RAPD

Identifikasi sidik jari DNA Colocasia esculenta L. Schott 107

Identifikasi Sidik Jari DNA Talas (Colocasia esculenta L. Schott)Indonesia dengan Teknik RAPD

(Random Amplified Polymorphic DNA):Skrining Primer dan Optimalisasi Kondisi PCR

Titik K Prana, N Sri Hartati

Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, Cibinong 16911

Diterima 18-02-2003 Disetujui 29-03-2003

ABSTRACTDNA finger printing technique has been widely used in the analysis of genetic variability of both plants andanimals. One of the techniques that can be used to obtain DNA finger print is RAPD (Random Amplified PolymorphicDNA) technique, a molecular technique based on PCR technology. The quality of amplification products dependon several factors, such as MgCl2 and DNA concentrations, primer and PCR condition. In this study, an experimentwas conducted to find out appropriate PCR condition to amplify taro DNA using random primers. Three PCRconditions have been tested and one of them successfully amplified taro DNA with good results. Of the 12primers tested, 9 of them (OPB-01, OPB-04, OPB-05, OPB-06, OPB-07, OPB-10, OPB-15, OPB-16, and OPB-20)were able to produce amplification products. Primers OPB-01, OPB-04, OPB-05, OPB-06, OPB-07, OPB-15, andOPB-20 produced polymorphism bands on some of the samples studied. The results therefore indicate that thetechnique can be used to evaluate genetic variability of taro at molecular levels and identify additional markers inselection and breeding of the crop.

Keywords: Colocasia esculenta, DNA finger print, RAPD

PENDAHULUANIdentifikasi sidik jari DNA banyak dimanfaatkan

dalam analisis keragaman genetik tanaman. Berbagaiteknik molekular telah dikembangkan baik teknik yangberdasarkan PCR maupun non-PCR. Salah satuteknik yang memanfaatkan kerja PCR adalah denganmenggunakan arbitrary primer atau yang lebih dikenaldengan teknik RAPD (Random Amplified PolymorphicDNA). Teknik ini cukup sederhana dan dapatdikerjakan dalam waktu relatif singkat dibandingteknik molekular lainnya. RAPD telah banyakdigunakan dalam analisis keragaman berbagai jenistanaman seperti Shorea laevis (Siregar et al, 1998),Pinus radiata (Stange et al, 1998), bunga lili(Purwantoro et al, 1999) dan padi (Ishak & Ita 1999).

Selain mempunyai keuntungan dalam segi teknisyaitu relatif sederhana, kuantitas DNA yangdibutuhkan hanya sedikit (dibutuhkan 5-25 ng DNAdalam setiap reaksi PCR) bahkan hingga 1,5 ng DNA(Pandey et al, 1996). Teknik ini mampu menyajikanhasil dalam waktu yang relatif singkat karena setelahproses amplifikasi DNA hasil dapat segeradivisualisasi. Kemungkinan karakter yang muncul bisasangat banyak tergantung kepada jumlah primer yangdigunakan. Kelemahan teknik RAPD adalah tingkatkeberulangannya (reproducibility) yang rendah.

Walaupun demikian dapat diatasi dengan konsistensikondisi PCR.

Walaupun karakter yang dihasilkan melaluipenggunaan primer RAPD bisa sangat banyak,namun dalam menentukan jenis primer (sekuenprimer) dan kondisi PCR yang sesuai (dapat anneal)untuk menghasilkan produk amplifikasi yangmaksimum perlu dilakukan penelitian tersendiri. Untuktujuan analisis keragaman, hal penting lainnya adalahpemilihan primer yang dapat menampilkanpolimorfisme pita-pita DNA diantara individu yangdiuji. Kualitas pita DNA yang tajam juga penting untukmemudahkan interpretasi dan keakuratan data.Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi kualitaspita DNA produk amplifikasi PCR dalam analisisRAPD adalah konsentrasi MgCl2, konsentrasi DNA,konsentrasi enzim polimerase, primer dan suhu siklusPCR terutama suhu annealing.

