PRINSIP REKAYASA GENETIKA PADA TANAMAN

Suharsono- Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB

- Departemen Biologi, IPBE-mail: sony-sh@ipb.ac.id; sony@rcbio.org

Transformasi Tanaman dengan Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens:- gram negatif- fitopatogen- mentransformasi sel tanaman tumor

Tumor:transfer, integrasi dan ekspresi gen yang terdapat di T-DNA ke dalam genom sel tanaman

Proses pembentukan tumor

Tanaman luka acetosyringone,hydroxyacetosyringone induksi gen vir

Vir: •25 gen di dalam 7 operon•di luar T-DNA•fungsi: transfer & integrasi T-DNA di genom tanaman

Plasmid TiT-DNA1. iaaM (tms1)2. iaaH (tms2) 3. tmr (ipt)4. gen-gen penyandi opine •diekspresikan setelah terintegrasi ke genom tanaman•ditransfer dalam bentuk utas tunggal linier, ujung 5’membawa RB dan ujung 3’ LB

sekuen spesifik RB: 25 pb

Sintesis auxin dan sitokinine

trp 2-monooxygenase

iaaM (tms1)

i-3-a hydrolase

iaaH (tms2)

isopentenyl transferase

tmr (ipt)

isopentenyl adenosine monophosphate

isopentenyl diphosphate

Opine

• Sumber N dan C bagi A.tumefaciens

• Beberapa jenis• Tidak bermanfaat bagi

tanaman

Kendala pemanfaatan pTi alami

1. Sel tidak dapat diregenerasigen fitohormon harus dibuang

2. Regenerasi sel terhambat karena N, dan Cdigunakan untuk membentuk opine

gen opine harus dibuang3. Ukuran pTi terlalu besar

segmen DNA yang tidak penting harus dibuang4. Tidak dapat melakukan replikasi di E. coli

Ori dari E. coli harus disisipkan ke pTi

Vektor derivatif dari pTi

Mengandung1. gen penanda seleksi (hpt, npt)2. Ori di E. coli (kadang: + Ori di A. t)3. RB dari T-DNA (sering: + LB)4. Situs pengklonan (MCS)

Vektor ekspresi pTi-tidak mempunyai vir1. Vektor biner2. vektor kointegrasi

1. Vektor biner•Ori E. coli, A.t•Tidak ada vir•A.t resipien:-disarmed pTi: tidak ada T-DNA,ada vir

2. Vektor kointegrasiRekombinasi vektor pengklonan + disarmed pTi vektor (vir, T-DNA)

Vektor ekspresi pTi

Transfer gen dengan A. tumefaciens

Metode fisik untuk mentransfer gen ke tanaman

Tanaman yang telah ditransformasi secara genetik

Biolistik

•partikel diselimuti DNA+ CaCl, spermidine/PEG•efisiensi: DNA linier>sirkuler; besar<kecil (plasmid besar terfragmentasi YAC)

Tanaman transgenik menggunakan biolistik

Biolistik dengan YAC

GOI= 150 kb (beberapa gen) dapat diintegrasikan ke genom tanaman

GEN REPORTER• menyeleksi sel yang tertransformasi• kuantifikasi ekspresi gen2 macam:• gen penanda seleksi dominan• gen yang produknya dapat dideteksi:

#β-D-glucuronidase:*5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronideacid biru*4-methylumbelliferyl β-D-glucuronidefluorescent (fluorometer)

#GFP (green fluorescent protein): penanda in vivo; sinar UV atau biru (tanpa substrat) fluorescent hijau (tanaman tipe liar fluorescent merah keunguan)

Gen reporter dan penanda seleksi di tanaman

Manipulasi ekspresi gen di tanaman

•Pilih PromoterPromoter 35S CaMV: konstitutif kuat, di seluruh jaringan, sepanjang hidupPromoter SSU rubisco: aktif di daun (jaringan fotosintetik)Pathogenesis-related promoter

Faktor penentu tingkat ekspresi lainnya•enhancer: terletak di hulu promoter (1-ratusan bp)•intron: stabilitas mRNA•terminator

Perbandingan promoter 35S dengan promoter komposit

Promoter komposit: p35S+7 enhancer+ Ω TMV+tnosGen reporter: β-glucuronase

Produksi protein di kloroplast/mitokondria

Strategi:•Gen penyandi fusi protein sasaran+peptida signal inti sel•Gen penyandi protein sasaran kloroplast/mitokondria

