maupun sel mati akan menyerap biru metilen

namun hanya sel hidup mampu mereduksi zat warna tersebut secara

enzimatik menjadi tidak berwarna; jadi sel-sel mati akan tampak biru.

Sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, seperti

bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan

digunakannya lensa obyektif celup minyak, sehingga kalau tidak teliti

tidak terhitung.  Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel

sehingga menjadi lebih mudah dilihat.

Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus

cukup tinggi, minimal untuk bakteri 106 sel/mL. Hal ini disebabkan

dalam setiap bidang pandang yang diamati harus terdapat sejumlah

sel yang dapat dihitung

Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan

yang banyak mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal

tersebut akan mengganggu dalam perhitungan sel.

Kelemahan lain adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran

sangat kecil seperti bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak

memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup minyak. Hal ini

biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih mudah

dilihat. Kadang-kadang sel cenderung bergerombol sehingga sukar

membedakan sel-sel individu. Cara mengatasinya ialah mencerai-beraikan

gerombolan sel-sel tersebut dengan menambahkan bahan anti gumpal

seperti dinatrium etilen diamin tetraasetat dan Tween 80 sebanyak 0,1 %.

Cara Menghitung Sel Mikroorganisme Dengan Ruang Hitung

Karena letak mikroorganisme tidak beraturan maka perlu dilakukan

perjanjian supaya tidak terjadi perhitungan dua kali, yaitu :

o Sel-sel pada sisi kanan dan bawah tidak dihitung pada kotak yang

sedang diamati/dihitung.

o Sel-sel pada sisi kiri dan atas tetap dihitung pada kotak yang

sedang diamati/dihitung.

Metode Perhitungan

Prinsip dari perhitungan Petroff-Hauser yaitu melakukan perhitungan

dengan pertolongan kotak-kotak skala, di mana dalam setiap ukuran skala

seluas 1 mm2 terdapat 25 buah kotak besar dengan luas 0,04 mm2, dan

setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil. Alat haemocytometer

digunakan di bawah mikroskop, sisinya mempunyai ukuran 0,05 mm.

Sedangkan satu kotak sedang berukuran nilai 0,2 mm. Dan tebal nya

adalah 0,1 mm. Jumlah sel per mL sampel dapat dihitung sebagai berikut:

Jumlah sel dalam 25 kotak besar = Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak

Jumlah sel per mm3 sampel = Jumlah sel dalam 25 kotak besar  ×

(1/0,02)

Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per mm3 sampel × 103

                                                     = Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak× (1/0.02)x

10^3 

Jumlah sel per ml sampel =  Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak × 50 ×

103

Misalnya : didapatkan jumlah mikroba yang mau dihitung 12 sel mikroba,

maka jumlah sel per ml sampel adalah: 12 × 1,25 × 106 = 1,5 × 107.

Kategori jumlah sel yang di dapat setelah melakukan praktikum adalah :

Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2,5 x 105

= 13 x 2,5 x 105

= 32,5 x 105

Berdasarkan hasil pengamatan dan perhitungan jumlah mikroba ini di dapat hasil 32,5

x 105 per mili liter (ml) jumlah sel bakteri ini termasuk kedalam kategori jumlah banyak

sehingga dengan jumlah yang banyak tersebut dapat dikatakan suspensi bakteri Sarcina yang

terkontaminan E.coli ini bersifat patogen.

V. Kesimpulan

Dari praktikum tersebut dapat disimpulkan bahwa jumlah mikroba

yang dihitung secara langsung yang terlihat pada perbesaran 400x adalah

13 koloni.Pada praktikum kali ini kita menggunakan alat

Hemasitometer.Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan

untuk melakukan perhitungan sel secara cepat dan dapat digunakan

untuk konsentrasi sel yang rendah.

Aturan penghitungan bakteri dengan Haemocytometer adalah :

1. Sel-sel pada sisi kanan dan bawah tidak dihitung pada kotak yang sedang diamati/dihitung.

2. Sel-sel pada sisi kiri dan atas tetap dihitung pada kotak yang sedang diamati/dihitung ∑ sel

yang didapat pada praktikum kali ini adalah 32,5 x 105 , jumlah bakteri ini termasuk kategori

jumlah banyak sehingga bakteri tersebut bersifat patogen.

Daftar Pustaka

Dwijoseputro, d. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan ; Jakarta.

Hadioetomo, R. S. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia; Jakarta.

Lay, Bibiana W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada;

Jakarta.

Sutedjo.1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta ;Jakarta.

Waluyo, lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM; Malang.