Talas merupakan salah satu komoditi pangannon beras yang sangat menarik untuk diteliti aspekkeragamannya. Berdasarkan hasil pengamatan Lebot& Aradhya (1991), keragaman talas di Indonesiasangat tinggi, baik ditinjau dari segi morfologi maupunberdasarkan pola isozim. Pernyataan ini didukungoleh hasil penelitian yang dilakukan oleh Prana, etal, (1999). Selain pengamatan dari segi morfologi dan

Jurnal Natur Indonesia 5(2): 107-112 (2003)ISSN 1410-9379

108 Jurnal Natur Indonesia 5(2): 107-112 (2003) Prana, et al.

pola pita isozim, karakterisasi pada tingkat molekular(DNA) penting dilakukan untuk memperoleh data yanglebih komprehensif, sehingga dapat digunakan untukkepentingan lebih lanjut sebagai marka pembantuseleksi maupun pemetaan gen yang dapat bergunauntuk mencari keterpautan dengan sifat tertentu.

Penelitian ini bertujuan untuk memperolehkondisi optimum PCR untuk amplifikasi DNA genomtalas yang dikoleksi dari beberapa daerah diIndonesia. Percobaan yang dilakukan meliputipengamatan pengaruh perbedaan kondisi PCR,pemilihan serta penentuan kuantitas primer.

BAHAN DAN METODAPucuk daun talas yang dikoleksi dari berbagai

daerah di Indonesia dan ditanam di kebun koleksitalas Puslit Bioteknologi-LIPI digunakan sebagaibahan tanaman untuk ekstraksi DNA.

Ekstraksi DNA dilakukan dengan mengikutimetoda ekstraksi CTAB (Gillies et al, 1997). Potonganpucuk daun talas ditempatkan dalam tabung mikro1,5 ml dan dicelupkan direndam dalam nitrogen cairdan selanjutnya digerus hingga lembut menggunakanpenggerus khusus. Bufer pengekstrak (100 mM Tris-HCl pH 8,0; 20 mM Na2EDTA; 1,4 M NaCl; 2% CTAB,β-merkaptoetanol) sebanyak 100 µl ditambahkan kedalam tabung mikro dan diinkubasi pada 650C selama30 menit. Selanjutnya didinginkan pada suhu ruangdan ditambahkan 200 µl wet chloroform yang terdiridari kloroform: 1-oktanol (24:1). Campuran dibolak-balik perlahan dan disentrifugasi pada 12.000 rpmselama 2 menit. Lapisan bagian atas dipisahkan danditambah dengan 500 µl wet chloroform danselanjutnya disentrifugasi kembali pada 12.000 rpmselama 2 menit. DNA diendapkan denganmenambahkan 600 µl isopropanol dan dibiarkan padasuhu ruang selama 20 menit. Selanjutnyadisentrifugasi pada 12.000 rpm selama 2 menit danpelet yang diperoleh dikering udarakan selama 15-20 menit. DNA dilarutkan dalam 100 µl bufer TE (10mM Tris-HCl pH 7,6 dan 1 mM EDTA) dan disimpanpada –200C hingga digunakan.

Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan 12jenis primer randon (OPERON TECHNOLOGIES), 2konsentrasi primer dan 3 kondisi PCR. Komposisireaksi PCR terdiri dari 2,5 mM PCR bufer, 2 mMMgCl2, 2,5 mM dNTP, 2 ρmol dan 3,2 ρmol primerdan 96 ng–318 ng DNA. Reaksi PCR dilakukan padaGeneAmp PCR system 2400 (PERKIN ELMER). 12

jenis primer yang digunakan adalah OPB-01(GTTTCGCTCC), OPB-02 (TGTATCCCTGG), OPB-04 (GGACTGGAGT), OPB-05 (TCAGCGAGGT),OPB-06 (TGCTCTGCGC), OPB-07(GGTGACGCAG), OPB-10 (CTGCTGGGAC), OPB-15 (GGAGGGTGTT), OPB-16 (TTTGCCCGGA),OPB-20 (GGACCCTTAC), OPE-5 (TCAGCGAGGT)dan OPE-10 (CACCAGGTGA). Produk amplifikasidipisahkan dengan elektroforesis pada 1,5% gelagarose menggunakan bufer TAE 1X . Visualisasi pitaDNA dilakukan dengan merendam gel pada larutanetidium bromida dan diamati di atas UV transiluinator.

