Pengembangan Pengujian Interaksi antara Single-Stranded Asam nukleat Terperangkap dengan Partikel silika dan Senyawa neon

Biopolimer yang mudah terdenaturasi dengan pemanasan, perubahan pH atau kimia zat ketika mereka bergerak pada substrat. Untuk mencegah denaturasibiopolimer, kami mengembangkan metode untuk menjebak polynucleotide pada substrat oleh hidrogenikatan menggunakan partikel silika dengan permukaan dimodifikasi oleh rantai aminoalkyl([A-AM silan] / SiO2).[A-AM silan] / SiO2 disintesis oleh reaksi kopling silan dariN-2-(aminoetil)-3-aminopropyltrimethoxysilane (A-AM silan) dengan SiO2 partikel dengandiameter 5 m pada 100 C selama 20 menit. Permukaan struktur kimia [A-AMsilan] / SiO2 ditandai dengan Transformasi Fourier inframerah spektroskopi dan molekulerperhitungan orbital. Permukaan partikel silika dimodifikasi dengan A-AM silan dangugus amina primer terbentuk. [A-AM silan] / SiO2 terjebak dengan beruntai tunggalasam nukleat [(Poly-X, X = A (adenin), G (guanin) dan C (sitosin)] dalam larutan PBS di37 C selama 1 jam. Asam nukleat beruntai tunggal terjebak pada permukaan [A-AMsilan] / SiO2 oleh ikatan hidrogen untuk membentuk bahan terkonjugasi. Kompleks yang dihasilkanyang lebih terkonjugasi oleh turunan acridine orange (AO) sebagai label neon di bawahkondisi yang sama untuk membentuk [AO: Poly-X: A-AM silan] / SiO2 kompleks. Perubahanintensitas fluoresensi kompleks ini berasal dari interaksi antaraasam nukleat beruntai tunggal dan senyawa aromatik juga dievaluasi. PerubahanIntensitas ditampilkan urutan [AO: Poly-G: A-AM silan] / SiO2> [AO: Poly-A: A-AMsilan] / SiO2 >> [AO: Poly-C: A-AM silan] / SiO2. Hal ini menunjukkan bahwa beruntai tunggalasam nukleat terkonjugasi dengan rantai aminoalkyl pada permukaan SiO2 partikel danperubahan intensitas fluoresensi mencerminkan interaksi molekul antara AO danbasa nukleat-asam dalam sebuah polynucleotideKata kunci: asam nukleat, polinukleotida, pengujian, fluoresensi, cellstain-AO1. pengantarBaru-baru ini, protein-fungsi susunan / atau proteomik fungsional telah menarik perhatian sebagai sebuah novelbioteknologi yang dapat memperoleh informasi tentang interaksi antara protein dan protein lain,nukleotida atau molekul kecil. Untuk membangun pengujian ini, perlu untuk melumpuhkan berbagai jenisprotein pada substrat. Konjugasi protein dan biopolimer dengan substrat adalah terobosanteknologi untuk pengembangan protein-fungsi susunan. Banyak studi kimia permukaan terkait denganbiomolekul telah dilaporkan.Fisik adsorpsi telah banyak digunakan sebagai metode imobilisasi [1,2]. Ketika solusimengandung protein ditambahkan tetes demi tetes ke nitroselulosa [1] atau polyvinylidene fluoride membran [2],protein ini bergerak pada permukaan membran oleh interaksi hidrofobik, namun, adhesilemah. kimia terikat bovine serum albumin (BSA) pada substrat kaca menggunakanaldehida dan kemudian lebih lanjut amobil protein lain di permukaan BSA-dimodifikasi ini [3]. The karboksilkelompok dari residu glutamat di BSA dikonversi menjadi ester aktif, yang terikat pada aminokelompok dalam protein lain. Sebuah metode yang berbeda dilaporkan oleh Zhu et al. [4] yang bergerak protein padasubstrat kaca dimodifikasi dengan gugus epoksi melalui ikatan kimia untuk kelompok amino dalam protein.Jung dan rekan kerja amobil peptida pada permukaan dilapisi emas elektroda denganmembran rakitan (SAM) [5]. Dalam kasus ini, akhir dari SAM, yang terdiri darikelompok p-hydroxyazobenzene, diubah menjadi p-quinonimine dengan elektrolisis dan oksidasi. sisteinresidu dalam peptida bereaksi dengan p-quinonimine oleh 1,4-adisi