DETEKSI KERAGAMAN SALAK ( Salacca zalacca ) VARIETAS .../Deteksi... · DAN NON PONDOH MELALUI...

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

i

DETEKSI KERAGAMAN SALAK (Salacca zalacca ) VARIETAS PONDOH

DAN NON PONDOH MELALUI ANALISIS RAPD-PCR

Skripsi

Untuk memenuhi sebagian persyaratan

guna memperoleh derajat Sarjana Pertanian

di Fakultas Pertanian

Universitas Sebelas Maret

Jurusan/Program Studi Agronomi

Oleh :

TRIPURNAMI CANDRADEWI

H0106109

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2012


commit to user

ii

HALAMAN PENGESAHAN



yang dipersiapkan dan disusun oleh

TRIPURNAMI CANDRADEWI

H 0106109

telah dipertahankan di depan Dewan Penguji

Pada tanggal, Oktober 2012

Dan dinyatakan telah memenuhi syarat

Susunan Tim Penguji

Ketua Anggota I Anggota II

Prof. Dr. Ir. Nandariyah, MS

NIP. 19540805 198103 2 002

Prof. Dr. Ir. Djoko Purnomo, MP

NIP. 19480426 197609 1 001

Dr. Ir. Pardono, MS

NIP. 19550806 198303 1 003

Surakarta, Oktober 2012

Universitas Sebelas Maret Surakarta

FakultasPertanian

Dekan

Prof. Dr. Ir. Bambang Pujiasmanto, MS

NIP. 19560225 198601 1 001


commit to user

iii

MOTTO DAN PERSEMBAHAN

Berilmu, Ilmu adalah hiasan, Keutamaan dan bertanda segala pujian

Dalam setiap hari berusahalah selalu bertambah dalam penguasaan ilmu

Dan menyelamlah ke dalam lautan ilmu

(HR. Muhammad Ibnul Hasan bin Abdullah)

Karya kecil ini Kupersembahkan untuk :

Ayah dan Ibu Serta Adikku Tercinta dan seluruh Keluarga

Dan rekan – rekan serta orang terdekatku yang banyak membantu


commit to user

iv

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Klaten pada tanggal 31 Maret 1988 sebagai anak

Pertama dari Tiga bersaudara dari Bapak Prawoto, Spd dan Ibu Sri Indriyastuti,

BA. Penulis adalah seorang muslim dan lahir dari orang tua dengan latar

pendidikan Pegawai Negeri. Penulis tinggal bersama kedua orang tua di Jabungan

(21/09), Gondang, Kebonarum, Klaten dari tahun 1993 sampai sekarang.

Pendidikan Dasar sampai perguruan tinggi, diselesaikan penulis di kota

Klaten dan Surakarta, Jawa Tengah. Tahun 1993 penulis pernah sekolah di TK

Pertiwi 1 Boyolali pada tingkat A dan melanjutkan ke tingkat B di TK Pertiwi 1

Sumberejo, Klaten selatan. Pada tahun 1993-1994 penulis telah menyelesaikan

pendidikan TK. Tahun 1995-1996 penulis pernah mengikuti Taman Pendidikan

Al‟ Quran “ AL- FIRDAUS ”. Tahun 2000 penulis lulus dari SD Negeri 1

Sumberejo, Klaten selatan. Kemudian tahun 2003 penulis menyelesaikan

pendidikan Lanjutan Pertama di SMP Negeri 3 Klaten dan Pendidikan Lanjutan

Atas tahun 2006 di SMA Negeri 2 Klaten. Pada tahun yang sama, penulis

diterima di Jurusan Agronomi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret

Surakarta pada Agustus 2006. Selama mengeyam pendidikan di Fakultas

Pertanian Penulis aktif dalam kegiatan rohani Mahasiswa sebagai pengurus FUSI

tahun 2007/2008 dan penulis menjadi anggota tetap Himpunan Mahasiwa

Agronomi (HIMAGRON). Penulis juga aktif dalam mengikuti kegiatan

kepanitian OSMARU tahun 2007. Pada tahun 2008/2009 penulis pernah

mengikuti kegiatan MAGANG mahasiswa di CV. NURSERY, Prambanan.

Pada tahun 2012 penulis berhasil menyelesaikan pendidikan dari Fakultas

pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta yang sekarang dikenal sebagai

Universitas Negeri Solo.


commit to user

v

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas berkat rahmat, hidayah dan ridho-

Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “ Deteksi Keragaman

Salak (Salacca Zalacca ) Varietas Pondoh dan Non Pondoh Melalui Analisis

RAPD-PCR”. Skripsi ini disusun dan diajukan sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Pertanian di Fakultas Pertanian Universitas Sebelas

Maret Surakarta. Skripsi ini adalah sebagian dari penelitian Prof. Dr. Ir.

Nandariyah, MS.

Penulis menyadari bahwa dalam penyelesaian skripsi ini tidak lepas dari

dukungan berbagai pihak, oleh karena itu penulis menyampaikan terima kasih

kepada:

1. Prof. Dr. Ir. Bambang Pujiasmanto, MS selaku Dekan Fakultas Pertanian

Universitas Sebelas Maret Surakarta.

2. Prof. Dr. Ir. Nandariyah, MS selaku Dosen Pembimbing Utama Skripsi yang

telah memfasilitasi penelitian ini, atas segala bimbingan, bantuan, evaluasi,

saran dan ilmu yang telah diberikan serta pengarahan demi lebih baiknya

skripsi ini.

3. Prof. Dr. Ir. Djoko Purnomo, MP selaku Dosen Pembimbing Pendamping

Skripsi, yang telah memberikan bimbingan, masukan maupun pengarahan.

4. Dr. Ir. Pardono, MS selaku Dosen Pembahas dan Dosen Pembimbing

Akademik yang telah memberikan bimbingan, saran, masukan dan

pengarahan.

5. Bapak Ibu dosen serta karyawan-karyawan Fakultas Pertanian Universitas

Sebelas Maret Surakarta.

6. Pak Ahmad himawan pemilik CV Agrobiotech yang telah memfasilitasi

segala kegiatan yang berkaitan dengan penelitian.

7. Ayah dan ibu tercinta (maaf sampai saat ini hanya ucapan terimakasih dan doa

yang bisa saya berikan untuk membalas semua yang telah kalian berikan),

serta keluarga yang selalu mendukung dan mendoakan penulis sehingga bisa

menyelesaikan skripsi ini.


commit to user

vi

8. Indah Suryani, mas Widodo, Bulek Tien, Om Lukito, mbak Nurul, teman-

teman seperjuangan (Nanik dan Latifah), dan mas Agus yang selalu

memberikan bantuan, masukan, semangat, doa dan dukungan selama

penelitian.

9. Rekan-rekan angkatan 2006 Fakultas Pertanian UNS (IMAGO „06) dan

segenap pihak yang telah membantu demi kelancaran penelitian ini.

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna.

Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun. Demikian, semoga

skripsi ini bermanfaat bagi penulis khususnya dan pembaca pada umumnya.

Surakarta, Oktober 2012

Penulis


commit to user

vii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ......................................................................................... i

HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................... ii

MOTTO DAN PERSEMBAHAN .................................................................... . iii

DAFTAR RIWAYAT HIDUP ......................................................................... iv

KATA PENGANTAR ....................................................................................... v

DAFTAR ISI ...................................................................................................... vii

DAFTAR TABEL ............................................................................................. ix

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... x

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xii

RINGKASAN .................................................................................................... xiii

SUMMARY ....................................................................................................... xiv

I. PENDAHULUAN .......................................................................................... 1

A. Latar Belakang .......................................................................................... 1

B. Perumusan Masalah .................................................................................. 2

C. Tujuan Penelitian ...................................................................................... 3

D. Manfaat Penelitian .................................................................................... 3

II. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................ 4

A. Salak (Salacca zalacca) ........................................................................... 4

1. Taksonomi ........................................................................................... 4

2. Morfologi ............................................................................................. 4

3. Sistem klasifikasi tanaman salak ......................................................... 7

4. Keragaman jenis salak . ...................................................................... 8

B. Analisis RAPD-PCR ................................................................................. 12

1. PCR (Polymerase Chain Reaction) .....................................................13

2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ................................ . 17

3. Aplikasi analisis RAPD ..................................................................... . 18

4. Isolasi DNA ....................................................................................... . 19

5. Elektroforesis ...................................................................................... 20

C. Hipotesis ................................................................................................. .. 22


commit to user

viii

III. METODE PENELITIAN ........................................................................... . 23

A. Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................. . 23

B. Bahan dan Alat Penelitian ....................................................................... . 23

C. Cara kerja Penelitian................................................................................ . 24

1. Pengambilan sampel daun ................................................................. . 24

2. Isolasi DNA ....................................................................................... . 24

3. Uji kualitas DNA ............................................................................... . 26

4. Seleksi primer .................................................................................... . 26

5. RAPD-PCR/Amplifikasi DNA .......................................................... 27

6. Elektroforesis ..................................................................................... 27

7. Visualisasi hasil RAPD ...................................................................... 28

D. Analisis Data ............................................................................................ 28

1. Analisis similaritas ............................................................................. 29

2. Analisis gerombol .............................................................................. 30

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN.................................................................... . 31

A. Sistem klasifikasi kultivar tanaman salak pondoh dan non pondoh........ .. 31

1. Hasil isolasi dan uji kualitas DNA ................................................... .. 31

2. Hasil seleksi primer .......................................................................... .. 36

3. Hasil amplifikasi DNA dengan penanda RAPD .............................. .. 37

V. KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................................... 49

A. Kesimpulan ............................................................................................... 49

B. Saran .......................................................................................................... 50

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 51

LAMPIRAN ......................................................................................................... 54


commit to user

ix

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman

1 Varietas salak yang dilepas dari beberapa wilayah Indonesia ........... 9

2 Jenis primer dan urutan nukleotida penyusunnya .............................. 27


commit to user

x

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Halaman

1 Prinsip amplifikasi fragmen DNA dengan mesin PCR .......... ............... 16

2 Profil hasil uji kualitas tujuh sampel daun salak hasil metode CTAB

(Pondoh Super, Pondoh Lawu, Pondoh Hijau, Gading, Kembang

arum, Manggala, dan Lumut) dengan penanda marker DNA 1 kb ....... 33

3 Profil hasil uji kualitas isolat DNA empat sampel daun salak dengan

metode CTAB (salak Kecandran, Banjar, pondoh Madu, dan pondoh

Hitam dengan marker 1 kb ..................................................................... 34

4 Hasil uji kualitas DNA salak (Saratan, Bejalen, Nglumut, Pondoh

lawu, pondoh Madu, dan Kecandran) dengan metode Plant Kit

menggunakan penanda marker 1 kb (250-10000 pb)............................ 35

5 Hasil uji kualitas tujuh sampel DNA salak (pondoh Hitam, pondoh

Lawu, Nglumut, Bejalen, pondoh Super, Kecandran, dan Gading)

dengan metode Plant Kit ......................................................................... 36

6 Hasil uji seleksi primer OPA-11, OPA-17, OPA-16, OPX-17, OPX-

15, dan OPA-18 ...................................................................................... 37

7 Hasil amplifikasi PCR varietas salak (Kembang arum, Manggala, dan

Kecandran) dengan primer OPA-11 menghasilkan tiga pita

monomorfik ............................................................................................ 38

8 Hasil amplifikasi PCR isolat DNA salak (pondoh Madu, pondoh

Hitam, dan Kembang arum) dengan primer OPA-16 yang tidak

berhasil amplifikasi ................................................................................. 40

9 Hasil amplifikasi DNA dua puluh dua kultivar S. zalacca

menggunakan primer OPA-11............................................................ .... 41

10 Hasil amplifikasi dua puluh dua kultivar salak dengan pasangan basa

terendah 100 pb....................................................................................... 42

11 Hasil amplifikasi lima belas kultivar salak dari hasil seleksi dua puluh

dua kultivar yang berhasil amplifikasi............................................. 43


commit to user

xi

12 Pola pita no. 1 dan no. 6 hasil amplifikasi yang mempunyai kesamaan

pola pita dengan jumlah pita dua pita pada kultivar Kelapa bali dan

Manggala........................................................... ..................................... 44

13 Pola pita no. 3 dan no. 4 mempunyai kesamaan pola pita yang terletak

antara 100 pb - 400 pb pada kultivar Kediri dan pondoh

Hitam..................................................................................................... 44

14 Pola pita no. 5, no. 8, no. 10, dan no.12 pada kultivar pondoh Madu,

Thailand, Bejalen, dan pondoh Lawu yang terletak 300 pb - 600 pb. ... 45

15 Pola pita no. 9 dan no. 11 pada kultivar Banjar dan Kecandran terletak

300 pb - 600 pb mempunyai kesamaan pola pita................................... 46

16 Pola pita yang berkerabat jauh dijumpai pada kultivar Gula pasir,

Madura, Merah, Suaru, dan Tasik........................................................... 47


commit to user

xii

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Halaman

Lampiran 1. Foto Sampel daun salak bahan ekstraksi..................................... 54

Lampiran 2. Foto Hasil ektraksi DNA ............................................................ 55

Lampiran 3. Alat ektraksi DNA dengan metode CTAB ................................. 57

Lampiran 4. Alat dan bahan ekstraksi dan elektroforesis DNA dengan

metode Plant Kit ......................................................................... 59

Lampiran 5. Identifikasi terjemahan pola dan jumlah pita lima belas

kultivar salak. ................................................................................ 61

Lampiran 6. Data Biner matrik pola pita terjemahan berdasar pasangan basa 66

Lampiran 7. Foto tanamna salak dan sampel buah salak. ............................... 66


commit to user

xiii



Tripurnami Candradewi

H 0106109

RINGKASAN

Salak (Salacca zalacca) merupakan tanaman asli Indonesia yang

mempunyai keragaman jenis dan berpotensi tinggi untuk dikembangkan sebagai

salah satu produk ekspor. Informasi tentang keragaman genetik salak masih

sangat kurang, sehingga perlu adanya pengujian dan penelitian dengan metode

RAPD - PCR. Penanda RAPD merupakan salah satu penanda molekuler yang

dapat digunakan untuk mempelajari keragaman genetik tanaman tahunan.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman tanaman salak pondoh dan

salak non pondoh. Tujuan lain yaitu mengetahui apakah terdapat hubungan

kekerabatan kultivar tanaman salak pondoh dan salak non pondoh berdasarkan

penanda RAPD.