Kondisi PCR: 1) kondisi I (Irwin et al, 1998) 940C,1 menit (pra-PCR); 940C, 1 menit (denaturasi); 350C,1 menit (pelekatan); 720C, 2 menit (pemanjangan)sebanyak 45 siklus; 720C, 5 menit (pasca PCR), 2)Kondisi II (Siregar et al, 1998) 940C, 3 menit (pra-PCR); 940C, 30 detik (denaturasi); 360C, 45 detik(pelekatan); 720C, 2 menit (pemanjangan) sebanyak45 siklus; 720C, 4 menit (pasca PCR), 3) Kondisi III(Sudarmonowati & Hartati 1997) 940C, 5 menit (pra-PCR); 940C, 1 menit (denaturasi); 350C, 3 menit(pelekatan); 720C, 2 menit (pemanjangan) sebanyak35 siklus; 720C, 7 menit (pasca PCR).

dapat mengganggu reaksi PCR seperti polisakaridadan metabolit sekunder.

Keberadaan polisakarida dan senyawa metabolitsekunder dalam sel tanaman sering menyulitkandalam isolasi asam nukleat. Struktur polisakaridayang mirip dengan asam nukleat menyebabkanpolisakarida dapat mengendap bersama asamnukleat. Penambahan senyawa pereduksi seperti β-mercaptoethanol dan dithiothreitol (DTT) dapatmencegah oksidasi senyawa fenolik sehinggamenghambat aktifitas radikal bebas yang dihasilkanoleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat (Wilkins

HASIL DAN PEMBAHASANEkstraksi DNA. Salah satu keuntungan analisis

keragaman menggunakan teknik molekuler yangmemanfaatkan teknologi PCR adalah kuantitas DNAyang dibutuhkan hanya sedikit, bahkan dapatmengamplifikasi DNA tanaman Spinacia oleracea L.dengan jumlah 1,5 ng (Pandey et al, 1996), Selainitu, untuk teknik RAPD tingkat kemurnian DNA yangdibutuhkanpun tidak perlu terlalu tinggi atau dengankata lain teknik ini toleran terhadap tingkat kemurnianDNA. Walaupun demikian dibutuhkan prosedur untukmeminimalkan senyawa-senyawa kontaminan yang


& Smart 1996). Metabolit sekunder dan polisakaridajuga dapat menghambat kerja enzim. Adanyapolisakarida dalam tanaman ditandai dengankekentalan pada hasil isolasi DNA yang menyebabkankesulitan dalam pekerjaan pemipetan DNA, dan DNAtidak dapat diamplifikasi dalam reaksi PCR akibatpenghambatan aktivitas Taq polymerase (Fang et al,1992 dalam Porebski et al, 1997).

Pada proses ekstraksi DNA talas, setelahpenambahan bufer pengekstrak CTAB pada daunyang telah dihaluskan, terbentuk larutan yang sangatkental, yang menunjukkan tingginya kandunganpolisakarida. Selain polisakarida, kandungansenyawa fenolik dalam daun talas juga cukup tinggi.Hal ini dapat dilihat dari cepatnya pencoklatan padaujung pucuk daun talas yang dipotong. Pandey et al,(1996) mengamati pengaruh penghambatanpolisakarida netral (arabinogalaktan, dekstran, gumguar, gum locust bean, inulin, manan dan pati) danpolisakarida asam (karagenan, dekstran sulfat, gumghatti, pektin dan silan) dengan perbandingantertentu, yaitu 2.000 ng polisakarida 1,5 ng DNA,terhadap amplifikasi DNA bayam dengan teknikRAPD. Hasil percobaan menunjukkan bahwapolisakarida netral tidak menghambat reaksiamplifikasi DNA, sedangkan polisakarida asammenyebabkan DNA tidak dapat diamplifikasi(menghambat secara total).