Michael. Sementara itu, Byeon et al.antibodi amobil pada substrat melalui kondensasi hidrazin dan aldehida di hadapananilin sebagai katalis [6]. Kami telah mengembangkan polystyrene (PS) microbeads, dimodifikasi dengan schizophyllan (SPG) ataupolisakarida [7]. Berat molekul SPG adalah sekitar 150.000 dan akhir unit yang telah dimodifikasi dengangugus amino. Kelompok amino SPG terikat kovalen dengan gugus karboksil pada permukaan dukungan untuk membentukkomposit PS SPG [8]. Asam nukleat yang istimewa teradsorpsi pada khususnya, dan dapat dideteksi olehyang microelectrode ketika adsorben terdiri dari PS microbeads dengan permukaan SPG-dimodifikasi. Sebuah metode imobilisasi protein yang berbeda melibatkan menggunakan protein ditanamkan dengan ligan yang bertindak sebagaitag [9]. Tag terdiri dari urutan yang kontinu dari tujuh sampai delapan residu histidin dan bisa obligasi untukkompleks Ni pada permukaan substrat. Keuntungan dari metode ini adalah bahwa semua protein berkoordinasi dalamarah yang sama, yang mencegah deaktivasi. Telah dilaporkan bahwa 80% dari 5800 jenis protein ragimempertahankan aktivitas mereka ketika bergerak menggunakan metode ini. Katayama et al. imobilisasi juga melaporkandari reseptor estrogen [10] dan faktor transkripsi [11] pada elektroda emas menggunakan metode ini.Namun, penelitian dasar menyelidiki konjugasi protein atau biopolimer ke permukaan padat tidakselalu cocok untuk aplikasi untuk teknologi array protein-fungsi, meskipun berbagai metode memilikitelah dikembangkan. Secara khusus, metode imobilisasi kebanyakan menggunakan ikatan kovalen dan / atau hidrofilikinteraksi antara protein atau biopolimer dan permukaan padat. Ada beberapa contohmetode imobilisasi menggunakan ikatan hidrogen.Dalam studi ini, kami dibuat partikel silika dengan permukaan yang dimodifikasioleh rantai aminoalkyl. itugugus amino diperkenalkan di permukaan dapat berinteraksi dengan asam nukleat untai tunggal melalui hidrogenikatan, menghasilkan konjugasi antara bahan polynucleotide dan anorganik. The beruntai tunggalasam nukleat terjebak ke partikel silika selanjutnya berinteraksi dengan jeruk turunan acridine sebagailabel neon, memungkinkan perubahan intensitas fluoresensi berasal dari interaksi antaraSenyawa asam nukleat beruntai tunggal dan aromatik untuk diselidiki. Afinitas jeruk acridinederivatif untuk berinteraksi dengan asam nukleat beruntai tunggal terjebak pada partikel silika dibahasProsedur eksperimental2.1. Persiapan SiO2 Partikel Modifikasi dengan Chains AminoalkylMekanisme reaksi kopling silan pada permukaan SiO2 ditunjukkan pada Gambar 1 [12]. silika Hypersil(GL Ilmu Co, Ltd, Jepang, diameter partikel: 5 pm) digunakan sebagai SiO2 partikel. Dua jenis silanderivatif yang digunakan, N-2-3-aminoetil-aminopropyltrimethoxysilane (KBM-603; disingkatA-AM silan) dan N-fenil-3-aminopropyltrimethoxysilane (KBM-573, disingkat B-AM silan).Kedua bahan kimia yang dibeli dari Shin-Etsu Chemical Co, Ltd, Jepang. Struktur ini ditunjukkan dalamGambar 2. Derivatif silanol yang dibentuk oleh hidrolisis derivatif silan dalam larutan airmengandung 2%, 20% dan 40% A-AM atau B-AM silan pada 20 C selama 30 menit. Reaksi kopling silansetiap derivatif silanol dilakukan pada 100 C selama 10 menit dalam gelas Teflon. Gugus hidroksilderivatif silanol yang terikat secara kovalen dengan gugus hidroksil pada permukaan SiO2 melalui kondensasiReaksi untuk membentuk SiO2 partikel dimodifikasi dengan rantai aminoalkyl, [X-AM silan] / SiO2 (X = A: aminokelompok dan B: gugus fenil).Gambar 1. Mekanisme reaksi kopling silan pada partikel SiO2. 2.