Penelitian ini sebagai bagian dari penelitian Prof. Dr. Ir. Nandariyah, MS

pada tahun 2012. Penelitian dilaksanakan pada bulan April sampai Mei 2012

bertempat di CV. Agribiotech Jl. Jambon No. 605 Gang Batan Jatimulyo, Kricak,

Tegalrejo, Yogyakarta, dan Laboratorium Fisiologi dan Bioteknologi Fakultas

Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta. Penelitian dilaksanakan dengan

dua metode isolasi DNA yaitu metode CTAB dan Dinamid Plant Kit, kemudian

DNA hasil isolasi diuji secara kualitatif dengan elektroforesis gel agarose. Hasil

isolat berkualitas baik diamplifikasi dengan penanda RAPD-PCR, hasilnya

kemudian di running dengan elektroforesis gel agarose. Selanjutnya hasil

elektroforesis diamati dibawah sinar ultraviolet agar dapat didokumentasikan

melalui kamera makro. Dari dua puluh dua kultivar salak baik non pondoh dan

pondoh hanya lima belas kultivar yang berhasil amplifikasi dengan primer OPA-

11 dan susunan pola pita polimorfik antara 100 pb – 600 pb.

Hasil penelitian menunjukkan hubungan kekerabatan antara kultivar salak

pondoh dan salak non pondoh berdasarkan penanda RAPD.


commit to user

xiv

DETECTION OF SALAK (Salacca zalacca) PONDOH AND NON PONDOH

VARIABILITY THROUGH RAPD-PCR ANALYSIS

Tripurnami Candradewi

H 0106109

SUMMARY

Salak (Salacca zalacca) is Indonesia native fruit crop, which has several

kinds of variety and has high potential to be developed as one of the export

commodity. For developing the crop, genetic information is necessary (still

limited untill now) through RAPD - PCR testing and research methods. RAPD

marker is one of the molecular markers that can be used to study the genetic

diversity of annual plants. The research aims is to determine the genetic

variability of salak pondoh and non pondoh. The other aim of the research is to

determine the trait relationship of two salak kinds as mention above by RAPD

markers.

The study as apart of result of nandariyah research in 2012 years. The

study was conducted from April to May 2012 held at CV. Agribiotech Jl. No.

Jambon. 605 Gang Jatimulyo Batan, Kricak, Tegalrejo, Yogyakarta, and at Plant

Physiology and Biotechnology Laboratory, Faculty of Agriculture, University of

Sebelas Maret, Surakarta. The research was conducted by two kinds method of

DNA isolation there are CATB and Dinamid Plant Kid method. The quality of

isolation product then to be test by gel agarose electrophoresis. High quality

isolate then amplified by RAPD-PCR marker, the result then running by gel

agarose electrophoresis and observed under ultraviolet ray for documentating

through micro camera. Among twenty two salak cultivars (pondoh and non) just

fifteen cultivars succeeded amplifical by OPA-11 primer with polymorphic

banding pattern between 100 bp – 600 bp.

The result of research showed based on RAPD marker the relationship

between salak pondoh and non pondoh cultivars.


commit to user

DETECTION OF SALAK (Salacca zalacca) PONDOH AND NON PONDOH

VARIABILITY THROUGH RAPD-PCR ANALYSIS

Nandariyah 1)

Tripurnami Candradewi 2)

H 0106109

ABSTRACT

Salak (Salacca zalacca) is Indonesia native fruit crop, which has several

kinds of variety and has high potential to be developed as one of the export

commodity. For developing the crop, genetic information is necessary (still

limited untill now) through RAPD - PCR testing and research methods. RAPD

marker is one of the molecular markers that can be used to study the genetic

diversity of annual plants. The research aims is to determine the genetic

variability of salak pondoh and non pondoh. The other aim of the research is to

determine the trait relationship of two salak kinds as mention above by RAPD

markers.

The study as apart of result of nandariyah research in 2012 years. The

study was conducted from April to May 2012 held at CV. Agribiotech Jl. No.

Jambon. 605 Gang Jatimulyo Batan, Kricak, Tegalrejo, Yogyakarta, and at Plant

Physiology and Biotechnology Laboratory, Faculty of Agriculture, University of

Sebelas Maret, Surakarta. The research was conducted by two kinds method of

DNA isolation there are CATB and Dinamid Plant Kid method. The quality of

isolation product then to be test by gel agarose electrophoresis. High quality

isolate then amplified by RAPD-PCR marker, the result then running by gel

agarose electrophoresis and observed under ultraviolet ray for documentating

through micro camera. Among twenty two salak cultivars (pondoh and non) just

fifteen cultivars succeeded amplifical by OPA-11 primer with polymorphic

banding pattern between 100 bp – 600 bp.

The result of research showed based on RAPD marker the relationship

between salak pondoh and non pondoh cultivars.

Keywords: genetic diversity, Pondoh and non pondoh salak, RAPD-PCR marker 1) Study as part of a research project leading Prof. Dr. Ir. Nandariyah, MS

2) The researcher is a student of the Faculty of Agriculture, University of March under

the guidance of Prof. Surakarta. Dr. Ir. Nandariyah, and Prof MS. Dr. Ir. Djoko Purnomo,

MP


commit to user

1

BAB. I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Salak (Salacca zalacca) merupakan tanaman asli Indonesia yang

berpotensi tinggi untuk dikembangkan sebagai salah satu produk ekspor ke

pasar internasional. Buah salak merupakan salah satu buah tropis yang

banyak diminati oleh masyarakat Jepang, Amerika, dan Eropa. Akan tetapi

untuk memenuhi standar kualitas produksi buah, kultivar salak di Indonesia

seharusnya diperbaiki melalui program pemuliaan yang menyeluruh. Banyak

aspek tanaman salak yang harus diteliti lagi, antara lain penelitian fisiologi

dan bioteknologi untuk mendukung program pemuliaan tanaman.

Salak pondoh merupakan buah yang sangat populer di Yogyakarta,

bahkan menjadi ciri khas daerah tersebut. Salak pondoh memiliki bermacam-

macam varietas seperti salak pondoh super, salak pondoh hijau, salak pondoh

hitam, dan salak pondoh madu. Salak pondoh merupakan salah satu jenis salak

yang mengalami peningkatan produksi. Kelebihan salak pondoh antara lain

rasa buah yang manis meskipun belum matang, memiliki kandungan air

cukup, berbuah sepanjang tahun, masa simpan buah lebih dari 20 hari, bila

dimakan dalam jumlah banyak tidak menimbulkan rasa tidak enak di perut,

dan harga jual relatif tinggi (Purnomo, 2001). Selain itu di Indonesia

khususnya di Jawa dan di Bali terdapat juga varietas lokal non pondoh seperti

Salak Lawu (Matesih, Karanganyar), Salak Saratan (Magelang), Salak

Nglumut (Magelang), Salak Kecandran (Salatiga), Salak Bejalen (Ambarawa),

Salak Manggala (Sleman), Salak Gading (Sleman), Salak Kediri, Salak

Banjarnegara, Salak Gula pasir, Salak Kelapa bali (Bali) dan Salak Kembang

Arum (Sleman) yang kesemuanya merupakan sumber keragaman genetik

tanaman salak.

Ada beberapa masalah yang dihadapi dalam pengembangan tanaman

salak di Indonesia diantaranya: pengelolaan dan teknik budidaya yang masih

tradisional, keterbatasan informasi kultivar-kultivar yang mempunyai sifat

http://khasiatbuah.com/buah-salak.htm


commit to user

2

unggul dan produksi tinggi, evaluasi keragaman terhadap kultivar-kultivar

sejauh ini masih terbatas pada sifat-sifat morfologis yang sangat dipengaruhi

oleh keadaan lingkungan, dan belum ada eksplorasi dan penggalian informasi

genetik yang menyeluruh dari seluruh potensi plasma nutfah tanaman salak.

Hingga saat ini informasi genetik salak masih sangat terbatas, hal ini

menjadi salah satu kendala dalam usaha pemuliaan dan pengembangan salak

unggul. Pemberian nama dan pengelompokan tanaman salak sampai saat ini

umumnya masih didasarkan pada sifat yang masih tradisional. Pengetahuan

tentang keragaman genetik sebenarnya merupakan modal dasar bagi para ahli

pemuliaan dan genetika populasi dalam pengembangan dan perbaikan

tanaman, terutama sebagai langkah awal seleksi tanaman (Thorman and

Osborn, 1992). Langkah ini penting terutama untuk membedakan individu

dalam spesies serta identifikasi genotip secara tepat dan identifikasi gen-gen

yang berpotensi sebagai pembawa karakter unggul.

B. Perumusan Masalah

Salak merupakan tanaman asli Indonesia, buah banyak digemari

masyarakat karena rasa manis, renyah dan kandungan gizi yang tinggi. Jawa

Tengah dan Yogyakarta sebagai salah satu pusat keragaman kultivar salak

mempunyai potensi yang cukup besar untuk menghasilkan varietas-varietas

unggul yang lebih bernilai ekonomis dan kompetitif. Salak Pondoh

merupakan komoditas unggulan dan perlu untuk ditingkatkan kualitas

maupun kuantitas produksinya. Meskipun salak lokal non Pondoh kurang

diminati konsumen bukan berarti keberadaannya tidak penting untuk

pemuliaan tanaman.

Keragaman varietas akan terus berkembang sejalan dengan sistem

perkembangbiakan salak secara kawin silang dan penggunaan biji sebagai

bahan tanaman. Namun informasi tentang keragaman genetik salak masih

sangat kurang, sehingga perlu adanya pengujian dan penelitian dengan

metode RAPD-PCR yang merupakan tahap awal di mulainya rekayasa

genetika tanaman. Terdapat beberapa metode yang dapat digunakan untuk


commit to user

3

mendeteksi keragaman genetik pada tingkat DNA, salah satunya yaitu dengan

teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Teknik RAPD mampu

menghasilkan potongan DNA hasil pelipat gandaan dalam jumlah yang tak

terbatas dan setiap potongan dapat diperlakukan sebagai karakter untuk

keperluan analisis. Penanda RAPD merupakan salah satu penanda molekuler

yang dapat digunakan untuk mempelajari keragaman genetik tanaman

tahunan. Salah satu contohnya mendeteksi kesalahan pengelompokan varietas

dan kultivar (Novey et.al, 1994). Berdasarkan uraian di atas, diteliti

bermaksud menjawab pertanyaan sebagai berikut:

1. Bagaimanakah keragaman tanaman Salak varietas salak pondoh dan

non pondoh melaui analisis RAPD-PCR?

2. Bagaimana hubungan kekerabatan tanaman Salak varietas salak pondoh

dan non pondoh melalui analisis RAPD?

C. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk :

1. Mengetahui keragaman jenis tanaman Salak pondoh dan non pondoh pada

kultivar masing-masing.

2. Mengetahui apakah terdapat hubungan kekerabatan kultivar tanaman salak

pondoh dan non pondoh berdasarkan penanda RAPD.

D. Manfaat Penelitian

Penelitian ini mempunyai manfaat yaitu:

1. Memastikan/menentukan tingkat keragaman dan kekerabatan kultivar

salak pondoh maupun non pondoh.

2. Bagi peneliti dapat mengenal lebih dalam keragaman kultivar salak

melalui teknik penanda molekuler RAPD-PCR

3. Bagi petani dapat dimanfaatkan untuk menentukan kultivar unggul yang

dapat dibudidayakan di daerah setempat.


commit to user

4

BAB. II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Salak (Salacca zalacca)

1. Taksonomi

Kerajaan : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Kelas : Monocotyledoneae

Ordo : Arecales

Famili : Arecaceae

Genus : Salacca

Spesies : Salacca zalacca

2. Morfologi

Bentuk morfologi tanaman salak sangat dipengaruhi oleh faktor

lingkungan seperti iklim, tanah, dan topografi yang saling terkait,

sehingga mempengaruhi fungsi fisiologis dan morfologis. Dalam

beradaptasi dengan lingkungan yang tidak sesuai, maka tanaman salak

akan melakukan beberapa perubahan baik fisiologi maupun morfologi.

Salak adalah sejenis palma dengan buah yang biasa dimakan. Dalam

bahasa Inggris disebut snake fruit, karena kulit buah mirip dengan sisik

ular. Salak termasuk palma berbentuk perdu atau hampir tidak berbatang,

berduri banyak, melata dan beranak banyak, tumbuh menjadi rumpun

yang rapat dan kuat.

Batang tanaman salak tumbuh tidak seperti layaknya tanaman

pepohonan lain, yaitu relatif pendek dan baru terlihat jelas setelah

berumur lebih kurang 20 tahun (Padmosudarso, 2000, dalam

Nandariyah, 2007). Pada ukuran 50-75 cm, batang akan rebah secara

alami. Pada batang bagian bawah akan tumbuh akar-akar dan tunas baru.


commit to user

5

Batang menjalar di bawah atau di atas tanah, membentuk rimpang, sering

bercabang, dan diameter 10-15 cm.

Daun salak berbentuk pinnate atau berupa sisir terdiri atas pelepah,

tangkai, dan helaian anak daun yang tersusun menyirip, tangkai daun

tertutup oleh duri tajam (Ashari, 1995). Daun majemuk menyirip,

panjang 3-7 m, tangkai daun, pelepah dan anak daun berduri panjang,

tipis dan banyak, warna duri kelabu sampai kehitaman. Anak daun

berbentuk lanset dengan ujung meruncing, berukuran sampai 8 x 85 cm,

sisi bawah keputihan oleh lapisan lilin. Bagian bawah dan tepi tangkai

berduri tajam, ukuran dan warna daun tergantung varietas (Anonim,

1992).