Pada umumnya ekstraksi DNA dilakukan denganmenggunakan bufer pengekstrak SDS (sodiumdodecyl sulphate) dan bufer pengekstrak CTAB(cetyltrimetilammonium bromide). Perlakuan lisis seldengan deterjen non ionik CTAB menghasilkankuantitas DNA yang cukup tinggi terutama darijaringan segar dengan jumlah DNA yang dihasilkanbervariasi tergantung kepada spesies dan kondisiawal material yang digunakan (Ausubel et al, 1994).Pada tanaman dengan kandungan poliskarida danmetabolit sekunder tinggi perlu dilakukan modifikasipada saat ekstraksi DNA menggunakan bufer CTAB.Untuk menghilangkan polisakarida, ekstraksi lisatdengan kloroform/oktanol disarankan dibandingkloroform/isoamilalkohol karena lebih efisien untukmengisolasi asam nukleat (Ausubel et al, 1994).Ekstraksi lisat dengan kloroform/oktanol jugadilakukan pada protokol ekstraksi DNA tanamanFragaria yang mengandung komponen polisakaridadan polifenol tinggi dengan bufer ekstraksi CTAB(Porebski et al, 1997), Cedrella odorata (Gillies et al,

1997) dan Shorea parvifolia (Sudarmonowati & Hartati1997). Hasil amplifikasi DNA yang diperoleh denganmetoda ini sangat baik.

Hasil isolasi DNA talas yang dilakukan denganbufer ekstraksi CTAB menghasilkan DNA dengankualitas cukup baik. DNA hasil isolasi yang dilarutkandalam air tidak kental yang menunjukkanberkurangnya kandungan polisakarida. Adanyamerkaptoetanol dalam bufer ekstraksi juga dapatmenghambat oksidasi fenolik yang menggangguekstraksi DNA. Kuantitas DNA yang dihasilkanberkisar antara 8,75-183,75 µg/g sampel daun talas.Jumlah ini cukup tinggi jika dibandingkan dengankuantitas rata-rata DNA yang dihasilkan dari daunbeberapa spesies strawberi yang juga memilikikandungan polisakarida dan polifenol tinggi, yaituFragaria vesca (20 µg/g), F. multicipita (30 µg/g),F.virginiana Gaspe (20 µg/g), F. virginiana Petawa(84 µg/g), F. chiloensis V.I. (71 µg/g), F. chiloensisB.C. (52 µg/g), F. ananassa wild (32 µg/g) dan F.ananassa cultivated (28 µg/g) dengan metoda isolasiDNA yang dilakukan oleh Porebski et al, (1997).

Optimalisasi amplifikasi DNA genom talasmelalui PCR. Keberhasilan amplifikasi DNA genommenggunakan teknik RAPD selain ditentukan olehurutan basa primer yang digunakan serta kuantitasnya(kandungan primer dalam setiap reaksi), ditentukanpula oleh kesesuaian kondisi PCR yang meliputi suhuannealing primer dan ekstensi. Pada penelitian initelah dicoba beberapa jenis primer dan dibandingkanperbedaan kuantitasnya serta percobaan tiga kondisiPCR.