Analisis Permukaan Struktur KimiaKelompok fungsional pada permukaan aminoalkylated SiO2 partikel dianalisis secara kualitatif olehTransformasi Fourier inframerah spektroskopi (FT-IR, Perkin Elmer, USA). Spektrum dicatat menggunakan KBrcakram berisi 1 sampai 5% berat sampel. Penggantian rantai aminoalkyl pada permukaan SiO2 adalahlanjut dikonfirmasi oleh fluoresensi pelabelan. Skema reaksi juga diilustrasikan pada Gambar 2. masing-masingsampel (5 mg) dan fluorescein isothiocyanate (FITC, 2,5 mg / mL, Dojindo Laboratories Co, Ltd, Jepang)dalam larutan PBS diaduk pada 20 C selama 5 menit. Sampel dicuci dua kali dengan air suling (DW)untuk memberikan label aminoalkylated SiO2 partikel [FITC: X-AM silan] / SiO2 (X = A: kelompok dan B amino:gugus fenil). Intensitas fluoresensi ditentukan dengan menggunakan mikroskop fluoresensi (U-RFLT50Penggantian Rantai aminoalkyl FUNDS permukaan SiO2 adalahACLS dikonfirmasi Oleh fluoresensi pelabelan. Skema reaksi JUGA diilustrasikan FUNDS gambar 2. masing sektor-masing sektorsampel (5 mg) Dan fluorescein isothiocyanate (FITC, 2,5 mg / mL, Dojindo Laboratories Co, Ltd, jepang)Dalam, larutan PBS diaduk FUNDS 20 C Pola diklat 5 menit Bahasa Inggris. Sampel dicuci doa Kali Artikel Baru udara suling (DW)label untuk memberikan aminoalkylated SiO2 partikel [FITC: X-AM silan] / SiO2 (X = A: nama kelompok Dan B amino:gugus fenil). Intensitas fluoresensi ditentukan Artikel Baru menggunakan mikroskop fluoresensi (U-RFLT50Olympus, Jepang) pada panjang gelombang 520 nm. [FITC: X-AM silan] / SiO2 (5 mg) didispersikan dalam DW(300 uL) dan ditempatkan di salah satu sumur slide budaya (ukuran ini: 10 mm2, BD Co, Ltd, USA).Setelah pengendapan larutan partikel selama 5 menit, gambar yang diperoleh pada 15 poin sewenang-wenang dalam seldan dianalisa untuk menentukan intensitas rata-rata.2.3. Menjebak Prosedur Asam nukleat Single-Stranded Menggunakan Aminoalkylated SiO2 PartikelSebuah diagram alur menguraikan penyusunan kompleks asam nukleat beruntai tunggal terjebak denganSenyawa [A-AM silan] / SiO2 dan fluoresensi ditunjukkan pada Gambar 3. Skema ilustrasi adalahjuga ditunjukkan pada Gambar 4. Asam nukleat untai tunggal hanya terdiri dari sitosin, adenin atau guanin(poli-C, poli-poli-A dan G, masing-masing; Wako Kimia, Jepang) digunakan. Solusi poli-X (X = C,A atau G, 12,5 mg / mL) dalam PBS disiapkan. Campuran setiap solusi poli-X dan [A-AM silan] / SiO2(5 mg) diinkubasi pada suhu 37 C selama 1 jam. Partikel-partikel dipisahkan dengan sentrifugasi dan kemudian dicuci denganmemberikan kompleks polynucleotide dan [A-AM silan] / SiO2 ([Poly-X: A-AM silan] / SiO2; Gambar 4a). sebuahacridine orange derivatif (bernama AO) digunakan sebagai label neon (Cellstain-AO; DojindoLaboratorium Co, Ltd, Jepang). Struktur kimia ditunjukkan pada Gambar 4b. Ketika AO berinteraksi dengangugus fosfat dan / atau nucleobase di polynucleotides beruntai tunggal, seperti DNA komplementer atauRNA, molekul tersebut diatur dalam urutan acak. Beberapa asosiasi dengan AO diJ. stem yang fungs. Biomater. 