Sel daun: 50-100 kloroplast @ 10-100 kopi DNAinsersi gen di kloroplast produksi protein > insersi di kromosomCara: GOI+marker diapit oleh sekuen DNA kloroplast microprojectile bombardment. Rekombinasi GOI terintegrasi ke genom kloroplat

Sekresi protein

Produksi protein di tanaman mahaluntuk purifikasi (90%)Tanaman sebagai bioreaktor eksudasi protein

lewat (apoplast) akar

APLIKASI REKAYASA GENETIKA TANAMAN

Tujuan utama bioteknologi tanaman: merakit kultivar baru

Perakitan tanaman resisten terhadap seranggaStrategi:•insektisidal protoksin oleh Bacillus thuringiensis•inhibitor α-amilase•inhibitor protease•lektin

Contoh sifat yang diperbaiki

Kapas-BtKapas biasa

Ulat menyerang tongkol jagung Penggerek batang

BtNon Bt

Kapas

Pepaya resisten Vs peka Ring Spot Virus

Meningkatkan ekspresi

•memotong gen (tersisa N-terminal yang mengandung toksin)

•menggunakan promoter kuat

Perbandingan aa protoksin dari berbagai strain B.t:98% ujung N terkonservasi; ujung C bervariasiaktivitas: 646 aa pertama dari ujung N (protoxin: 1156 aa)

Gen protoxin yang dipotong tomat

Ekspresi toxin Bt

Manduca sextaHeliothis zeaKeiferia lycopersicella

Usaha menaikkan ekspresi protoksin

1.Mutagenesis situs terarah: mengubah sekuen yang menghambat transkripsi dan translasi 95.6% smdg WT 10 x produk WT

2.Modifikasi sekuen sintesis secara kimia kodon yang biasa di tanaman 78.9% smdg WT

100 x produk WT3.Menggunakan promoter SSU rubisco + peptida

transit + sekuen termodifikasi over produksi di kloroplast produk sangat tinggi (1% protein daun)

4. Introduksi gen protoksin ke kloroplast 2-3% protein daun

Keuntungan ekspresi protoksin di kloroplast

1. Jumlah kloroplast tiap sel banyak multi kopi gen protoksin produk tinggi

2. Tidak ada resiko penyebaran gen ke lingkungannya melalui polen

Kerugian:Serangga dapat menyerang akar, buah, bunga, batang yang tidak mempunyai kloroplast

Ekspresi gen penyandi protoksin B. thuringiensis di tanaman

Strategi lain mencegah serangan serangga

- Cowpea trypsin inhibitor•menghambat H. virescens

- Potato proteinase inhibitor II•penggerek batang merah muda (Sesamia inferens)

- Inhibitor α-amylase•kumbang Callosobruchus maculatus, C. chinensis

-Cholesterol oxidase•Anthonomus grandis grandis (coleoptera)

-Lektin-Tryptophan decarboxylase•kupu putih (Bemisia tabaci)

-Avidin

Strategi lainnya untuk mencegah serangan serangga

Pencegahan resistensi serangga terhadap B.t

B.t. sebagai agen seleksi serangga resisten Cara pencegahan:•Ekspresi protoksin Bt dibatasi pada waktu singkat

promoter PR-1a Bt diinduksi oleh pathogen atau asam salisilat atau asam poliakrilat•Fusi 2 gen toksin protein toksin hibrid•Kombinasi: Bt + insektisida lain (inhibitor α-amilase)•Kombinasi: Bt + insektisida kimiawi dosis rendah•Strategi pengungsian (refuge). 20% area non-Bt. Serangga yang tahan di area Bt (80%) jumlahnyasedikit (99.9% mati) kawin dengan serangga sensitif di area 20% non-Bt dilusi ketahanan

Tanaman resisten terhadap virus

Resistensi alami:•mencegah transmisi virus•mencegah terbentuknya virus•mengatasi gejala virus

Proteksi dengan protein mantel virus

Ekspresi protein mantel

Tanaman transgenik:•mengekspresikan protein mantel (RNA sense) resisten•dengan antisense resisten pada dosis virus rendah

Resistensi terhadap banyak virusProtein mantel CuMV, Zucchini yellow mosaic virus, WMV2 Cucurbita pepo resisten terhadap ketiga virus