Penggunaan primer (OPB-01, OPB-05, OPB-06,OPE-05, OPE-10, OPB-02) dengan jumlah 2 ρmolpada kondisi PCR I hampir seluruhnya tidakmenghasilkan produk amplifikasi untuk semua sampelyang dicoba, kecuali primer OPB-06 untuk No. koleksi109 yang menghasilkan 1 pita (Tabel 1). Peningkatankuantitas primer (OPB-01, OPB-05, OPB-06, OPB-04, OPB-10, OPB-16) dalam reaksi PCR menjadi 3,2pmol (3,2 µM) dengan kondisi PCR 1 menghasilkanproduk amplifikasi DNA yang dapat dilihat dalamjumlah pita maksimum (Tabel 1). Jumlah (konsentrasi)optimum dari primer random untuk amplifikasi DNApada beberapa tanaman bervariasi, bergantungkepada jenis primer dan jenis tanamannya. Penelitianterhadap tanaman Pinus radiata membutuhkan primersebanyak 22 ρmol setiap reaksi untuk mendapatkanhasil amplifikasi DNA yang optimum (Stange et al,


1998), sedangkan untuk tanaman spruce dibutuhkanprimer dengan konsentrasi yang cukup tinggi, yaitu0.5 mM (Nkongolo et al, 1998). Pada penelitian inikonsentrasi primer yang dibutuhkan untukmendapatkan hasil pita yang optimum adalah 3,2ρmol.

Pengaruh kondisi PCR yang lain (Kondisi II danIII) dengan jumlah primer yang berbeda tampak padaTabel 1 dan 2. Jika dibandingkan antara kondisi PCRI dan II, penggunaan kondisi PCR I memberikan hasilyang lebih baik. Walaupun pada kondisi II sampelyang diuji tidak sebanyak untuk kondisi I (hanya pada3 nomor koleksi saja yaitu No. 34, 50 dan 109),nampak bahwa pita yang dihasilkan untuk No. koleksi50 (primer OPB-10) lebih banyak denganmenggunakan kondisi PCR I (4 pita), sedangkankondisi PCR II adalah 3 pita.

Penggunaan kondisi PCR III memberikan hasilyang lebih baik dibandingkan kondisi PCR I dalamhal jumlah pita DNA hasil amplifikasi. Sebagai contohadalah pada no koleksi 109, jumlah pita yangdihasilkan pada kondisi PCR I dengan primer OPB-01 dan OPB-05 berturut-turut adalah 2 dan 4 pita,sedangkan dengan kondisi PCR III menghasilkan pitasebanyak 8 dan 5 pita (Tabel 1 dan 2). Demikian jugauntuk No. koleksi lainnya, penggunaan kondisi PCRIII menampilkan jumlah pita hasil amplifikasi yanglebih banyak.

Perbedaan kualitas hasil amplifikasi selain dilihatberdasarkan jumlah pita yang dapat diidentifikasi, jugadapat dilihat berdasarkan resolusi fragmen DNA yang

Kondisi PCR

Sampel /No.

Koleksi

Primer Jumlah / konsentrasi primer

Jumlah pita maksimum

50 109 50 7 23 25 34 36 40 49 56 62 66

109 199

OPB-01 OPB-01 OPB-01 OPB-01 OPB-01 OPB-01 OPB-01 OPB-01 OPB-01 OPB-01 OPB-01 OPB-01 OPB-01 OPB-01 OPB-01

2 pmol 3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM

3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM

- - 4 3 4 2 4 2 2 3 - - 4 2 2

50 50

109 109 199

OPB-05 OPB-05 OPB-05 OPB-05 OPB-05

2 mol 3,2 mol / 3,2 µM

2 mol 3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM

S 5 - 4 1

Kondisi I

50 50

109 109 199

OPB-06 OPB-06 OPB-06 OPB-06 OPB-06

2 mol 3,2 mol / 3,2 µM

2 mol 3,2 mol / 3,2 µM

2 mol

- 2 1 1 1

50 109

OPE-05 OPE-05

2 mol 2 mol

S S

50 109 199

OPE-10 OPE-10 OPE-10

2 mol 2 mol 2 mol

S - -

50 109 199

OPB-02 OPB-02 OPB-02

2 mol 2 mol 2 mol

- - -

50 109 199


3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM

5 - 1

50 109 139


3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM

4 - 4

50 OPB-16 3,2 mol / 3,2 µM 1

Kondisi

II

34 50

109


3,2 mol / 3,2 µM 3,2 mol / 3,2 µM

3,2 mol / 3,2 µM

- 3 -

50 OPB-20 3,2 mol / 3,2 µM -

-: tidak ada hasil amplifikasi.