Salak umumnya berumah dua (dioesis), karangan bunga terletak

dalam tongkol majemuk yang muncul di ketiak daun, bertangkai, mula-

mula tertutup oleh seludang yang belakangan mengering dan mengurai

menjadi serupa serabut. Bunga kecil muncul di ketiak pelepah, mekar

selama 1-3 hari. Ketika masih muda diselubungi seludang yang berbentuk

perahu simetri radial. Mempunyai tiga daun kelopak dan tiga daun

mahkota, kadang-kadang struktur kelopak dan mahkota tidak dapat

dibedakan. Kuntum bunga dibedakan menjadi kuntum besar dan kecil.

Keduanya bersatu dalam satu dasar bunga yang memiliki putik dengan

satu bakal biji. Bunga jantan, terdiri atas stamen, banyak, rapat, panjang,

tersusun seperti genteng, simetri radial.

Bunga mempunyai mahkota dan mata tunas bunga kecil-kecil yang

rapat, satu kelompok terdiri atas 4-14 malai. Satu malai terdiri dari ribuan

serbuk sari. Panjang seluruh bunga sekitar 15-35 cm, sedang panjang

malai 7-15 cm. Bunga betina hanya menghasilkan putik, berbentuk agak

bulat. Mempunyai mahkota dan mata tunas dengan satu putik dan bakal

biji yang tersusun dalam kuntum. Satu kelompok terdiri atas 1-3 malai,

setiap malai mengandung 10-20 bakal buah. Panjang bunga seluruhnya

20-30 cm, panjang malai 7-10 cm. Warna hijau kekuningan lalu merah

dan sebelum mekar sempurna bunga sudah berwarna kehitaman. Selain


commit to user

6

bunga jantan dan betina terdapat pula bunga hermaprodit (Steenis, 1975).

Panjang tongkol bunga jantan 50-100 cm, terdiri atas 4-12 bulir silindris

masing-masing antara 7-15 cm, dan banyak bunga kemerahan terletak di

ketiak sisik-sisik yang tersusun rapat. Tongkol bunga betina 20-30 cm,

bertangkai panjang, terdiri atas 1-3 bulir dengan panjang mencapai 10

cm.

Tanaman salak mempunyai sistem perakaran dangkal, batang

jarang terlihat karena tertutup oleh pelepah daun yang tersusun roset dan

sangat rapat sekali. Akar serabut, menjalar datar di bawah tanah. Daerah

perakaran tidak luas, dangkal dan mudah rusak jika kekeringan atau

kelebihan air. Perkembangan akar terutama dipengaruhi oleh cara

pengolahan tanah, pemupukan, tekstur tanah, sifat fisik tanah, sifat kimia

tanah, air tanah. Untuk menjaga akar tetap tumbuh, maka perlu diadakan

penimbunan dan setelah muncul akar-akar muda, akar yang tua dipotong

(Tjahjadi, 1995; Santoso, 1990).

Buah salak tipe buah batu berbentuk segitiga agak bulat atau bulat

telur terbalik, runcing di pangkal dan membulat di ujung, panjang 2,5-10

cm, terbungkus oleh sisik-sisik berwarna kuning coklat sampai coklat

merah mengkilap yang tersusun seperti genting, dengan banyak duri kecil

yang mudah putus di ujung tiap-tiap sisik. Dinding buah tengah

(sarkotesta) tebal berdaging, kuning krem sampai keputihan, berasa

manis, masam, atau sepat. Biji 1-3 butir, berwarna coklat hingga

kehitaman, keras, panjang 2-3 cm. Salak terutama ditanam untuk

dimanfaatkan buahnya, yang populer sebagai buah meja. Selain dimakan

segar, buah ini juga biasa dibuat manisan, asinan, dikalengkan, atau

dikemas sebagai keripik. Buah yang muda digunakan untuk bahan rujak.

Helai-helai anak daun dan kulit tangkai daun dapat digunakan

sebagai bahan anyaman, sesudah duri-duri dihilangkan lebih dahulu.

Rumpun salak kerap ditanam sebagai pagar karena duri-duri yang tajam.

Demikian pula, potongan-potongan tangkai daun yang telah mengering


commit to user

7

pun kerap digunakan untuk mempersenjatai pagar, atau untuk melindungi

pohon yang tengah berbuah dari pencuri.

3. Sistem klasifikasi tanaman salak

Ada beragam cara untuk mengelompokkan tanaman antara lain

pengelompokan berdasarkan kegunaan untuk manusia, menurut tempat

tumbuh, kebiasaan tumbuh, menurut adaptasi iklim, menurut wujud,

bentuk dan struktur (morfologi) serta klasifikasi menurut struktur

reproduksi dan klasifikasi yang lebih modern dengan menggunakan teknik

pembedaan kromosom serta analisis DNA yang lebih menekankan pada

analisis genetika (Harjadi, 1982 dalam Nandariyah, 2007). Penggolongan

berdasarkan morfologi merupakan penggolongan yang masih umum di

gunakan pada saat ini.

Klasifikasi keragaman tanaman salak yang ada saat ini umumnya

adalah penggolongan berdasarkan ciri-ciri morfologi vegetatif dan

generatif. Identifikasi dan klasifikasi pada tanaman salak telah dicoba oleh

beberapa peneliti. Suskendriyati et al., (2000) membedakan tanaman salak

pondoh di dataran tinggi Sleman berdasarkan perbedaan morfologi batang,

daun, bunga, buah dan duri. Sukaya (2003) meneliti keragaman dan

mengelompokkan kultivar-kultivar salak di Sleman berdasarkan karakter

morfologi dan mendapatkan kesimpulan bahwa peubah morfologi buah

mempunyai keragaman terbesar. Harsono (1994) mengelompokkan

kultivar salak di Madura berdasarkan ciri morfologi dan menggabungkan

dengan pola pita isozim namun belum diperoleh hasil yang maksimal.

Sistem klasifikasi berdasarkan sifat morfologi banyak digunakan

karena prosedur mudah dan cepat namun memiliki kelemahan yaitu hasil

sering tidak akurat karena faktor lingkungan, perbedaan umur, dan

jaringan tanaman (Khanuja et al., dalam Nandariyah, 2007). Analisis

keragaman genetik suatu populasi dapat dilakukan baik secara morfologis

yaitu pengamatan langsung terhadap fenotip tanaman maupun dengan

menggunakan penanda tertentu, misalnya penanda morfologis, fisiologis,


commit to user

8

dan molekuler DNA (Melchinger, 1992). Beberapa macam penanda yang

dapat digunakan untuk membedakan varietas antara lain: morfologi

tanaman, pola pita isozim, dan pola pita DNA. Penanda molekuler

memberikan suatu kemungkinan untuk mendapatkan hubungan genetik

yang lebih akurat dibandingkan dengan penanda-penanda yang lain.

Penanda molekuler memberikan kemungkinan yang lebih luas dan akurat

dalam mendapatkan hubungan genetik karena, secara potensial memiliki

jumlah penanda yang tidak terbatas, tidak dipengaruhi oleh kondisi

lingkungan, dapat diarahkan untuk analisis keterpautan, dapat

mengidentifikasi bahan persilangan dalam jumlah banyak, dan dapat

mengidentifikasi tanaman pada stadia awal (Nienhuis et al., 1994).

Karakter morfologi seringkali dipengaruhi oleh perubahan

lingkungan. Pengamatan morfologi juga harus memperhatikan umur

tanaman, karena perubahan umur mempengaruhi perubahan morfologi.

Sifat genetik cenderung stabil terhadap perubahan lingkungan, dan tidak

dipengaruhi oleh umur, sehingga penanda genetik dapat memberikan

informasi yang relatif lebih akurat (Pratamaningtyas, 1997; Sukartini,

2001).

4. Keragaman Jenis Salak

Berbagai aksesi tanaman salak tumbuh di pusat-pusat budidaya

tanaman salak khususnya di Jawa. Di daerah pusat budidaya salak,

seringkali dijumpai keragaman aksesi yang dinamai sesuai dengan ciri

khas warna kulit buah, daging buah, rasa, aroma dan daerah asal. Ragam

kultivar salak terjadi karena pada umumnya diperbanyak dengan

menggunakan biji tanaman salak dan menyerbuk silang (Ashari, (1995)

dalam Nandariyah, 2007).

Salak ditemukan tumbuh liar di alam di Jawa bagian barat daya

dan Sumatra bagian selatan. Akan tetapi asal-usul yang pasti belum

diketahui. Buah ini dibudidayakan di Thailand, Malaysia, dan Indonesia,

ke timur sampai Maluku, dan telah diintroduksi ke Filipina, Papua Nugini,


commit to user

9

Queensland dan juga Fiji. Sebagian ahli menganggap salak yang tumbuh

di Sumatra bagian utara berasal dari jenis yang berbeda, yang dibedakan

atas dua varietas botani, yakni var. zalacca dari Jawa dan var. amboinensis

(Becc.) Mogea dari Bali dan Ambon. Jenis spesies salak yang pernah

ditemukan di dunia kurang lebih 20 spesies, namun baru sekitar 13 spesies

yang diketahui dengan pasti identitasnya. Dari 13 spesies itu ternyata

ragam salak paling banyak dan dibudidayakan di Indonesia. Dewasa ini

ada beberapa varietas salak yang telah dilepas oleh pemerintah antara lain

salak Pondoh, Nglumut, Enrekang, Bali, dan Suwaru (Nandariyah, 2007).

Tabel 1. Varietas salak yang dilepas dari beberapa wilayah di Indonesia

Varietas Salak Wilayah

Padang sidempuan/salak merah

Condet

Pondoh, Gading, Madu, Lokal (Jawa)

Pondoh, Nglumut, Njagan

Petruk, Nangka

Kerbau, Naseh, Penjalin, Manggis

Swaru

Kersikan

Gondok, Nangka, Nenas, Gula Pasir, Bule

Kuning/Golla-golla

Serangga, Kadah, Hangsana, Malaka

Padang sidempuan-Sumut

Condet-DKI Jakarta

Sleman-DIY

Magelang-Jawa Tengah

Ambarawa-Jawa Tengah

Bangkalan-Madura

Malang-Jawa Timur

Pasuruan-Jawa Timur

Bebandem-Bali

Enrekang-Sulsel

Batu jajar-Jawa Barat

Sumber : Puslibang Hortikultura 1995 dalam Sri Kaidah, 1999.

Salak Lawu berada di desa Matesih, Kecamatan Tawangmangu

Kabupaten Karanganyar. Berada pada ketinggian 600 mdpl di lereng

Gunung Lawu. Salak Lawu dibudidayakan oleh petani bersama dengan

Salak Pondoh dan diperbanyak secara generatif (Nandariyah, 2007).

Salak Saratan berada di desa Saratan Kecamatan Mertoyudan

kabupaten Magelang pada ketinggian 350 mdpl. Salak Saratan

dibudidayakan secara merata di desa Saratan dari hasil perbanyakan secara


commit to user

10

generatif. Salak Saratan terus mengalami penurunan jumlah populasi

dikarenakan terdesak oleh pemukiman penduduk (Nandariyah, 2007).

Salak Kecandran berasal dari desa Kecandran, Salatiga ± 5 km dari

Desa Bejalen Ambarawa. Desa Kecandran merupakan sentra produksi

salak karena sebagian besar penduduk memiliki tanaman salak. Namun

sebanyak 60% keseluruhan jumlah tanaman salak telah beralih menjadi

Salak Pondoh (Nandariyah, 2007).

Salak Bejalen berasal dari Desa Bejalen Kecamatan Ambarawa

Kabupaten Semarang berada pada ketinggian 450 mdpl di tepi danau

Rawa Pening. Salak Bejalen dibudidayakan oleh petani setempat diperoleh

dari perbanyakan secara generatif. Salak bejalen mempunyai ciri rasa

manis agak sepet sampai manis dengan tinggi rata-rata 429 cm. Panjang

pelepah rata-rata 367 cm. Populasi tanaman salak terdiri atas sekelompok

tanaman betina dan tanaman jantan dengan jumlah lebih sedikit

dibandingkan tanaman betina (Nandariyah, 2007).

Salak Gading merupakan salah satu kultivar lokal Sleman yang

banyak dibudidayakan di Dusun Randusongo, Desa Donokerto, kecamatan

Turi, kabupaten Sleman. Berada di ketinggian 300 mdpl. Buah berwarna

putih kekuningan, rasa manis, dan ukuran buah kecil-kecil. Salak ini lebih

unik jika dibandingkan dengan jenis salak lain. Kulit berwarna kuning

terang tampak seperti salak yang belum matang, tapi harum beraroma

cukup tajam, dan daging buah salak tebal, renyah, dan berasa manis.

Populasi tanaman kebanyakan berasal dari perbanyakan secara vegetatif

(cangkokan) dan rata-rata berumur lebih dari 10 tahun (Nandariyah, 2007).

Salak Kembangarum merupakan salah satu ragam salak yang

sudah sejak lama dibudidayakan di dusun kembangarum dan Kadisobo,

Desa Trimulyo, Kecamatan turi, kabupaten Sleman. Daerah ini merupakan

daerah yang subur berada di bawah lereng gunung Merapi. Populasi

tanaman salak Kembangarum yang dikembangkan dari biji saat ini sudah

sangat berkurang karena tergusur oleh tanaman salak pondoh yang banyak

ditanam oleh petani setempat (Nandariyah, 2007).


commit to user

11

Salak merupakan tanaman asli Indonesia, yang sampai saat ini

belum diketahui secara pasti sejak kapan tanaman tersebut dibudidayakan

pertama kali. Hanya diduga tanaman salak ini sudah dibudidayakan sejak

ratusan tahun silam. Tanaman salak memiliki nama ilmiah Salacca edulis

Reinw dan termasuk famili Palmae serumpun dengan kelapa, kelapa sawit,

aren (enau), palem, pakis yang bercabang rendah dan tegak.