2012, 3605polynucleotide beruntai tunggal, sehingga menimbulkan fluoresensi merah (max = 650 nm) [13,14]. [Poly-X: A-AMsilan] / SiO2 (5 mg) didispersikan dalam AO di PBS solusi (0,1-10 mg / mL) dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 1 jam.Partikel-partikel dipisahkan dengan sentrifugasi dan dicuci untuk memberikan neon-label [Poly-X: A-AMsilan] / SiO2 partikel ([AO: Poly-X: A-AM silan] / SiO2, Gambar 4c). Intensitas fluoresensi adalahdiukur dengan menggunakan mikroskop fluoresensi pada panjang gelombang 640 nm menggunakan metode yang dijelaskan dalambagian sebelumnya.Gambar 2. Skema Reaksi label fluoresensi setelah persiapan dua jenis silankopling pada SiO2 partikel. Gambar 3. Diagram alir menguraikan persiapan [AO: Poly-X: A-AM silan] / SiO2kompleks untuk analisis fluoresensi. Gambar 3.

Gambar 4. Skema ilustrasi pengujian interaksi antara nukleat beruntai tunggalasam terjebak dengan partikel silika dan senyawa neon. (a) Tahap nukleotidamenjebak pada aminoalkylated SiO2 partikel, (b) struktur cellstain-AO sebagai neonmajemuk; (c) dan tahap konjugasi cellstain-AO dengan asam nukleat beruntai tunggal.2.4. 2.4. Perhitungan Orbital Molekuler Permukaan Struktur Model Aminoalkylated SiO2,Polynucleotides dan Senyawa FluorescentOrbital molekul (MO) perhitungan untuk mendapatkan model struktur permukaan aminoalkylated SiO2,polynucleotides dan senyawa neon dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak komersial (MOPAC Vr.3,Fujitsu Co, Jepang) dengan metode PM3 [15]. A-AM silanol sebagai prekursor kopling dan Si4O4 (OH) 10klaster dikombinasikan dengan A-AM silanol sebagai model permukaan partikel SiO2 ditunjukkan pada Gambar 6a dan b,masing-masing (silikon dan oksigen atom ditunjukkan sebagai warna kuning dan merah).Geometri dari setiap molekul dioptimalkan, dan kemudian kelompok hidroksil dalam molekul masing-masing adalahterikat pada silika. Geometri dioptimalkan lagi untuk menghasilkan [A-AM silan] / SiO2 klaster.Simulasi FT-IR spektrum ditentukan dengan perhitungan getaran [A-AM silan] / SiO2 klastermenggunakan metode PM3. Polinukleotida terdiri dari tiga unit nucleobase dan cellstain-AOmolekul sebagai senyawa neon juga dihitung dengan metode yang dijelaskan di atas.3. hasil3.1. Struktur Kimia Aminoalkylated SiO2 PermukaanFT-IR spektrum permukaan SiO2 partikel setelah kopling aminosilan disajikan pada Gambar 5.Di sini, SiO2 partikel diobati dengan X-AM silan (n%) yang disingkat [X-AM silan (n%)] / SiO2. Gambar 