Tabel 1. Jumlah pita DNA maksimum hasil amplifikasi PCR menggunakan primer OPB-01, OPB-05, OPB-06, OPE-05, OPE-10, OPB-02, OPB-04, OPB-10, OPB-16 pada kondisi PCR I dan kondisi PCR II.

Tabel 2. Jumlah pita DNA maksimum hasil amplifikasi PCR menggunakan primer OPB-01, OPB-05, OPB-07, OPB-15, OPB-20 konsentrasi 3,2 µM pada kondisi PCR III.

Primer / jumlah pita maksimum Sampel /No.

koleksi OPB-01

PB-05

OPB-07

OPB-10

OPB-15

OPB-20

25 106 109 199 23 36 40 62

140 56 7 50

208 49

234 203 34

424 111

10 9 8 5 2

11

2 3 5 6 6 7 4 8 5 1 3 3 6 4 7 7 4 6 6

11 6 8 11 9 3 12 7 7 10 9 6 12 13 10 7 7 11 2

- - 1

5 3

17 11 15 16 11 14 14 13 13 10 13 14 14 5

13 13 9

11 2 6 3 9 8 5 5 8 3 5 5 3 5 7 4 7 5 3

- : tidak ada hasil amplifikasi, blank : tidak dilakukan.


diamplifikasi. Pada Gambar 2 tampak bahwapenggunaan kondisi PCR III untuk beberapa No.koleksi dengan menggunakan primer OPB-01, OPB-05, OPB-07, OPB-15 dan OPB-20 menghasilkan pita-pita yang jauh lebih tajam jika dibandingkan denganGambar 1a (kondisi PCR I), dan Gambar 1b (kondisiPCR II). Pada Gambar 1a, pita-pita DNA yangdihasilkan untuk No. koleksi 50 lebih jelas (tajam) jikadibandingkan dengan pita-pita DNA pada Gambar 1buntuk No. koleksi yang sama. Perbedaan yang jelasmengenai resolusi fragmen DNA hasil amplifikasi PCRantara kondisi I dan III dapat dilihat untuk No. koleksi23, 25 dan 36 dengan menggunakan primer OPB-01(Gambar 1a dan 2). Pada gambar tersebut tampakbahwa kondisi PCR III untuk nomor-nomor koleksitersebut memberikan kualitas pita dan resolusi yanglebih baik jika dibandingkan dengan kondisi PCR Isehingga pita-pita yang dihasilkan dengan kondisiPCR III mudah diamati.

Karakterisasi molekular talas menggunakanprimer random (Operon Technologies) telahdilakukan, yang meliputi 23 aksesi talas Hawai, 2

adalah pada jumlah siklus, suhu dan lamanyaannealing. Berdasarkan data-data yang diperolehtampaknya amplifikasi DNA genom talas yangdikoleksi dari berbagai daerah di Indonesia lebih baikdilakukan dengan jumlah siklus PCR yang tidakterlalu banyak serta waktu annealing yang panjang(3 menit).

Identifikasi primer yang sesuai dan primerinformatif. Berdasarkan data yang diperoleh, terlihatbahwa. dari 12 primer yang dicoba dengan kondisiPCR I, II dan III, sembilan primer diantaranyameghasilkan pita-pita DNA (Tabel 1 dan Tabel 2).Kesembilan primer tersebut adalah OPB-01, OPB-05,OPB-20 (kondisi PCR I dan II) , OPB-06, OPB-04,OPB-10 (Kondisi PCR I, II dan III), OPB-16 (kondisiPCR I), OPB-07, OPB-15 (kondisi PCR III).Sedangkan untuk primer OPE-05, OPB-02 dan OPE-10 kemungkinan dapat memberikan hasil amplifikasiDNA jika kosentrasinya ditingkatkan.