Sejarah Salak pondoh bermula ketika Orangtua Muhadiwinarto,

yang bernama Partodimejo menerima souvenir dari seorang

berkebangsaan Belanda yang akan kembali ke negara asalnya. Salah satu

dari souvenir tersebut adalah empat buah pohon salak.Kemudian pohon-

pohon salak tersebut ditanam oleh Muhadiwinarto, disebuah desa

Sukobinangun, Merdikorejo, Tempel sejak tahun 1948. Saat ini Salak

pondoh telah menyebar keseluruh pelosok Sleman dan bahkan seluruh

Indonesia. (afendry.com, 2012).

Salak pondoh merupakan jenis salak berdaging buah empuk seperti

embut, rasanya renyah, tidak sepat dan tidak masam. Salak Pondoh Hitam

berasal dari daerah Sleman, Yogyakarta, merupakan varietas salak unggul

yang sudah sangat populer. Salah satu keunggulan yang menonjol adalah

meskipun buah masih muda, tetapi rasa sudah manis. Buah berbentuk

segitiga atau bulat telur terbalik. Daging buah terdiri atas tiga septa dalam

setiap buah dan berwarna putih kapur. Ketebalan antara 0,8-1,5 cm dan

tekstur keras. Dalam setiap buah terdapat 1-3 biji yang keras dan berwarna

cokelat kehitaman. Ukuran buah antara 2,5-7,5 cm dan berat 30-100

g/buah. Jumlah buah pertandan antara 10-27. Salak ini mempunyai kulit

buah yang paling gelap bila dibandingkan dengan salak pondoh lain dan

berbentuk paling bulat.

Salak Pondoh Nglumut atau disebut Salak Nglumut, nama diambil

dari nama desa penghasil varietas salak unggul ini yaitu Desa Nglumut

yang juga berada di hamparan Merapi dan termasuk ke dalam wilayah

Kecamatan Srumbung, Kabupaten Magelang, Jawa Tengah. Bentuk buah

segitiga atau bulat telur terbalik dengan pangkal meruncing. Kulit buah

http://id.wikipedia.org/wiki/Nglumut,_Srumbung,_Magelang

http://id.wikipedia.org/wiki/Merapi

http://id.wikipedia.org/wiki/Srumbung,_Magelang

http://id.wikipedia.org/wiki/Kabupaten_Magelang

http://id.wikipedia.org/wiki/Jawa_Tengah


commit to user

12

bersisik tersusun seperti genting pendek dan berwarna cokelat kekuningan.

Dinding kulit bagian dalam berserat dan berdaging putih kekuningan.

Buah muda berasa manis keasaman dan setelah tua berasa manis. Jumlah

biji dalam setiap buah antara 2-3, biji berwarna kecokelatan, keras, dan

terdapat sisi cembung serta datar. Ukuran buah cukup besar, panjang

antara 2,5-8 cm dan berat sekitar 70 g/buah. Jumlah buah per tandan antara

10-50 buah (Nandariyah, 2007).

Salak Pondoh Super berasal dari Kabupaten Sleman memiliki kulit

buah berwarna coklat kekuningan dengan daging buah berwarna coklat,

tebal, rasa manis, renyah dan masir. Buah berbentuk memanjang dan

berukuran besar, tiap kilogram berisi 9-11 butir buah, memiliki kulit

bersisik yang tersusun rapi seperti genteng dan berduri halus serta biji

berwarna coklat kehitaman (Nandariyah, 2007).

Salak Pondoh Manggala juga berasal dari Kabupaten Sleman

memiliki kulit buah berwarna coklat kekuningan dan sisik pada bagian

pangkal kulit buah tersusun membentuk lorek (ada warna putih diantara

sisik) serat daging buah berwarna putih susu.

Salak Madu adalah salah satu salak unggulan Kabupaten Sleman

yang memiliki produktivitas tinggi, berkualitas cukup baik, daging buah

tebal dengan tekstur lembut dan rasa manis spesifik seperti madu. Salak

madu memiliki ciri kulit dengan sisik yang tersusun teratur membentuk

garis lurus dari bagian bawah buah ke ujung pada salah satu sisi. Salak

madu memiliki ciri yang berbeda dengan salak pondoh dan salak gading.

Salak madu memiliki kulit dengan sisik yang tersusun teratur membentuk

garis lurus dari bagian bawah buah ke ujung salah satu sisi, sedangkan

salak pondoh dan gading memiliki kulit buah dengan sisik yang tersusun

seperti susunan genteng. Keunggulan salak madu adalah apabila daging

dipencet dengan jari akan keluar cairan seperti madu. Salak madu

memiliki bobot yang lebih tinggi dibanding salak pondoh dan gading.

Namun demikian ketebalan daging buahnya hampir sama. Saat ini, ada

dua varian salak madu yang dikembangkan di Sleman, yaitu:


commit to user

13

1. Salak Madu Balerante, yang sudah dilepas sebagai varietas unggulan.

2. Salak Madu Sukomartani yang juga dikenal sebagai salak madu

probo.

Salak madu memang lebih enak dari salak pondoh super, apabila daging

buah dipencet dengan jari akan keluar cairan seperti madu, cairan ini tidak

dijumpai pada salak pondoh dan salak gading (Nandariyah, 2007).

B. Analisis RAPD-PCR

Metode RAPD-PCR merupakan kombinasi teknik PCR (Polymerase

Chain reaction) menggunakan primer-primer dengan sekuen acak untuk

keperluan amplifikasi lokus acak dari genom (Rafalski et al., 1991). Metode

ini mempunyai keunggulan pada kesederhanaan teknik dan pengerjaan cepat

(Hu dan Quiros, 1991), sehingga RAPD layak digunakan dalam suatu analisis

yang menggunakan jumlah sampel cukup besar dan dimanfaatkan dalam

upaya pemuliaan tanaman, genetika populasi, dan studi biodiversitas

(William et al.,1990; Yang dan Quiros, 1993). Penggunaan penanda RAPD

akan menguntungkan industri benih karena dapat meningkatkan efisiensi

identifikasi kultivar dan menurunkan biaya (Horejsi dan Staub, 1998). Untuk

tingkat DNA teknik RAPD yang didasarkan pada reaksi berantai oleh

polimerase merupakan analisis yang banyak dipakai karena disamping

mudah, cepat, dan memerlukan DNA dalam jumlah sedikit.

Informasi hubungan genetik antara individu di dalam dan di antara

spesies mempunyai kegunaan penting bagi perbaikan tanaman. Penentuan

hubungan genetik dari sumber plasma nutfah spesifik juga sangat berguna

untuk mennetukan galur atau populasi mana yang dapat dipertahankan guna

memaksimalkan keragaman genetik plasma nutfah. Dalam program

pemuliaan tanaman, pendugaan hubungan genetik sangat berguna untuk

mengelola plasma nutfah, identifiksi kultivar, membantu seleksi tetua untuk

persilangan, serta mengurangi jumlah individu yang dibutuhkan untuk

pengambilan sampel dengan kisaran keragaman genetik yang luas (Thorman

et al., 1994).


commit to user

14

1. PCR (polymerase chain reaction)

Penggunaan PCR diawali dengan ditemukannya DNA polimerase

dari Eschercia coli. Enzim yang dihasilkan dari E. coli ini bersifat sensitif

terhadap panas dan akan mudah rusak atau tidak aktif pada suhu yang

diperlukan untuk memisahkan DNA pita ganda. Oleh karena itu

dibutuhkan suatu enzim tertentu yang tahan panas pada suhu 940C agar

kedua rantai DNA cetakan terpisah.

Kajian keragaman genetik tanaman sangat erat berhubungan

dengan kajian tentang gen, DNA, dan kromosom. Seiring dengan

perkembangan teknologi molekuler modern maka pengetahuan tentang

DNA telah banyak dimanfaatkan dalam bidang biologi, kedokteran dan

pemuliaan tanaman pertanian. Suatu teknik amplifikasi potongan DNA

yang dikembangkan oleh Karry Mulis pada tahun 1985 yang telah banyak

digunakan dalam analisis genetik tingkat molekuler adalah metode

Polymerase Chain Raection. PCR adalah sebuah teknik biologi molekuler

untuk mereplikasikan DNA dengan menggunakan enzim Taq polimerase.

Sedangkan menurut (Newton dan Graham, 1997) PCR adalah suatu

metode amplifikasi DNA secara enzimatik terdiri dari serangkaian siklus

denaturasi DNA, penempelan dan pemanjangan primer pada DNA

cetakan berulang-ulang pada kondisi suhu yang disesuaikan. PCR

digunakan untuk amplifikasi bagian DNA yang pendek (sampai 10 kb).

Sejak ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1985, teknik ini telah

melahirkan teknik PCR-based marker teknik lainnya yang sangat

bervariasi. Protokol dasar PCR adalah:

DNA utas ganda denaturasi pada suhu 95°C sehingga membentuk

DNA utas tunggal yang berfungsi sebagai cetakan.

DNA utas tunggal yang pendek (disebut primer) berikatan dengan

DNA cetakan pada temperatur rendah. Ikatan primer terjadi pada utas

yang komplementer dengan cetakan pada daerah ujung batas sekuen

DNA target.


commit to user

15

Suhu ditingkatkan menjadi 72°C sehingga enzim DNA polymerase

dapat melakukan sintesis DNA membentuk utas ganda DNA baru.

Utas ganda DNA yang baru disintesis, didenaturasi pada suhu tinggi

dan siklus berulang.

Produk PCR diamati dengan gel elektroforesis dengan menggunakan

gel agarose ataupun gel poliakrilamida dan diamati dengan uv-

transiluminator.

Pada waktu melakukan amplifikasi, selama dua sampai lima siklus

amplifikasi terdiri dari beberapa tahapan, yaitu:

a. Tahap Denaturasi

Pada tahap pertama ini utas ganda molekul DNA akan terpisah

sempurna dan menghasilkan pita tunggal yang merupakan cetakan bagi

primer. Penyebab kegagalan PCR yang paling umum adalah

denaturasi yang tidak sempurna dari cetakan DNA (Innis dan Gelfand,

1980 dalam Sri kaidah, 1999). Suhu denaturasi biasanya 940C selama

30 detik atau 970C selama 15 detik. Denaturasi yang kurang sempurna

akan memacu benang DNA snabback dan mengurangi hasil produk

amplifikasi. Apabila denaturasi terlalu tinggi atau terlalu lama akan

menyebabkan kehilangan aktivitas enzim yang seharusnya tidak perlu

terjadi (Innis dan Gelfand, 1980 dalam Sri kaidah, 1999).

b. Tahap Annealling

Pada proses annealing suhu dan lama waktu tergantung pada

komposisi, panjang, dan konsentrasi primer. Pauls et al. (1993) dalam

Kaidah (1999) menyatakan bahwa suhu annealing dipengaruhi oleh

panjang, banyak G dan C dalam primer dan konsentrasi garam larutan

buffer. Adapun faktor- faktor tersebut mengikuti rumus berikut:

Tm = 81,5 + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) – (500/n)

Dimana : N adalah panjang primer dan M adalah konsentrasi molaritas

garam dalam larutan buffer. Temperatur annealing yang dapat dipakai

adalah 5 0C dibawah atau di atas Tm primer, sebab Taq polymerase


commit to user

16

aktif dalam selang temperatur yang cukup lebar (Taylor, 1992 dalam

Kaidah, 1999).

Temperatur annealing mempunyai selang antara 550

C-720

C.

Untuk kisaran temperatur antara 200

C dan 850C untuk primer 20-mer

sedangkan 340C - 40

0C untuk primer 10-mer (Uphoff dan Wricke,

1992 dalm Kaidah, 1999). Suhu annealing lebih rendah dari suhu

denaturasi yang bertujuan untuk memberikan kesempatan bagi primer

untuk menempel pada urutan komplemen yang ada dalam molekul

DNA target. Suhu annealing yang terlalu tinggi akan mempertinggi

misextention dari nukleotida. Sedangkan suhu annealing yang terlalu

rendah akan menimbulkan misincroporation nukleotida. Suhu

annealing merupakan variabel kunci yang menentukan kekhususan

amplifikasi suatu DNA.

c. Tahap Ekstensian

Pada tahap ekstension temperatur bergantung pada panjang dan

konsentrasi dari susunan DNA target. Perpanjangan primer terjadi

pada suhu 720

C karena pada suhu ini enzim Taq polymerase bekerja

optimal untuk sintesis DNA. Dalam tahapan ini suhu dipertahankan

pada suhu 720

C selama 5 menit untuk member kesempatan terjadi

sintesis DNA (Innis dan Gelfand, 1990 dalam kaidah 1999).


commit to user

17

Gambar 1. Prinsip amplifikasi fragmen DNA dengan mesin PCR

Metode RAPD mampu mendeteksi sekuen nukleotida dengan

hanya menggunakan satu primer. Primer tersebut akan berikatan

dengan utas DNA pasangannya dengan arah orientasi yang

berlawanan. Selama penempelan primer masih berada dalam jarak

yang masih dapat diamplifikasi, maka akan diperoleh produk DNA

amplifikasi (Tingey et al., 1992; Weising et al., 1995; Hayati, 1999).

Pelaksanaan amplifikasi DNA dengan menggunakan reaksi PCR

diketahui bahwa hasil akhir sangat ditentukan oleh banyak faktor

seperti konsentrasi DNA cetakan, ion magnesium, Dntp, Taq

polymerase, jenis dan konsentrasi primer, serta kondisi yang

diprogramkan terhadap mesin yang digunakan. Meskipun secara

prinsip hampir sama, namun berbeda kondisi untuk setiap faktor

tersebut.


commit to user

18

2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Salah satu teknik molecular marker yang menggunakan PCR

adalah Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD). Metode RAPD

merupakan pengembangan teknik PCR untuk mendeteksi keragaman

genetik atau mengidentifikasi jenis dengan mengamplifikasi potongan

DNA spesifik yang berkomplementer dengan cetakan DNA. RAPD

bertujuan untuk menghasilkan banyak copy dari DNA cetakan. Potongan-

potongan acak yang umumnya berukuran antara 250-2000 pasangan basa

diamplifikasi menggunakan thermocycle dengan primer tunggal, yang

berukuran 10 pasangan basa.