Tanaman resisten terhadap herbisida

Tanaman resisten herbisida:1. Menghambat penyerapan herbisida2. Produksi protein sasaran herbisida secara

berlebihan protein aktif masih ada 3. Mengurangi kemampuan protein sasaran

mengikat herbisida4. Menginaktivasi herbisida melalui metabolisme2-4: melalui perakitan tanaman transgenik

EPSPS (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) aa aromatik; sasaran glyphosateEPSPS mutan E. coli tanaman tanaman resisten terhadap glyphosate

Perakitan tanaman resisten terhadap herbisida

•Nitrilase (dari Klebsiella ozaenae) menginaktivasi herbisida bromoxynile tanaman resisten•Herbisida bromoxynil (3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile) menghambat fotosintesis

Resisten herbisida bromoxynil

Tanaman resisten terhadap fungi dan bakteriekspresi pathogenesis-related (PR) protein:

β-1,3-glukanase, chitinase, thaumatin-like protein, protease inhibitor, asam salisilat

•chitinase menghidrolisis β-1,4 dari chitin N-acetyl-D-glucosamine (dinding sel fungi)

Ekspresi asam salisilat di tanaman•Resisten terhadap fungi dan bakteri•Cara: Ekspresi gen penyandi enzim isochorismate synthase dan isochorismate lyase

Tanaman toleran terhadap cekaman dan senesen

Ekspresi SOD:•tahan panas, herbisida methyl viologen (paraquat), layu (bunga potong)

Ekspresi glutation peroksidase (-s-transferase):•tahan garam, beku

Toleran terhadap cekaman garam/kering

•perlu osmoprotectant: gula, alkohol, prolin, trehalose, D-ononitol, mannitol, sorbitol, glisin betain, 3-methylsulfoniopropionate

•ekspresi choline dehydrogenase (betA) betain

Penundaan buah masak dan bunga layuBuah masak:•ekspresi polygalacturonase dan cellulase•diinduksi

dihambat: masak buah tertunda (layu bunga, gugur daun tertunda)

Bagaimana menghambat ekspresi?•RNA antisense thd gen penyandi•mengalihkan jalur sintesis

Mengalihkan jalur sintesis etilenuntuk menghambat sintesis etilen

Degradasi ACC sintesis etilen dihambat

Manipulasi genetik pigmentasi bunga

Antosianin (flavonoid) pigmen bungaChrysanthemum + cDNA CHS sense/antisense bunga putih

Astaxanthin:•pink (salmon, udang)•dari bakteri & mikroalga•mencegah telur rusak karena UV•meningkatkan daya hidup & laju tumbuh antioksidan

Produksi astaxanthin:-ekspresi cDNA β-caroten ketolase (β-C-4 oxygenase) alga hijau (Haematococcus pluvialis)

Modifikasi kandungan nutrisi tanaman

memperbaiki:-kualitas nutrisi: jagung, kacang polong (kandungan aa di biji)-komposisi asam lemak dari tanaman penghasil minyak-rasa buah dan sayuran

Meningkatkan kandungan lisin

Over produksi lisin: menghentikan feedback inhibition oleh aspartokinase & dihydrodipicolinic acid synthase

ekspresi gen DHDPS lysin-feedback-insensitive dari Corynebacterium & AK lysin-feedback-insensitive dari E. colidikendalikan promoter biji biji mengandung 2-5 x lisin

Kandungan lipid

Kanola transgenik: antisense gen stearate desaturase dari Brasicca akumulasi asam stearat(tidak menjadi asam oleat)

Mengganggu RNA tanamanModifikasi fenotipe: downregulation dari ekspresi gen menghambat mRNACara:•ekspresi kopi tambahan (cosuppression)•ekspresi antisens•ribozim molekul kecil RNA endoribonuklease spesifik

stearoyl-ACP 9 desaturase: asam stearat asam oleat;stearat meningkat margarin dan minyak goreng

+ ribozim: asam oleat dihambat akumulasi asam stearat

Vitamin AMamalia: β-carotene (provitamin A) vitamin Aβ-carotene: pigmen karotenoid pada membran tanaman fotosintetik

Ekspresi β-carotene di beras via A. t:1: Phytoene synthase (psy) (pglutellin) & phytoene desaturase (crt) (p35S) tanpa smg + peptidatransit plastid2: Lycopene b-cyclase (lcy) (pglutellin) + peptida transit plastid1+2 padi beras mengandung β-carotene shg berwarna kuning/emas

golden rice

Modifikasi rasa dan tampilan tanaman

Polifenol oksidase: oksidasi monofenol/o-difenol o-quinon perubahan warna buah/sayuran