Pemilihan primer yang sesuai tidak saja hanyaberdasarkan ada tidaknya hasil amplifikasi DNA,tetapi juga harus informatif yang berarti dapat variasiatau perbedaan di antara individu yang diuji. Di antaraprimer-primer yang dicoba, beberapa primer yanginformatif adalah OPB-01, OPB-05, OPB-20, OPB-06, OPB-04, OPB-07, OPB-15 (Gambar 1a danGambar 2). Variasi pola pita RAPD antar individu yangdiuji dengan menggunakan primer OPB-01, OPB-05,dan OPB-15 dapat diamati pada Gambar 2Perbedaan yang sangat jelas nampak untuk sample23, 25, 36, 106, 109 dan 199 ( OPB-01), 56 dan 140(OPB-05). Pada Gambar 2b (OPB-15) tampakperbedaan pola pita DNA nampak pada seluruhsampel yang diuji.

Variasi pola pita DNA yang diperoleh denganprimer-primer tersebut menggambarkan adanyapolimorfisme talas Indonesia yang cukup tinggi pada

23130 bp 9416 2027 564

7 23 25 34 36 40 49 50 56 62 66

aksesi varitas antiquorum dan 6 aksesi talasIndonesia (Irwin et al, 1998). Beberapa primer yangdigunakan pada penelitian tersebut juga dicoba padapenelitian ini yaitu OPB-01, OPB-04, OPB-05, OPB-06, dan OPB-20. Walaupun menggunakan kondisiPCR yang sama (kondisi I) tetapi hasil yang diperolehdalam percobaan ini tidak sebaik jika menggunakankondisi PCR lain (kondisi III). Perbedaan yangmendasar pada ketiga kondisi PCR yang dicoba

34 50 109 50

23130 bp 9416 2027 564

OPB-10 OPB-20

Gambar 1. Produk amplifikasi DNA talas menggunakan primer OPB-01 (3,2 µM) melalui kondisi PCR I (1a) , OPB-10 dan OPB-20 (3,2 µM) pada kondisi PCR II (1b).

(a)

(b)

tingkat molekuler. Penelitian-penelitian mengenaikarakterisasi molekuler seperti ini dapat memberikaninformasi mengenai keragaman genetik talas yangada di Indonesia. Penelitian mengenai keragaman


genetik talas dari beberapa negara, termasuksebagian talas dari Indonesia telah dilakukan olehIrwin et al (1998) dan John et al (1997). Informasiyang diperoleh dari hasil penelitian ini memberikanpeluang lebih jauh untuk menggali informasi yangsemakin lengkap mengenai keragaman talas.Informasi semacam ini sangat dibutuhkan, baik untuktujuan inventarisasi keragaman talas yang terdapatdi Indonesia maupun untuk tujuan pemuliaan melaluipendekatan molekuler.

KESIMPULANJumlah atau konsentrasi primer serta perbedaan

kondisi PCR berpengaruh terhadap hasil amplifikasiDNA. Konsentrasi primer yang sesuai untukmengamplifikasi DNA genom talas adalah 3,2 µM.Kondisi PCR yang dapat menghasilkan jumlah dankualitas pita-pita DNA yang paling baik dari tigakondisi PCR yang dicoba adalah kondisi PCR III.Primer-primer yang dapat menampilkan pola pita yangbervariasi di antara sampel yang diuji adalah OPB-01, OPB-05, OPB-20, OPB-06, OPB-04, OPB-07,OPB-15.

UCAPAN TERIMAKASIHPenelitian ini merupakan bagian dari Proyek TANSAO(Taro Network for Asia and Oceania) dengandukungan dana Masyarakat Ekonomi Eropa. Ucapanterimakasih disampaikan kepada Bapak Dr Made SriPrana selaku koordinator proyek Tansao di Indonesia.Ucapan yang sama disampaikan pula kepada SdrSanti Sugiharti, Sdr Oman Abdurahman dan Sdr AniIndriani atas bantuan teknis dilaboratorium, Sdr TKuswara untuk penanganan sampel di kebun koleksiserta Sdr S Jitno Rijadi untuk dokumentasi hasilpenelitian.