5amenunjukkan spektrum FT-IR [A-AM silan (2%)] / SiO2. Puncak berlabel 1 dan 5 ditugaskan untuk-OH( = 3385-3418 cm-1) dan obligasi Si-O-Si ( = 1090-1120 cm-1) dalam SiO2. Puncak 2 dan 3 ditugaskan untuk-CH2-( = 2911-2929 cm-1) dan NH2 atau-CH2-NH2 obligasi ( = 1568-1634 cm-1), masing-masing. Gambar5b menunjukkan spektrum FT-IR [A-AM silan (40%)] / SiO2, yang berisi Puncak ditugaskan 4 sampai-CH2-obligasi ( = 1471 cm-1). Hasil ini menunjukkan bahwa A-AM silan telah diperkenalkan ke permukaanSiO2. Gambar 5c menunjukkan spektrum FT-IR [B-AM silan (2%)] / SiO2 untuk perbandingan. Dalam kasus ini, puncak3 hampir hilang karena tidak ada gugus amino di B-AM silan.Gambar 5. FT-IR spektrum permukaan SiO2 partikel mengikuti kopling amino-silan.SiO2 partikel diobati dengan X-AM silan (n%) yang disingkat [X-AM silan (n%)] / SiO2).(a) [A-AM silan (2%)] / SiO2; (b) [A-AM silan (40%)] / SiO2; (c) [B-AM silan (2%)] / SiO2.diukur dandihitung spektrum FT-IR disajikan pada Gambar 6, di mana spektrum diukur untuk[A-AM silan (40%)] / SiO2 (Gambar 6c) dibandingkan dengan spektrum simulasi untuk A-AM silanol (Gambar 6a)dan [A-AM silan] / SiO2 cluster (Gambar 6b).Enam puncak utama diperoleh dari perhitungan getaran untuk A-AM silanol, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6a.Peaks 2, 4, 6 dan 7 ditugaskan untuk-CH2-obligasi ( = 3022, 1376, 1160 dan 779 cm-1), sedangkan puncak 1 dan3 ditugaskan untuk-NH2 obligasi ( = 3.522 dan 1.670 cm-1). Kecuali untuk puncak 5, ini sesuai denganspektrum dihitung untuk [A-AM silan] / SiO2 klaster (Gambar 6b). Puncak 5 untuk cluster konsistendengan getaran obligasi Si-O-Si ( = 965 cm-1). Para wavenumbers dari puncak simulasi yang dekat denganmereka dalam spektrum FT-IR diukur untuk [A-AM silan (40%)] / SiO2 (Gambar 6c). dihitung Spektrum FT-IR disajikan FUNDS gambar 6, di mana Spektrum diukur untuk[A-AM silan (40%)] / SiO2 (gambar 6c) dibandingkan Artikel Baru Spektrum Simulasi untuk A-AM silanol (gambar 6a)Dan [A-AM silan] / SiO2 klaster (gambar 6b).Enam villa di puncak Utama diperoleh Bahasa Dari perhitungan getaran untuk A-AM silanol, seperti Yang ditunjukkan FUNDS gambar 6a.Peaks 2, 4, 6 dan 7 ditugaskan untuk-CH2-Obligasi ( = 3022, 1376, 1160 Dan 779 cm-1), sedangkan villa di puncak 1 dan3 ditugaskan untuk-NH2 Obligasi ( = 3,522 Dan 1.670 cm-1). Kecuali untuk villa di puncak 5, Suami Sesuai Artikel BaruSpektrum dihitung untuk [A-AM silan] / SiO2 klaster (gambar 6b). Puncak 5 untuk klaster KonsistenArtikel Baru getaran Obligasi Si-O-Si ( = 965 cm-1). Para wavenumbers Bahasa Dari villa di puncak Simulasi Yang Dekat Artikel BaruDalam, mereka Spektrum FT-IR diukur untuk [A-AM silan (40%)] / SiO2 (gambar 6c). Gambar 7 menunjukkan hubungan antara hasil perhitungan getaran untuk [A-AMsilan] / SiO2 klaster sebagai model molekul (Gambar 6b) dan data diukur untuk [A-AM silan(40%)] / SiO2 (Gambar 6c). Ada korelasi yang baik antara puncak simulasi dan terukur. sesuaidata dengan pendekatan linier memberikan koefisien korelasi 0,9948. Hal ini menunjukkan bahwastruktur rantai aminoalkyl pada permukaan SiO2 mirip dengan struktur diperkirakan untuk [A-AMsilan] / SiO2 klaster.Gambar 7. Hubungan antara hasil perhitungan getaran untuk Si4O4 (OH) 10 klasterdikombinasikan dengan A-AM silan (struktur yang diberikan pada Gambar 6b) dan diukur FT-IR spektrum[A-AM silan (40%)] / SiO2. 3.2. Orientasi Chains Aminoalkyl pada Permukaan SiO2Gambar 8 menunjukkan gambar mikroskop fluoresensi [B-AM silan (2%)] / SiO2 (Gambar 8a) dan [A-AMsilan (2%)] / SiO2 (Gambar 8b) setelah reaksi dengan FITC, dan model struktur permukaan dari keduapartikel ditunjukkan pada Gambar 8c dan d, masing-masing. Kelompok isothiocyanate di FITC bereaksi selektifdengan gugus amina primer, seperti yang terjadi di A-AM silan untuk membentuk ikatan antara kedua tioureakelompok fungsional.Gambar 8. Gambar mikroskop fluoresensi (a) [B-AM silan (2%)] / SiO2, dan (b) [A-AMsilan (2%)] / SiO2 setelah reaksi dengan FITC. Model struktur permukaan ditunjukkan dalam (c)dan (d), masing-masing.ituintensitas relatif fluoresensi [AO: Poly-G: A-AMsilan] / SiO2 adalah 45 untuk 1 mg / mL, 129 untuk 5 mg / mL dan 177 untuk 10 mg / mL. Ketika AO adalah terkonjugasi dengan[Poly-A: A-AM silan] / SiO2, intensitas fluoresensi [AO: Poly-A: A-AM silan] / SiO2 menurundibandingkan dengan [AO: Poly-G: A-AM silan] / SiO2 sampai 41 untuk 1 mg / mL, 81 untuk 5 mg / mL dan 144 untuk10 ug / mL. Dalam kasus Poli-C, intensitas fluoresensi [AO: Poly-C: A-AM silan] / SiO2 meningkatsangat sedikit dengan konsentrasi, menunjukkan intensitas 27 untuk 1 mg / mL, 43 untuk 5 mg / mL dan 54 untuk 10 mg / mL.Gambar 9. Hubungan antara konsentrasi AO dan intensitas fluoresensi[AO: Poly-X: A-AM silan] / SiO2 [Poly-X: (a) X = guanin, (b) adenin, (c) sitosin].

Sensitivitas intensitas fluoresensi, R, AO-berlabel [Poly-X: A-AM silan] / SiO2 konjugatdiringkas dalam Tabel 1. Sebagai perbandingan, R AO-berlabel Poli-X ([AO: Poly-X]) jugadiringkas dalam Tabel 1. R dihitung dengan menggunakan Persamaan (1):R = (FL10 - FL1) / (AO10 - AO1) (1)Tabel 1. Kepekaan untuk intensitas fluoresensi AO-label (a) [Poly-X: A-AM silan] /SiO2 partikel dan (b) polynucleotides. Dalam hal ini, AO10 dan AO1 adalah konsentrasi AO (mg / mL), sedangkan FL10 dan FL1 adalahintensitas fluoresensi ketika konsentrasi AO adalah 10 dan 1 mg / mL. Ituperbedaan kemampuan konjugasi sangat jelas ketika asam nukleat beruntai tunggal terjebak denganSiO2 aminoalkylated digunakan. R [Poly-X: A-AM silan] / SiO2 meningkat dalam urutanPoli-C