Metode standar RAPD menggunakan oligonukleotida tunggal

pendek (10-12 basa) dengan urutan acak sebagai primer untuk

mengamplifikasi genomik DNA dalam jumlah nanogram dengan

temperatur annealing yang rendah. Produk amplifikasi PCR dipisahkan

dengan agarose gel diwarnai dengan ethidium bromide. Primer decamer

secara komersial tersedia di berbagai sumber (misalnya Operon

Technologies Inc., Alameda, California atau University of British

Columbia, Canada). Analisis RAPD berbeda dengan kondisi PCR standar

dimana hanya menggunakan satu primer dan tidak memerlukan informasi

sekuen DNA awal (Nandariyah, 2007).

Pada temperatur annealing yang tepat selama siklus thermal,

oligonukleotida primer dengan urutan sekuen acak berikatan pada

beberapa priming site pada sekuen komplementer pada template DNA

genomik dan menghasilkan produk jika priming site berada dalam

wilayah/jarak yang dapat diamplifikasi. Profil amplifikasi DNA

tergantung pada homologi sekuen nukleotida antara template/cetakan

DNA dengan oligonucleotide primer. Variasi nukleotida antar template

DNA menghasilkan ada tidaknya band karena perubahan priming site.

Penggunaan teknik RAPD terus berkembang dan mencapai banyak

kemajuan. Beberapa penelitian yang memanfaatkan RAPD telah

dilaporkan antara lain pada tanaman strawberi, gandum, barley, oat,


commit to user

19

tomat, kentang, dan jagung (Newton and Graham,1997). Setiyo Eko

(2001) menggunakan RAPD untuk pemetaan dan keragaman genetik

kelapa sawit. Hayati (1999) telah meneliti penggunaan penanda RAPD

untuk mendeteksi keragaman genetik kelapa genjah di Jombang.

Dwiatmini (2002) menggunakan penanda RAPD untuk analisis

pengelompokan dan hubungan kekerabatan spesies anggrek

Phalaenopsis. Septimayani (2002) meneliti keragaman genetik blewah

(Cucumis melo L). Sedangkan Robi’ah (2004) menggunakan penanda

RAPD untuk menganalisis keragaman genetik pisang introduksi (Musa

spp). Apriyani (2005) memakai teknik RAPD untuk analisis keragaman

buah nanas. Galingging (2005) memanfaatkan penanda RAPD untuk

menganilis keragaman buah pepaya. Sedangkan Pandin (2000)

menggunakan RAPD untuk mengetahui kemiripan genetik populasi

kelapa. Identifikasi keragaman kultivar tanaman jeruk berdasarkan

penanda RAPD dilakukan oleh Karsinah et al. (2002). Mansyah et al.,

(2003) memanfaatkan teknik RAPD untuk analisis keragaman genetik

manggis (Garcinia mangostana L). Sedangkan Nurhaimi dan Darusamin

meneliti penggunaan penanda RAPD untuk mendetekasi dan

mengelompokkan klon kelapa sawit yang berbuah normal dan abnormal

(Nurhaimi dan Darusamin, 1997).

3. Aplikasi analisis RAPD

Teknik RAPD yang sederhana memerlukan biaya lebih murah

sehingga aplikasi yang sangat luas dari RAPD pada berbagai area biologi.

Beberapa area tersebut antara lain: Kemampuan RAPD mendeteksi

variasi intra-specifik dapat digunakan untuk melakukan screnning untuk

tingkat inbreeding pada tanaman komersial untuk mencegah peningkatan

frekuensi alel resesif yang merugikan dalam populasi.

Marker species-specific digunakan dalam inter-specific gene flow

dan identifikasi hybrid. Sama halnya dengan marker population-specific

akan bermanfaat dalam identifikasi populasi hibrid. Marker RAPD lebih

cocok untuk organisme klonal dibandingkan organisme yang


commit to user

20

bereproduksi secara seksual. Karena bereproduksi secara aseksual, maka

fragmen polimorfik antar individual dapat digunakan untuk menentukan

identitas klonal.

Walaupun metode RAPD relatif cepat, murah dan gampang

dilaksanakan dibandingkan metode marker DNA lain, berita tentang

konsistensi/reproducibility menjadi perhatian sejak teknik ini

diperkenalkan. RAPD sangat sensitif terhadap perubahan kondisi reaksi

PCR. Problem reproducibility/konsistensi biasanya terjadi pada band/pita

dengan intensitas yang rendah. Hal ini mungkin terjadi karena primer

tidak cocok secara sempurna pada sekuen priming site, amplifikasi pada

beberapa siklus mungkin tidak terjadi sehingga band tetap samar.

4. Isolasi DNA

Isolasi merupakan pemisahan materi dari materi lain untuk di

identifikasi. Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai

sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga,

kalus, akar batang, daging. Bahan isolasi DNA tanaman yang diisolasi

dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit

sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA

dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi

DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk

melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding

sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi

tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran

kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA

tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi

DNA dengan PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki kandungan

kitin (seperti serangga), memerlukan teknik dan metode khusus untuk

menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel

(Nandariyah, 2007).

5. Elektroforesis


commit to user

21

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah

medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang

mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan

dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul,

misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan

negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik

dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul

tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan

gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya

serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat

dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar

elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah

medan listrik.

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan,

mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Elektroforesis gel

merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam

bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip

dengan kromatografi, memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan

perbedaan sifat. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap

campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda. Dalam

elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan

fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek yang akan

dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan

dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak

untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan

negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis gel.

Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom-kolom (disebut well

atau "sumur") pada sisi elektrode negatif. Apabila aliran listrik diberikan,

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Komponen&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/wiki/Molekul

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Muatan&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/wiki/Migrasi

http://id.wikipedia.org/wiki/Medan_listrik

http://id.wikipedia.org/wiki/Medium

http://id.wikipedia.org/wiki/Makromolekul

http://id.wikipedia.org/wiki/DNA

http://id.wikipedia.org/wiki/Kutub

http://id.wikipedia.org/wiki/Gaya_Lorentz

http://id.wikipedia.org/wiki/Biokimia

http://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekular

http://id.wikipedia.org/wiki/Kromatografi


commit to user

22

terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak dari elektrode negatif

ke arah sisi elektrode positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda,

tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi

sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih

lambat berpindah.

Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan mulekul

bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh

medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau

poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan

fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan

secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat

memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis

poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA

(sekuensing).

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam

sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutup

negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer

yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju migrasi

DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA.

Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA.

Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat

dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu

memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk

visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk

diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan

kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan

dengan membandingkannya dengan pita DNA standar (Anonim, 2012).


commit to user

23

C. Hipotesis

Hipotesis penelitian ini dapat disusun sebagai berikut:

1. Keragaman kultivar salak pondoh dan non pondoh dapat diklasifikasikan

dengan penanda RAPD-PCR.

2. Terdapat hubungan kekerabatan secara genetik pada kultivar salak pondoh

dan non pondoh berdasar penanda RAPD-PCR.


commit to user

23

BAB. III

METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April – Mei 2012 di CV.

Agribiotech dan Laboraturium Fisiologi dan Bioteknologi Fakultas Pertanian

Universitas Sebelas Maret Surakarta.

B. Bahan dan Alat Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tanaman salak

varietas pondoh dan non pondoh. Sampel yang diteliti sebanyak dua puluh

dua kultivar yang dibedakan:

1. Kultivar salak non pondoh: Salak Saratan (magelang), salak Bejalen

(Ambarawa), salak Kecandran (Salatiga), salak Gading (Sleman), salak

Nglumut (Magelang), salak Kelapa bali (Bali), salak Gula pasir, salak

Kediri, salak Madura, salak Manggala, salak Engrekang, salak

Lumajang, salak Thailand, salak Banjar, salak Merah, salak Suaru, dan

salak Tasik.

2. Kultivar salak pondoh: Salak Pondoh Super, Pondoh Hitam, Salak

Pondoh Madu (Sleman D.I. Yogyakarta), Pondoh Lawu (Jawa

Tengah), Salak Kembang arum (Sleman), dan pondoh Hijau.

Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam analisis DNA total dengan

RAPD-PCR ada dua metode yaitu CTAB dengan buffer dan Dynamid Plant

Kit. Bahan- bahan yang digunakan isolat DNA total adalah: Dynamid plant

kit yang terdiri atas 3 jenis larutan yang terdiri atas larutan LA (lisis Acid),

PA (Protein acid) dan CA (Capture Acid), akuades steril, etanol absolut,

alkohol 70%, agarosa 1%, megamix blue, good view II sebagai pewarna,

loading dyne sebagai pemberat dan primer. Primer yang digunakan sebanyak

3 macam yaitu OPA-11, OPA-16, dan OPA-17. Sebanyak 1 kb Ladder

Gibco, BRL digunakan sebagai penanda, dengan buffer TBE 1X (tris acetic

acidEDTA) dan TE pH 8. Bahan-bahan yang digunakan untuk isolat DNA


commit to user

24

total dengan metode CTAB adalah larutan buffer reaksi, TAE 1X,

Chloroform, 2,5 M sodium asetat, Isopopanol, Aquades steril dan etanol 70%.

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah mortal dan pistil, gunting,

ice box, kertas label, tabung eppendorf 1,5 ml, pipet mikro Eppendorf (10-

100 µl, 100-1000 µl, dan 2-10 µl), pipet tetes, Erlenmeyer, spatula, tabung

eppendurf PCR, Centrifugasi, water bath, tips Eppendorf (yellow tips dan

blue tips), frezer, Gelas ukur 500 ml, Elektroforesis neraca analitik (4

desimal), micro wave, cetakan agarosa dan sisiran, sumuran, transluminator

T 220V, mesin PCR (Thermocycler), Lampu UV, dan kamera digital makro.

C. Cara kerja Penelitian

1. Pengambilan sampel

Populasi tanaman salak yang digunakan untuk penelitian

laboratorium dengan mengambil 10 sampel daun sebagai sumber isolat

DNA. Sampel daun yang diambil adalah daun yang masih muda dari

bagian pucuk dan baru berkembang penuh. Daun diambil sebanyak 5-10

daun dari lokasi yang berbeda-beda. Setelah daun dipotong dari tangkai,

kemudian dimasukan dalam kantong plastik diberi label, agar tetap terjaga

kesegaran daun dimasukkan dalam coolbox/kotak pendingin yang berisi es

dan dapat disimpan pada alat pendingin -700C untuk kemudian dapat di

isolasi/ekstraksi.

2. Isolasi/ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan panduan dua metode yaitu

DNA plant kit (Shiraishi dan Watanabe, 1995) dengan modifikasi

pengurangan waktu dan kecepatan sentrifugasi yang dimaksudkan untuk

memperkecil kerusakan DNA (Nandariyah, 2007) dan CTAB. Sampel

diambil dari daun segar, diekstrak dengan menambahkan larutan LA

sebanyak 1000 µl, kemudian ditambah 500µl larutan PA Selanjutnya

sampel disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 5 menit.

Supernatan yang dihasilkan ditambahkan larutan CA dengan perbandingan

1:1 dari supernatan yang dihasilkan, selanjutnya disentrifugasi pada 10.000

rpm selama 10 menit. Dihasilkan pellet kemudian di angin-anginkan


commit to user

25

sebentar ditambahkan larutan TE pH 8 lalu sentrifugasi pada 5000 rpm

selama 5 menit. Sampel pellet DNA disimpan dalam suhu -200C.

Cetyl Trimethyl Ammonimum Bromide (CTAB) merupakan metode

umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman mengandung

banyak polisakarida oleh senyawa polifenol. CTAB merupakan detergen

yang berguna untuk melarutkan membran plasma sel dan membentuk

komplek dengan DNA. CTAB adalah detergen berkation membentuk

komplek presipitasi dengan DNA ketika konsentrasi NaCl dibawah 0,7 M.

Presipitasi DNA dari buffer CTAB dengan adanya etanol atau isopropanol

sering menghasilkan massa bergelatin dengan komposisi tidak diketahui,

DNA terlihat pada massa. Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA,

yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat

seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA dengan

metode CTAB dimulai dengan memanaskan buffer ekstraksi pada suhu

650C selama 15-30 menit, kemudian menimbang sampel daun seberat 0,20

gr dan memisahkan dari tulang daun beserta serat-serat, melumatkan

menjadi tepung halus dengan mortar dan memindahkan kedalam tabung

eppendurf 1,5 ml, menambahkan 1000 µl buffer ekstrak dan digojog

hingga homogen, kemudian menginkubasi dalam water bath pada suhu

650C selama 60 menit. Mengangkat tabung dari water bath dan

memasukkan ke alat centrifugasi dengan 11000 rpm selama 5 menit

(debris akan terpisah dari supernatan). Mengambil supernatan dengan

yellow tip (20-200µl) dan memindahkan ke tabung eppendurf yang lain.

Menambahkan 800 µl chloroform dan menggojog hingga homogen,

mencetrifugsi dengan kecerpatan 12000 rpm selama 10 menit, kemudian

mengambil cairan lapisan atas (supernatan) dan memindahkan ke

eppendurf yang lain. Menambahkan 50 µl Sodium Acetat 2,5M dan 650 µl

(perbandingan 1:1 dengan volume) isopropanol dingin mencampur hingga

homogen, mencentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 5 menit,

membuang hasil supernatan dan mengering anginkan pellet DNA yang


commit to user

26

telah terbentuk, kemudian menambahkan dengan etanol 70% sebanyak 70

µl, kemudian pellet DNA dapat disimpan pada suhu -20 0C.