DAFTAR PUSTAKAAusubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman,

J.G., Smith, J.A. & Stuhl, K. 1994. Current Protocols inMolecular Biology. New York: John Wiley & Sons, Inc.

Gilies, A.C.M., Cornelius, J.P., Newton, A.C., Navaro, C.,Hernandez, M. & Wilson, J. 1997. Genetic variation in CostaRica population of tropical timber species Cedrela odorataL. assesed using RAPDs. Molec ecol 6: 1113-1115.

Irwin, S.V., Kaufusi, P., Banks, K., De la Pena, R. & Cho, J.J.1998. Molecular characterization of taro (Colocasiaesculenta) using RAPD markers. Euphytica 99: 183-189.

Ishak & Dwimahyani, I. 1999. Genetic and molecular analysis ofrice waxy mutant line using RAPD marker. AnnalesBogoriense 6: 27-36.

Stange, C.D., Prehn & Patricio. 1998. Protocols isolation of Pinusradiata genomic DNA suitable for RAPD analysis. Plant MolecBiol reporter 16: 1-8.

John, Cho , Irwin, S.V., Banks, K. & Kaufusi, K. 1997. Molecularcharacterization of 48 taro (Colocasia esculenta) lines usingRAPD markers. Plant & Animal Genome V Conference. SanDiego, 12-16 January 1997.

Lebot, V. & Aradhya, K.M. 1991. Isozyme variation in taro(Colocasia esculenta L. Schott ) from Asia and Oceania.Euphytica 56: 55-66.

Nkongolo, K.K., Klimaszewska, K. & Gration, W.S. 1998. DNAyields and optimization of RAPD patterns using spruceembriogenic lines, seedlings, and needles. Plant Molec Biolreporter 16: 1-9.

Pandey, R.N., Adams, R.P. & Flournoy, L.E. 1996. Inhibition ofRandom Amplified Polymorphic DNAs (RAPDs) by plantpolysaccharides. Plant Molec Biol reporter 14: 15-22.

Porebski, S., Bailey, L.G. & Baum, B.R. 1997. Modification ofCTAB DNA extraction protocol for plants containing highpolysacharide and polyphenol components. Plant Molec Biolreporter 15: 8-15.

Prana, T.K., Hartati, N.S. & Prana, M.S. 1999. Studi variasi isozimpada talas dari Sulawesi Selatan. Hayati 6: 81-86.

Purwantoro, A., Supaibulwatana, K., Mii, M. & T. Koba. 1999.Cytologycal and RAPD (Random Amplified PolymorphicDNA) analyses of somaclonal variation in Easter Lily (Liliumlongiforum Thunb.) . Plant Biotechnology 16: 247-250.

Siregar, U.J., Sudarmonowati, E. & Hartati, N.S. 1998.Development of RAPD protocol for Shorea laevis. AnnalesBogorienses 5: 85-92.

Sudarmonowati, E. & Hartati, N.S. 1997. A simple method forextracting DNA and obtaining RAPD (Random AmplifiedPolymorphic DNA) markers of Shorea parvifolia. Proceedingof The Indonesian Biotechnology Conference. Jakarta, 17-19 Juni 1997.

Wilkins, T.A. & Smart, L.B.. 1996. Isolation of RNA from PlantTissue. Di dalam: Krieg, P.A. (ed). A Laboratory Guide toRNA. Isolation, Analysis and Synthesis. New York: Wiley -Liss.

25 106 109 199 23 36 40 62 25 140 56

2072 bp 1500 600 200

66 23 34 36 203 234 329 111 140 2310 bp 9416 6557 4361 564

(a)

(b)

Gambar 2. Produk amplifikasi DNA talas menggunakan primer kon- Sentrasi 3,2 µM pada kondisi PCR III. 2(a). OPB-01, OPB-15 dan OPB-05, 2(b).

RAPD

Documents

Transcript of RAPD