Perubahan warna dihambat dengan menghambat sintesis polifenol oksidase

Kentang:antisense polifenol oksidase +p35S/pGBSS

resisten thd black spotSense polifenol oksidase tidak tahan

(Granule-bound starch synthase)

Mencegah perubahan warna

PemanisMonellin: -Dioscoreophyllum cumminsii-3000 x lebih manis darpd sukrosa-Dimer: rantai A 45 aa, B 50 aa dengan ikatan lemah nonkovalen-Rusak oleh: panas, asam

Pemanis rendah kalori

Kandungan pati

Kentang: 20-30 amilosa (rantai lurus); 70-80% amilopektin (rantai bercabang) rasio keduanya: perubahan sifat fisik & kimia pati

Amilosa: ikatan α-1,4

Amilopektin: ikatan α-1,4 dan α-1,6

Biosintesis pati

Glukan+glukan α-1,6 amilopektin

p35S + antisense startch branching enzyme amilosa naik: 28% 60-80%

Tanaman sebagai bioreaktor

Produksi agen terapetik di tanaman transgenik (skala lab)

Antibodi

Keunggulan tanaman drpd bakteri: integrasi DNA di genom tanaman lebih stabil, protein mengalami pemrosesan spt di sel hewan, lebih murah (produksi antobodi per gram di sel hibridoma: $ 5000, bakteri: $ 1000, tanaman: $ 10-100), dapat disimpan di biji shg tahan lama pada suhu ruang

Produksi biopolimer

Biosintesis poly (3-hydroxybutyric acid) dari acetyl-CoA Alcaligenes eutrophus

Acetyl Co-A Acetoacetyl Co-A D-3-Hydroxybutyryl co-A PHA

Acetoacetyl Co-A reductase Poly(3-hydroxybutyric acid) synthase3-ketothiolase

PHA: bioplastik, di A. eutrophus 1 operon tidak dikenal tanaman ekspresi 3 gen terpisah: A. thaliana target ke kloroplast@ gen + peptida transit di kloroplast ssu rubisco + p35S pTi biner1 x 2 tanaman (1+2) x 3 tanaman (1+2+3) 1 mg /g daun segar PHA

Mengubah kandungan ligninLignin:tinggi mutu pulp dan hijauan pakan rendahrendah: antisense 4-Coumarate:coenzyme A ligase

PERKEMBANGAN REKAYASA GENETIKA TANAMAN

• Adopsi tanaman transgenik pesat– 1996: 2.8 jt ha (AS, Kanada, Argentina,

Brasil, Afsel, China) 2003: 67.7 jt ha (18 negara)

– 4 komoditas penting: kedelai, jagung, kapas, kanola

– 2 sifat: resisten herbisida, resisten hama(penggerek)

• 2006: + negara, + komoditas (pepaya, padi, alfalfa, labu), + sifat (toleran virus

Tahun Jumlah negara Luas (juta ha)1996 6 1.71997 8 11.01998 8 27.81999 14 39.92000 13 44.22001 13 52.62002 16 58.72003 18 67.72004 20 81.02005 21 90.02006 22 102.0

Jumlah negara dan luas tanaman transgenik(James 1996-2006)

Melibatkan > 10 jt petani (90% petani kecil)

No Crop 2002 (%)

2005 (million ha) % 2006

(million ha) %

1 Soybean 62

21

12

5

-

-

-

100

54.4 50 58.6 57

2 Maize 21.2 24 25.2 25

3 Cotton 9.8 11 13.4 13

4 Canola 4.6 5 4.8 5

5 Alfalfa - - <0.1 <1

6 Rice <0.1 <1 <0.1 <1

7 Others <0.1 <1 <0.1 <1

TOTAL 90.0 100 102.0 100

Luas tanaman transgenik di dunia, berdasarkan jenis tanaman

No Trait 2005 (million ha) % 2006

(million ha) %

1 Herbicide Tolerance (HT) 63.7 71 69.9 68

2 Insect Resistance (Bt) 16.2 18 19.0 19

3 Bt/HT 10.1 11 13.1 13

4 Virus Resistance <0.1 <1 <0.1 <1

TOTAL 90.0 100 102.0 100

James 2006

Luas tanaman transgenik dunia, berdasarkan sifat