3. Uji kualitas DNA

Kuantitas DNA diukur dengan menggunakan alat Spektrofotometer,

dengan cara memasukkan 2µl/100µl DNA dan sebagai pembanding 100 µl

aquadest ke dalam kufet pada alat spektrofotometer yang sudah diatur

dengan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kuantitas DNA diketahui

dari hasil pengukuran optical density (OD) 260/280. Kualitas DNA diuji

dengan melakukan elektroforesis gel agarosa dan divisualisai pada alat

foto polaroid merk MP4 Land Camera. Gel dibuat dengan cara melarutkan

0,20% (b/v) agarosa dalam larutan buffer TAE 1X, lalu dipanaskan dalam

micro wave selama 5 menit hingga larut semua. Setelah itu didinginkan

selama 10 menit, kemudian ditambah 2 µl goodView II dan dikocok

perlahan merata. Larutan tersebut lalu dituang kedalam cetakan gel yang

telah disiapkan. Sisir pembuat sumur diletakkan dengan jarak 0,5-0,1 mm

dari dasar cetakan. Gel dibiarkan memadat selama kurang lebih satu jam.

Gel yang telah memadat dimasukkan ke dalam bak elektroforesis

yang berisi larutan buffer TAE 1X yang sudah diberi Good View II sampai

seluruh gel terendam. Contoh DNA yang telah ditambah loading buffer

dimasukkan ke dalam lubang sumur yang ada pada gel. Elektroforesis

dilakukan pada voltage 100 volt selama kurang lebih 30 menit. Ekstraksi

DNA diulangi apabila DNA yang dihasilkan belum menghasilkan pita

yang jelas. Hasil eletroforesis dapat dilihat dengan UV transluminator.

4. Seleksi primer

Primer yang diseleksi terdiri dari OPA11, OPA16 dan OPA 17.

Primer diseleksi dari 7 macam primer yaitu: OP X-17, OP X-15, OPA-12,

OPA-18, OPA-11, OPA-16 dan OPA-17.


commit to user

27

Tabel 1. Jenis primer dan urutan nukleotida penyusunnya

No Primer Sekuens nukleotida (5’-3’)

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

OPA-11

OPA-16

OPA-17

OPX-17

OPX-15

OPA-18

OPA-12

CAATCGCCGT

AGCCAGCGAA

GACCGCTTGT

GACACGGACC

CAGACAAGCC

AGGTGACGGT

TCGGCQATAG

5. Amplifikasi DNA

Tahap I pra amplifikasi (denaturasi awal) selama 3 menit pada

temperatur 950C dilanjutkan tahap II adalah proses amplifikasi

berlangsung sebanyak 40 siklus, dimulai dengan pemisahan utas DNA

genom (denaturasi) pada temperatur 940C selama 1 menit, penempelan

primer (annealing) pada temperatur 370C selama 45 detik, pemanjangan

utas DNA (extension) pada temperatur 720C selama 1,5 menit, diakhiri

dengan tahap perpanjangan akhir (tahap III), pada temperatur 720C selama

5 menit (Nandariyah, 2008).

Primer yang digunakan untuk amplifikasi DNA (RAPD) terdiri dari

tiga macam primer: OPA-11, OPA-16, dan OPA-17 yang diseleksi dari 12

macam primer yaitu X-17, D-18, D-16, X-15, D-17, D-15, D-13, A-12, A-

18, OPA-11, OPA-16 dan OPA-17. Kuantitas DNA diketahui dari hasil

pengukuran optical density (OD) 260/280 dan kualitas DNA diketahui dari

hasil elektroforesis gel dan divisualisasi pada alat foto polaroid merek

MP4 Land Camera. Visualisasi pita DNA hasil amplifikasi dilakukan

dengan mengamati pita-pita DNA setelah dielektroforesis pada alat UV-

transilluminator (Hoefer) dan dilanjutkan pemotretan menggunakan tustel

Polaroid MP4 Land Cameradiafragma 8, jarak lensa 14,8 ketinggian 52,3

cm pada film polaroid 667.

6. Elektroforesis

Hasil amplifikasi DNA dipisahkan berdasarkan ukuran pasangan

basanya dengan teknik elektroforesis gel agarose (Sigma) 1% dalam buffer

TBE 1X dengan cara mengambil 12μl DNA hasil PCR diletakkan pada


commit to user

28

kertas parafin ditambah dengan 10μl marker DNA leader 1 kb. Running

dalam cetakan agarose selama 15 menit 100 volt.

7. Visualisasi hasil RAPD

Visualisasi pita DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan mengamati

pita-pita DNA setelah dielektroforesis pada alat UV-transilluminator

(Hoefer) dan dilanjutkan pemotretan tustel Polaroid MP4 Land Camera.

D. Analisis Data

Data yang diperoleh dari pemotretan gel hasil RAPD yang diharapkan

adalah pita-pita diksrit (tajam dan jelas) dengan ukuran tertentu dari masing-

masing nomor genotipe salak. Jarak pita diukur dari batas bawah sampai

batas atas yang masih nampak. Nomor pita diurutkan dari jarak pita terdekat

dengan batas bawah sumur. Setiap pita dianggap sebagai satu karakter dan

dinilai „1‟ bila terdapat pita dan „0‟ bila tidak ada pita. Pita DNA yang dinilai

adalah pita yang terlihat baik bersolusi tajam atau lemah. Berdasarkan ada

tidaknya suatu pita, disusun matriks data biner yang diturunkan menjadi

matriks persamaan (matriks jarak genetic). Untuk menentukan kesamaan

pasangan genotipe yang terdapat pada individu yang berbeda digunakan

rumus Nei dan Li sebagai berikut:

F = 2 n ab/ ( na + nb)

F adalah koefisien persamaan, nab adalah jumlah pita sama posisinya, baik

individu a dan b, na dan nb adalah jumlah pita masing-masing individu a dan b

Pada program NTSYS, data matriks dihitung melalui koefisien “Dice”

yang pada prinsipnya sama dengan rumus Nei dan Li, yakni:

Sb = 2a / n1 +n2

Untuk menghitung koefisien jarak data harus dikonversikan dengan ;

d = 1- S

d adalah jarak, dan S adalah nilai matrik persamaan yang dihitung dengan

rumus Nei dan Li.

Setelah didapatkan nilai d (koefisien jarak) untuk seluruh perbandingan

individu, kemudian disusun matriks jarak. Dari matriks jarak ini dapat


commit to user

29

dilakukan analisis cluster (pengelompokkan) secara manual dengan cara

dipilih nilai jarak paling kecil dalam jarak matriks, dua individu dibuat

cabang, dan cabangnya adalah setengah jarak tersebut, mengelompokkan dua

individu lainnya berdekatan dan membuat cabang dari setengah jarak

tersebut, dan antar cabang juga dibuat, sampai akhir terbentuk diagram

pohon. Dalam penelitian ini seluruh pengolahan data menggunakan program-

program dalam computer. Prosedur pengolahan data tersebut adalah sebagai

berikut:

1. Penyusunan data dalam bentuk data biner pada program Excel dengan

keluaran data berbentuk Formatted Text/ Space delimited (.prn)

2. Data dalam bentuk .prn dimasukkan dalam program Notepad, diubah

menjadi .dat.

3. Data berbentuk .dat dimasukkan dalam program Windisk dan diolah

menjadi data matrik (.mat)

4. Pemrosesan data, matriks menggunakan program NTSYS-pc, dengan

tahap: Data .mat dimasukan dalam analisis UPGMA dalam program Shan

clustering menghasilkan pengelompokkan data berdasarkan jarak genetik.

Hasil pengelompokkan dimasukkan dalam program Tree Display untuk

menghasilkan dendogram.

5. Untuk mendapatkan hasil cetakan yang baik, hasil analisis TreeDisplay

dipindahkan ke dalam program MS Word.

6. Pengujian validitas pengelompokkan dilakukan oleh NTSys, digunakan

analisis bootstrap didalam program WinBoot.

7. Presentase pengelompokkan yang dilakukan WinBoot dituliskan dalam

dendogram pada program MSWord.

8. Untuk mengetahui korelasi antar primer digunakan analisis Comparison

dalam program NTSys. Data yang dipakai berasal dari data .mat keluaran

data berupa nilai r (korelasi).

a. Analisis Similaritas

Analisis keragaman genetik menggunakan RAPD dilakukan dengan

memberi skoring 0 = tidak ada pita, 1= ada pita pada tingkat migrasi yang


commit to user

30

sama berdasarkan penanda RAPD, dan data diolah dengan NTSYS pc

versi 2.02 dengan proses Similarity for Qualitative Data ( SIMQUAL)

dan dihitung berdasarkan metode Simple Matching Coefficient (SM) dari

Sokal dan Sneath (Rohlf, F.J. 1998) dengan rumus sebagai berikut

SM = m/n

SM adalah koefisien similaritas, m adalah banyaknya data dengan pola

yang sama, dan n adalah jumlah data. Analisis keragaman genotipik

berdasarkan keragaman dianalisis dengan langkah: membuat matrik

karakter vs genotipe, data hasil skoring dalam sofware untuk analisis

keragaman, membuat dendogram hasil analisis gerombol. Data fenotipik

tersebut dianalisis dengan NTSYSpc versi 2.02.

b. Analisis gerombol (Cluster analysis)

Analisis gerombol (Cluster analysis) menggunakan metode

Sequential, Agglomerative, Hierarchical and Nested Clusthering (SAHN).

Setiap karakter diubah dalam bentuk data biner. Nilai 1 diberikan pada

subkarakter yang terdapat pada genotip dan yang tidak tampak diberi 0.

Pola pita DNA hasil amplifikasi pada tanaman akan menunjukkan jumlah

pita dan jarak migrasi. Penilaian dilakukan terhadap pita yang jelas dan

terang secara konsisten yakni skor nol (0) jika tidak ada pita dan satu (1)

jika ada pita pada posisi yang sama individu yang dibandingkan. Analisis

pengelompokan adalah berdasarkan kesamaan genetik yang disajikan

dalam bentuk dendogram sehingga dendogram yang dihasilkan adalah

analisis gerombol berdasarkan penanda genotipik.

Pengelompokan kluster ditampilkan dalam suatu dendogram.

Hubungan kekerabatan antar varietas salak ditentukan oleh nilai

persamaan yang dihubungkan dalam diagram fenetik. Data hasil

pengamatan dianalisis dan disajikan secara deskriptif. Data jumlah pita

DNA yang diperoleh dari hasil amplifikasi digunakan untuk penyusunan

matriks berdasarkan rumus koefisien korelasi Pearson (Gasperz (1992),

Nandariyah, 2007).


commit to user

31

BAB. IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Klasifikasi keragaman tanaman salak pondoh dan non pondoh

berdasarkan penanda molekuler RAPD

Pengklasifikasian pengelompokan kultivar salak pondoh dan non pondoh

yang dibedakan atas dasar kesamaan sifat-sifat atau tingkat kekerabatan

kelompok masing-masing. Penelitian dimulai dengan ekstraksi DNA dan uji

kualitas DNA hasil ekstraksi, menyeleksi primer untuk penanda RAPD,

amplifikasi DNA dengan teknologi PCR, elektroforesis hasil amplifikasi DNA,

analisis cluster data dan penggolongan kekerabatan berdasarkan RAPD dan

analisis diskripstif.

Keragaman genetik 22 genotipe ditentukan berdasarkan hubungan

kesamaan genetik antar genotipe tanaman salak yang berbeda dengan cara

membandingkan pita DNA hasil amplifikasi PCR dengan primer tertentu

pada setiap genotip tanaman. Hasil analisis kesamaan genetik dengan

menggunakan koefisien kesamaan genotipe dengan metode Nei dan Lei

(Kaidah, 1999).

1. Hasil isolasi dan uji kualitas DNA

1a). Isolasi DNA

Ekstraksi untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi merupakan

suatu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler,

terutama dalam pencandraan sidik jari DNA. Isolasi DNA dilakukan

dengan dua metode yaitu isolasi dengan Dynamid Plant Kit dan

metode CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide).

CTAB dan Dynamid Plant Kit merupakan metode yang umum

digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman. Keduanya

menggunakan teknik sentrifugasi dengan mengendapkan DNA agar

hasil isolasi berupa DNA murni tidak tercampur dengan molekul-

molekul yang lain, sedangkan bahan yang digunakan hanya sedikit


commit to user

32

berbeda. Teknik CTAB menggunakan buffer ekstraksi phenol, dapat

ditambah dengan chloroform dan isopropanol. Pada lapisan phenol

akan melarutkan lipid, polisakarida dan protein. Chloroform

merupakan pelarut yang menstabilkan ikatan antara lapisan organik

dan aquaeus (sampel DNA yng tertinggal). Metode Dynamid Plant

Kit menggunakan tiga bahan praktiks yang sudah ada dan dibuat dari

pabrikan, terdiri dari empat jenis bahan yaitu LA (Lisis Acid)

merupakan larutan resuspensi (buffer dan pengkelat), larutan PA

(Protein Acid) terdiri dari SDS dan NaOH (pelisis) dapat

mendenaturasi protein sedangkan CA berfungsi merenaturasi kembali

dan RNase untuk menghilangkan sisa-sisa RNA atau protein yang

masih tertinggal pada DNA. Sebagai dasar untuk analisis lanjutan

seperti PCR, RFLP, kloning atau sekuensing, maka DNA yang

digunakan harus bersih dari kontaminan (kemurnian tinggi) dan

memiliki berat molekul yang tinggi, selama proses ekstraksi beberapa

hal yang dapat terjadi:

a. DNA patah-patah selama proses isolasi

b. DNA terdegradasi oleh enzim nuklease

c. Terjadi kontaminasi oleh polisakadarida

d. Metabolit sekunder ikut terisolalsi (Fatchiyah et al., 2011)

Metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan,

dan purifikasi fragmen DNA adalah menggunakan elektroforesis gel

agarosa. Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi

oleh faktor ukuran dan konformasi molekul DNA, konsentrasi

agarosa, arus listrik dan suhu. Pewarna etidium bromida (EtBr)

maupun Good View II (GV II) digunakan sebagai alat identifikasi dan

mengukur semi kualitatif fragmen DNA yang terpisah dalam gel.

EtBr maupun GV II terikat diantara dua untaian ganda DNA,

sehingga pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar karena pewarna

ini mengandung zat fluoresen. Ikatan DNA–EtBr akan terekspos pada

sinar UV level medium, sekitar panjang gelombang 300 nm. EtBr


commit to user

33

diberikan pada setiap sampel yang dimasukkan dalam sumur gel

agarosa sebelum gel dicetak dalam cetakan gel.

1b). Uji Kualitas DNA

Metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan,

dan purifikasi fragmen DNA adalah menggunakan elektroforesis gel

agarosa. Selama proses pengeringan pellet DNA, disiapkan agarosa

1% (0,20 gram agarosa dalam 20 ml TBE 1x). Untuk proses

eletroforesis ditambahkan TE 70 µl pada pellet DNA lalu sentrifugasi,

diambil 5 µl DNA ditambhkan 2 µl blue Juice (BJ) 10x dan

running/elektroforesis pada tegangan 100 volt selama 30 menit. Hasil

elektroforesis kemudian dilihat pada UV transiluminator.

Gambar 1. Profil hasil uji kualitas tujuh sampel daun salak hasil

metode CTAB (Salak P. super, P. Lawu, P. Hijau, S.

Gading, Kb. Arum, Manggala, Lumut) dengan penanda

marker DNA 1 kb (250-10000 pb)

Hasil uji kualitas tujuh sampel DNA dengan elektroforesis

agarosa dari isolat DNA hasil isolasi dengan metode CTAB

menunjukkan bahwa masih terdapat protein atau RNA sehingga hasil

kualitas masih belum baik, belum menghasilkan DNA murni. Adanya

M 1 2 3 4 5 6 7

10000 1500 750 450 250


commit to user

34

RNA yang masih tercampur berupa garis berwarna merah kebawah.

Hal ini dikarenakan beberapa faktor yaitu ikut terbawa debris

(sampah) saat pengambilan supernatan dengan mikropipet, sehingga

debris masih dapat tercampur kedalam supernatan yang akan menjadi

isolat DNA, berpengaruh pada hasil DNA. Pada tahap akhir isolasi

tidak ditambahkan RNase untuk melisiskan RNA supaya hasil isolasi

berupa DNA murni, tidak tercampur oleh RNA sehingga isolat DNA

yang dihasilkan belum murni.

M 1 2 3 4

Gambar 2. Profil hasil uji kualitas DNA 4 sampel daun salak dengan

metode CTAB (S. Kecandran, Banjar, P.madu, P. Hitam)

dengan marker 1 kb (250-10000 pb)

Hasil elekroforesis menunjukkan dengan jelas posisi pita DNA

dari empat sampel DNA. Hasil eletroforesis pada percobaan

menghasilkan pita DNA pada bagian atas gel sedangkan pita RNA

pada bagian bawah gel (apabila pada waktu dilakukan running tidak

diberikan RNase). DNA mempunyai berat molekul lebih besar

dibandingkan dengan berat molekul RNase. Menurut Sambrook et

al. (1989) dalam Sri Kaidah (1999) kecepatan migrasi DNA

tergantung pada ukuran molekulnya. Sampel DNA hasil running

10000

7500

1500

750

250


commit to user

35

yang paling jelas terlihat terdapat pada sampel dua dan empat yaitu

salak banjar dan pondoh hitam. Namun dari ke empat sampel DNA

masih terdapat RNA. Hasil elektroforesis tidak dipotong dengan

enzim restriksi akan memberikan pita DNA yang utuh. Hal ini

menunjukkan bahwa semua isolat DNA dari daun salak mempunyai

kualitas yang baik sehingga layak digunakan dalam penelitian analis

DNA antara lain sebagai DNA cetakan untuk proses PCR.

M 1 2 3 4 5 6 7

Gambar 3. Profil hasil uji kualitas DNA dengan metode Plant kit dari

tujuh sampel DNA (S.Saratan, S.Bejalen, S.Gading,

S.Nglumut, P.Lawu, P.Madu, dan Kecandran,

menggunakan penanda marker 1 kb (250-10000 pb).

Hasil uji kualitas DNA dengan metode Dynamid Plant Kit

menghasilkan isolat DNA murni tanpa campuran RNA, berupa garis

tipis pada setiap sampel. Metode Dynamid plant kit dapat

membersihkan sisa debris atau sampah. Selain itu garis RNA sudah

tidak tampak seperti pada hasil isolasi dengan metode CTAB,

dikarenakan pada tahap akhir isolasi dilakukan penambahan RNase

untuk menghilangkan RNA yang masih menempel pada DNA. Untuk

hasil isolat DNA murni yang berkualitas baik.

1OOOO

1500

1000

750

250


commit to user

36

M 1 2 3 4 5 6 7

Gambar 4. Hasil uji kualitas tujuh sampel DNA (S.kembang arum, P.

Hitam, P.lawu, S. Nglumut, bejalen, P.Super, Kecandran,

gading) hasil isolasi dengan metode Dynamid Plant Kit.

Hasil uji kualitas DNA dengan metode Dynamid Plant Kit sudah

menghasilkan pellet DNA murni pada sampel satu hingga tujuh,

namun pada sampel satu varietas kembang arum masih terdapat RNA.

Sedangkan pada sampel tiga dan empat yaitu varietas p.lawu dan S.

nglumut sudah terdapat pellet DNA namun pita yang dihasilkan

sangat tipis (konsentrasi sangat sedikit) sehingga pada waktu PCR

konsentrasi harus ditingkatkan agar dapat amplifikasi dengan

sempurna.

2. Hasil seleksi primer

Seleksi primer dilakukan untuk mendapatkan primer yang dapat

mengamplikasi DNA. Dalam penelitian ini ada tujuh primer yang dipilih

secara random. Primer diseleksi dari dua belas macam primer yaitu: X-17,

X-15, A-12, A-18, OPA-11, OPA-16 dan OPA-17. Dari hasil penelitian

seleksi primer menunjukkan bahwa tidak seluruh primer yang digunakan

(tujuh primer) mampu mengamplifikasi setiap contoh genotipe salak. Hal

10000

7500

1500

750

250


commit to user

37

ini diduga tingkat kemurnian DNA template dari hasil bulking atau pooling

masih rendah atau masih terdapat senyawa kontaminan seperti polifenol

yang dapat menghambat terjadi reaksi PCR. Metode bulking atau pooling

untuk seleksi primer belum dapat menjamin hasil amplifikasi yang

diharapkan memperoleh pita-pita beragam atau polimorfis.

Jumlah pita DNA polimorfisme dalam analisis keragaman genetik

sangat menentukan dalam penentuan tingkat keragaman suatu populasi,

maka banyaknya pita DNA polimorfis akan menggambarkan keadaan

genom tanaman dan memperkecil bias yang disebabkan oleh tidak

terwakili bagian-bagian genom (Nienhuls et al., 1996) Primer yang

menghasilkan amplifikasi pita DNA yang sedikit dan polimorfis yang

rendah sebaiknya tidak digunakan untuk analisis keragaman genetik

dengan metode RAPD.

M 1 2 3 4 5 6

Gambar 5. Hasil uji seleksi Primer OPA-11, OPA-17, OPA -16, OPX-17, OPX -

15, dan OPA- 18.

Dalam pemilihan primer sebaiknya primer- primer yang menghasilkan

amplifikasi pita DNA yang sedikit dan polimorfis yang rendah tidak

digunakan untuk analisis keragaman genetik dengan metode RAPD.

10000 7500 5000 750 250


commit to user

38

3. Hasil amplifikasi DNA dengan penanda RAPD

Penanda RAPD adalah penanda yang bersifat dominan yang berarti

sifat tersebut tidak dapat dibedakan antara genotip heterosigot dengan

homosigot tetapi dapat dibedakan terhadap sifat resesif dengan cara

mendeteksi ada tidak pita DNA (Rafalski et al. 1994 dalam Nandariyah,

2007).

Secara umum analisis RAPD menunjukkan pola pita fragmen DNA

yang baik berdasarkan tinggi konsistensi profil pita DNA antara tahap

skrening primer dan tahap penggenotipan populasi pemetaan. Menurut

Waugh (1997) banyak faktor yang mempengaruhi reproducibility profil

RAPD, antara lain kondisi dan konsentrasi DNA, ko-ekstraksi

pengkontaminasi DNA dan interferensi amplikasi.

Persentase pita RAPD polimorfik pada beberapa penelitian keragaman

genetik menunjukkan rata-rata tiap populasi sebesar 69% pada kelapa

(Hayati et al., 2000) dan 56 % pada kelapa sawit (Rajanaidu, Maizura dan

Cheah, 2000). Faktor yang menyebabkan perbedaan ini adalah jumlah dan

jenis primer dan populasi yang digunakan. Berdasarkan tipe populasi yang

digunakan, Rajanaidu et al. (2000) menunjukkan selang persentase

polimorfik 8-94%, yang lebih besar dari Hayati et al. (2000) 62-76%.

a). Amplifikasi DNA menggunakan primer OPA-11

Amplifikasi DNA 3 kultivar salak menghasilkan pita DNA

perkultivar 1-3 pita. Amplifikasi DNA terhadap kultivar kembang arum

menggunakan primer OPA-11 menghasilkan tiga pita.


commit to user

39

Gambar 6. Hasil amplifikasi PCR varietas salak (kembang arum,

manggala, kecandran) dengan primer OPA-11 metode

RAPD menghasilkan 3 pita monomorfik.

Hasil PCR dengan metode RAPD menghasilkan resolusi pita DNA

yang tidak terlihat dengan jelas. Perbedaan hasil resolusi dapat

disebabkan oleh fragmen yang diamplikasi terdapat pada genom

tanaman. Makin banyak fragmen DNA yang teramplifikasi, maka

resulosi pita DNA yang dihasilkan akan semakin jelas. Pada genom

tanaman lebih kurang 90% dari DNA genom merupakan urutan

berulang (Weising et al., 1995). Disamping itu, adanya kompetisi

tempat penempelan primer DNA menyebabkan salah satu fragmen akan

diamplifikasi dalam jumlah yang banyak dan fragmen lainnya sedikit.

Proses amplifikasi mungkin diinisiasi pada beberapa tempat, namun

hanya beberapa set yang dapat terdeteksi sebagai pita sesudah

amplifikasi (Grattapagtia et al., 1992; Hallden et al., 1995; Sri kaidah,

1999). Faktor lain adalah kemurnian dan konsistensi cetakan DNA,

DNA yang memiliki tingkat kontaminasi yang tinggi dari senyawa-

senyawa seperti polisakarida dan polifenol, dan konsentrasi cetakan

DNA yang terlalu kecil sering menghasilkan penanda RAPD yang

kabur atau redup (Weeden et al., 1992; Halide et al., 19996; Sri kaidah,

1999).

M 1 2 3

10000 1100 750 450 250


commit to user

40

Jumlah pita polimorfis sangat menentukan tingkat keragaman

keadaan genom tanaman. Perbedaan jumlah polimorfisme pita DNA

yang dihasilkan oleh setiap primer menggambarkan kompleksitas

genom tanaman. Sedangkan untuk contoh yang dipergunakan dalam

seleksi primer mengidentifikasi bahwa primer acak tidak universal

untuk mendeteksi perbedaan setiap contoh DNA cetakan.

b). Amplifikasi DNA menggunakan primer OPA-16

M 1 2 3 4 5 6 7

Gambar 7. Profil hasil amplifikasi PCR varietas salak (P. Madu,

P.hitam, dan Kembangarum) dengan primer OPA-16 yang

tidak berhasil amplifikasi.

Pada hasil amplifikasi PCR varietas salak diatas tidak dapat

mengamplifikasi dengan baik. Hal ini dapat dikarenakan primer

yang mengamplifikasi tidak sesuai sehingga tidak dapat terbentuk

pita DNA. Faktor lain yang dapat menyebabkan kegagalan

amplifikasi dikarenakan konsentrasi isolat DNA yang terlalu pekat

ataupun terlalu encer. Pada konsentrasi yang terlalu pekat, DNA

tidak dapat memisah yaitu pada saat fase denaturasi awal, dan pada

saat suhu mulai turun pada fase anealling DNA tidak berhasil

memisah. Sedangkan pada konsentrasi yang sedikit DNA akan sulit

10000

7500

750

500

250


commit to user

41

menggambung dengan primer karena konsetrasi yang ringan,

sehingga gagal untuk menggabung pada saat anealling.

c). Amplifikasi DNA menggunakan primer OPA-11

Gambar 8. Profil hasil amplifikasi DNA dua puluh dua kultivar S.zalacca

menggunakan primer OPA-11: L. 1Kb Ladder; . var. 1; var. 2;

var. 3; var. 4; var. 5; var. 6; var. 7; var. 8; var. 9; var10; var 11;

var 12; var 13;var 14; var 15; var 16; var 17; var 18; var 19; var

20; var 21; dan var 22.

Hasil amplifikasi dua puluh dua kultivar salak diatas menghasilkan

susunan dan jumlah pola pita yang berbeda-beda. Hasil analisis

kekerabatan dua puluh dua varietas salak menggunakan pendekatan

RAPD-PCR menunjukkan adanya jarak dan variasi genetik antar varietas.

Sampel yang memiliki hubungan kekerabatan paling dekat adalah varietas

3, 5 dan 9. Varietas 3, 5, dan 9 membentuk suatu kelompok. Varietas 7 dan

17 membentuk kelompok sendiri dan memiliki kedekatan dengan varietas

14, varietas 1 dan 8 membentuk kelompok sendiri dan mempunyai

hubungan kekerabatan sedang varietas 2, 12, 13, 15, 20, 21, dan 22

terpisah dari ketiga kelompok di atas, artinya varietas 2, 12, 13, 15, 20,

21, dan 22 memiliki hubungan kekerabatan paling jauh dengan varietas-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22


commit to user

42

varietas yang lain. Analisis dengan metode ini menunjukkan adanya

variasi genetik yang cukup tinggi pada sembilan varietas yang diuji. Dari

hasil amplifikasi DNA diatas ada beberapa varietas yang gagal

mengamplifikasi yaitu varietas 4, 6, 10, 11, 16, 18, dan 19. Kegagalan

tersebut disebabkan karena primer yang digunakan tidak ada kecocokkan

lokus untuk amplifikasi sehingga akan terjadi kegagalan.

Dari kedua puluh dua hasil amplifikasi kultivar salak hanya dihasilkan

lima belas pita DNA yang berhasil amplifikasi. Diantara kelima belas

kultivar yang berhasil amplifikasi pola pita DNA yang paling banyak

muncul terletak pada pola pita pada pasangan basa 400 pb dengan kualitas

pola pita tebal dan jelas. Jumlah pita polimorfik yang terbanyak terdapat

pada kultivar no. 15 dan no. 13 yaitu pada kultivar salak kecandran dan

salak banjar.

d). Data hasil running varietas salak pondoh dan non pondoh

berdasarkan kekerabatan dengan OPA -11

1. Eletroforesis 22 varietas salak

Gambar 9. Hasil Running elektroforesis 22 varietas salak

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 M

100 pb


commit to user

43

Keterangan gambar:

M : Marker DNA 1 kb

( 100 pb- 2000kb)

1 : Kelapa bali

2 : Gula pasir

3 : Kediri

4 : P.super (kosong)

5 : P.hitam 2

6 : Gading (kosong)

7 : P. Madu

8 : Manggala

9 : Madura

10 :Engrekang (kosong)

11 : Lumajang (kosong)

12 : Thailand

13 : Banjar

14 : Bejalen

15 : Kecandran

16 : Saratan (kosong)

17 : P. Lawu

18 : P. Hijau (kosong)

19 : Lumut (kosong)

20 : Merah

21 : Suaru

22 : Tasik

2. Elektroforesis 15 varietas salak yang berhasil amplifikasi

Gambar 10. Hasil amplifikasi 22 kultivar salak dengan RAPD

Keterangan :

M : Marker DNA 1 Kb (100 pb)

1 : Kelapa bali (2 pita)

2 : G. pasir (6 pita)

3 : Kediri (4 pita)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M

100 pb


commit to user

44

4 : P.hitam 2 (7 pita)-> no. 5

5 : P. Madu (3 pita)-> no. 7

6 : Manggala (1 pita)-> no. 8

7 : Madura (6 pita)-> no. 9

8 : Thailand (1 pita)-> no. 12

9 : Banjar (6 pita)-> no. 13

10 : Bejalen (2 pita)-> no. 14

11 : Kecandran (7 pita)-> no. 15

12 : P. Lawu ( 1 pita )-> no. 17

13 : Merah (3 pita) -> no. 20

14 : Suaru (2 pita)-> no. 21

15 : Tasik (2 pita) -> no.2

3. Pengelompokkan hasil elektroforesis berdasarkan kesamaam pola pita

Gambar 11. Profil pola pita hasil amplifikasi no. 1 dan no. 6 mempunyai

kesamaan pola pita dengan jumlah pita sama yaitu 2 pita.

Terdapat pada var.kelapa bali dan manggala. Terletak pada

pasangan basa antara 300pb-400pb.

Kesamaan pola pita pada hasil elekroforesis ditunjukkan pada pita no. 1

dan no. 6 yaitu pada salak kelapa bali (1) dan manggala (6) menunjukkan

pola pita dan jumlah yang sama satu pita yang jelas dan tajam dan satu pita

kurang jelas dan tajam. Keduanya terletak antara 300 pb - 400 pb. Pola pita

yang sama menunjukkan kedekatan atau kekerabatan. Dalam hal ini antara

salak kelapa bali dan manggala mempunyai hubungan kekerabatan yang

dekat secara genetik.

M 1 6


commit to user

45

Gambar 12. Profil hasil amplifikasi kultivar no.3 dan no.4 mempunyai

kesamaan pola pita yang terletak antara 100 pb-400 pb, yaitu

Kediri (3) dan p.hitam (4).

Pada gambar diatas menunjukkan dua kultivar yang mempunyai

hubungan kekerabatan yang dekat antara no. 3 dan no. 4 yaitu pada kultivar

salak Kediri (3) dan salak pondoh hitam (4). Hal ini ditunjukkan pada jumlah

pita dan susunan yang sama dan terletak pada pasang basa yang sama. Pada

kultivar salak Kediri terletak antara 100 pb - 400 pb menghasilkan pola pita

tunggal sebanyak 3 pita dengan kualitas pita yang tajam atau lemah.

Sedangkan pada kultivar salak pondoh hitam juga menghasilkan 3 pola pita

dan terletak pada pasangan basa yang sama yaitu antara 100 pb - 400 pb.

Namun yang membedakan antara kedua kultivar tersebut yaitu pada pita

kedua yang terletak antara 200 - 300 pb, pada kultivar salak Kediri

menghasilkan pola pita tunggal monomorfik sedangkan pada kultivar salak

pondoh hitam menghasilkan pola pita ganda polimorfik. Diketahui bahwa

antara kultivar salak kediri yang bukan varietas non pondoh dengan kultivar

pondoh hitam mempunyai hubungan kekerabatan yang dekat, dalam hal ini

juga dapat diketahui dari ciri-ciri morfologis keduanya. Salah satunya adalah

rasa buah dari salak kediri yang manis dengan warna kulit buah gelap seperti

pada salak pondoh hitam.

M 3 4


commit to user

46

Gambar 13. Profil hasil amplifikasi kultivar no. 5, 8, 10, dan 12 mempunyai

pola pita sama yang terletak antara 300 pb-500 pb dengan pola

pita tunggal, terdapat pada salak pondoh madu, Thailand, bejalen,

dan pondoh lawu.

Hasil amplifikasi diatas menunjukkan terdapat empat kultivar salak

yang mempunyai hubungan kedekatan secara genetik. Ditunjukkan pada pola

pita dan susunan pita polimorfis yang sama dari keempat kultivar. Keempat

pita polimorfis terdapat diantara 300 pb - 500 pb dengan kualitas pita tebal

atau samar-samar. Pada pola pita no. 1 yaitu kultivar salak pondoh madu,

menunjukkan pola pita yang tebal dan jelas, hal ini sama dengan pola pita no.

4 pada kultivar pondoh lawu. Sedangkan pola pita dengan kualitas yang

kurang jelas namun masih dapat terbaca ada pada no. 2 yaitu kultivar

Thailand, terletak pada pasang basa yang sama dengan no.1 dan no.4.

Kultivar no. 3 yang ditunjukkan pada gambar yaitu salak bejalen, terletak

pada 300 pb dan mempunyai hubungan kedekatan dengan ketiga pita lainnya.

Antara kultivar salak pondoh madu dan salak pondoh lawu juga mempunyai

hubungan kekerabatan yang dekat dalam hal morfologis, keduanya

mempunyai rasa manis tidak sepat, namun salak pondoh lawu tidak

mempunyai aroma khas seperti pada salak pondoh madu. Salak pondoh madu

dan salak lawu mempunyai hubungan kekerabatan dekat dengan salak lokal

kultivar thailand dan bejalen. Dilihat dari ciri morfologis dengan rasa buah

yang sama-sama manis tidak sepat. Salak thailand merupakan sebutan salak

pondoh dari indonesia dipasarkan dan di ekspor ke mancanegara. Salak

M 1 2 3 4 M

500 pb

300 pb


commit to user

47

pondoh madu dari segi morfologis mempunyai aroma khas seperti madu dan

pada buah keluar cairan seperti madu. Kekerabatan yang dekat antara kultivar

diatas karena lokasi tumbuh yang berdekatan.

Gambar 14. Profil hasil amplifikasi pita DNA no.9 dan no. 11 mempunyai

kesamaan pola pita yang sama yang terletak antara 300 pb – 600

pb pada salak banjar dan kecandran.

Hasil amplifikasi diatas menunjukkan dua pita DNA hasil PCR

menghasilkan pola pita polimorfis dengan susunan pita yang sama antara

kultivar no.9 dan no.11 yaitu pada salak banjar dan salak kecandran. Kedua

pita terletak pada pasang basa yang sama antara 300 pb-600 pb. Pada kultivar

salak banjar dihasilkan 6 pola pita tunggal dan ganda. Sedangkan pada

kultivar kecandran juga dihasilkan 6 pita baik tunggal maupun ganda. Dari

hasil diatas diketahui bahwa kedua kultivar tersebut mempunyai hubungan

kekerabatan yang dekat dengan ditandai susunan dan jumlah pita yang sama

secara genetik. Antara kultivar salak kecandran dan salak banjar mempunyai

hubungan kekerabatan yang dekat, dikarenakan keduanya sama-sama

merupakan salak lokal yang dibudidayakan oleh masing-masing daerah. Dari

segi morfologis keduanya mempunyai rasa kurang manis dan agak sepat.

Ukuran buahnya sama- sama besar dan pada kulit buah sedikit duri.

M 9 11 M


commit to user

48

No. 2 no. 7 no. 13 no. 14 no. 15

Gambar 15. Profil hasil amplifikasi Salak Gula pasir, Madura, Merah, Suaru

dan tasik berdiri sendiri tidak ada kesamaan dengan pola pita

yang lain. Masing-masing berdiri sendiri.

Dari hasil amplifikasi lima kultivar salak Gula Pasir, Salak madura,

salak merah, salak suaru, dan salak tasik masing-masing pita berdiri sendiri

tidak ada kesamaan pola pita dengan kulitivar lainnya dalam hasil photo

running. Hal ini menunjukkan bahwa diantara kultivar salak diatas

mempunyai hubungan kekerabatan yang jauh.

Pada kultivar salak gula pasir (no.2) dihasilkan empat pola pita DNA

dengan kualitas pola pita tebal atau lemah dengan pola pita tunggal dan

terletak pada susunan basa antara 200 pb-450 pb. Pada kultivar salak madura

(no.7) menghasilkan enam pita DNA yang terletak antara 150 pb - 600 pb

dengan kualitas pita tajam atau lemah. Pola pita yang terletak antara 300 pb –

600 pb dan menghasilkan tiga susunan pita DNA dihasilkan pada kultivar

salak Merah (no.13). Sedangkan untuk kultivar no.14 dan no.15 yaitu salak

suaru dan salak tasik menghasilkan masing-masing dua susunan pola pita

dengan kualitas pita yang lemah, namun masih dapat terbaca. Diantara kelima

kultivar tersebut susunan pola pita yang paling banyak muncul ada pada

susunan basa 400 pb untuk kultivar salak Gula Pasir dan salak madura.


commit to user

49


commit to user

49

BAB. V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan, dapat disimpulkan

sebagai berikut:

1. Isolasi/Ektraksi DNA salak dengan metode Dynamid Plant Kit dapat

menghasilkan isolat DNA salak murni bila dibandingkan dengan

motode CTAB. Hasil uji kualitas DNA salak yang di isolasi dengan

CTAB (cetylmetil amonium bromida) masih terdapat kandungan

RNase atau Ribonuklease.

2. Primer-primer (urutan oligonukleotida pendek) yang mampu

mengamplifikasi genotip tanaman salak ada tiga primer yaitu OPA-11,

OPA-17, dan OPA- 16, sedangkan primer OPA-11 merupakan primer

yang paling banyak mengamplifikasi DNA (Deoxyribonucleic acid)

salak.

3. Hasil PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan OPA-11 dapat

mengamplifikasi/menggandakan DNA 15 kultivar salak dari 22

kultivar dengan pola pita polimorfik antara 100 pb – 600 pb. Susunan

pola pita hasil amplifikasi 15 kultivar salak paling banyak muncul pada

400 pb. Dari 22 kultivar salak yang di amplifikasi terdapat 7 kultivar

yang tidak berhasil amplifikasi.

4. Hubungan kemiripan paling dekat antara kultivar pondoh dan non

pondoh adalah kultivar salak kediri dengan pondoh Hitam, kultivar

Kelapa bali dan Manggala, pondoh Madu dan pondoh Lawu dengan

kultivar salak Thailand dan Bejalen. Dilihat dari segi morfologis antara

varietas diatas masing-masing mempunyai ciri khas sama, seperti pada

kultivar salak Kediri dan salak pondoh Hitam mempunyai rasa buah

manis tidak sepat dengan kulit buah berwarna gelap. Sedangkan

hubungan kekerabatan terdekat antara kultivar non pondoh dijumpai


commit to user

50

pada kultivar salak Kecandran dan salak Banjar, dengan ciri

morfologis sama-sama mempunyai rasa buah agak sepat dengan

ukuran buah besar. Dari hasil penelitian diketahui bahwa kultivar salak

lokal yang berkerabat dekat dengan kultivar salak pondoh dapat

dikelompokkan dalam golongan salak pondoh.

B. Saran

Saran yang dapat diberikan berdasarkan hasil penelitian sebagai

berikut:

1. Untuk penelitian selanjutnya harus menggunakan uji kuantitas DNA

untuk mengetahui jumlah isolat DNA murni yang dihasilkan dengan

menggunakan spektrofotometer.

2. Untuk memperbesar peluang terjadi amplifikasi DNA pada daerah

yang berbeda pada target dan untuk menghasilkan pengelompokkan

dengan tingkat kepercayaan yang lebih tinggi, maka perlu dilakukan

reaksi PCR dengan menggunakan primer yang lebih banyak.

3. Dalam isolasi DNA agar hasil isolat dapat menghasilkan isolat DNA

murni tanpa RNAse sebaiknya dengan metode praktis Dinamid Plant

Kit.

4. Dengan adanya penelitian ini, diharapkan dapat menjadi acuan dan

pengenalan lebih mendalam mengenai keragaman kultivar salak melalui

penanda molekuler RAPD-PCR bagi pemulia tanaman, maupun

masyarakat petani pada umumnya. Sehingga kedepan dapat menjadi

penentu dalam pemilihan kultivar unggul untuk dikembangkan.

DETEKSI KERAGAMAN SALAK ( Salacca zalacca ) VARIETAS .../Deteksi... · DAN NON PONDOH MELALUI...

Documents

Transcript of DETEKSI KERAGAMAN SALAK ( Salacca zalacca ) VARIETAS .../Deteksi... · DAN NON PONDOH MELALUI...