Menentukan Kadar PaclitaxelIsi dari tiap labu difilter dengan vakum diatas satu lapisan Miracloth dan berat bersih sel ditimbang. Sebelum filtrasi, sampel medium ekstraseluler bebas sel diambil tiga kali dengan volume 1 mL dari tiap labu dan disimpan pada tabung mikrosentrifuga 1,5 mL. Kemudian medium dievaporasi pada evaporator sentrifuga. Residu kering diekstraksi dengan metanol yang diasamkan dengan asam asetat glasial 0,01% (v/v). Penambahan metanol untuk kultur yang tidak diberi elisitor sebesar 100 L dan dan 500 L untuk kultur yang diberi elisitor. Kemudian sampel difilter dengan PVDF syringe filter 0,2 m.Taxoid dianalisis dengan metode HPLC. Kolom yang digunakan berjenis Metachem Taxsil dengan ukuran 250 x 4,6 mm dengan kolom penjaga ODS berjenis Upchurch. Deteksi dilakukan pada = 228 nm dengan pemindaian spektral dari 200 300 nm. Waktu hambat / retensi dan perbandingan spektrum UV dengan taxoid standard digunakan untuk mengidentifikasi paclitaxel dan senyawa taxan lainnya. Kadar paclitaxel dihitung dengan kurva standar dengan rentang 1-50 mg/L paclitaxel dan taxoid standar lainnya. Struktur dan stereokimia dari 13-asetil-9-dihidrobaccatin III dan baccatin VI ditentukan dengan teknik NMR 2-Dimensi, spektrometri massa, dan sintesis parsial.

Pengolahan Data secara StatistikData yang didapatkan dianalisis dengan ANOVA satu arah dengan menggunakan software MINITAB v.11. Rata-rata (mean) pada eksperimen dianalisa dengan tes perbandingan jamak Tukeys Honestly Significant Difference.

Waktu Penambahan Metil JasmonatElisitasi diuji pada Taxus canadensis (C93AD) dengan rentang konsentrasi metil jasmonat tertentu dan diberikan pada kultur berumur 8 hari dan 14 hari setelah inokulasi. Konsentrasi paclitaxel maksimum untuk sampel kultur berumur 8 hari adalah 14,4 mg/L pada hari ke-10 setelah penambahan metil jasmonat 100 M pada kultur. Konsentrasi ini merupakan yang paling besar dari semua kombinasi pemberian elisitor dan waktu pengecekan konsentrasi, kecuali pada hari ke-20 setelah pemberian 100 M metil jasmonat (14,6 mg/L). Untuk penambahan 10 M metil jasmonat pada kultur umur 8 hari, akumulasi paclitaxel lebih besar dari kontrol setelah 10 hari. Sedangkan penambahan elisitor dibawah 10 M tidak berpengaruh pada kultur sel. Laju akumulasi paclitaxel sendiri berkurang sebanding dengan berkurangnya konsentrasi elisitor yang ditambahkanElisitasi dengan metil jasmonat sendiri efektif pada kultur dengan umur 14 hari. Namun tidak seperti kultur dengan umur 8 hari, produksi senyawa paclitaxel pada kultur umur 14 hari mencapai maksimum pada hari ke-15 setelah penambahan metil jasmonat 10 M, yakni sebesar 3,8 mg/L. Jumlah ini lebih kecil dari konsentrasi paclitaxel maksimum yang dihasilkan kultur sel umur 8 hari dengan penambahan 100 M metil jasmonat (14,6 mg/L).Sedangkan untuk kultur sel Taxus canadensis (CO93P), penambahan 100 M metil jasmonat saat inokulasi menyebabkan peningkatan akumulasi paclitaxel yang signifikan saat diukur pada hari ke-7 atau ke-14 setelah elisitasi, namun tidak sebesar saat elisitor ditambahkan pada hari ke-8 atau ke-14 setelah inokulasi.

Pengaruh Metil Jasmonat pada Pertumbuhan Sel

Pada satu cell line yang sama, tidak terdapat perbedaan yang signifikan diantara sel yang dielisitasi dengan sel yang tidak dielisitasi. Sedangkan pada cell line yang berbeda, cell line CO93D sendiri memiliki pertumbuhan sel lebih lambat dan produksi paclitaxel yang lebih sedikit dibanding cell line yang lain.

Diskusi

Pada kultur yang diteliti, tidak terdapat lag phase akumulasi paclitaxel pada Taxus canadensis setelah ditambahkan metil jasmonat seperti yang dijelaskan literatur (Yukimune et al., 1996). Hal ini bisa disebabkan karena penambahan metil jasmonat dilakukan setelah kultur berumur 7 hari, bukan saat kultur diinokulasi. Selain itu ukuran inokulum juga memiliki efek yang mempengaruhi lama-cepatnya lag phase.Proporsi dari berbagai senyawa taxoid di kultur Taxus canadensis yang dielisitasi dari dua cell line yang terpisah hanya memiliki variasi yang kecil. Namun tidak ada senyawa taxoid unik yang hanya dimiliki sebagian kultur saja. Kultur-kultur yang dielisitasi juga tidak memiliki senyawa taxoid unik yang tidak ada pada kultur yang tidak dielisitasi, begitu pula sebaliknya. Dapat disimpulkan bahwa penambahan elisitor tidak menyebabkan pembentukan senyawa taxoid baru dan hanya menyebabkan peningkatan akumulasi taxoid yang sudah ada.Meskipun dalam beberapa penelitian sebelumnya disepakati bahwa baccatin III merupakan prekursor dari paclitaxol, hasil pengamatan pada penelitian ini tidak mendukung hal tersebut. Hasil pengamatan menunjukkan senyawa baccatin III terus menerus terakumulasi di kultur sel, bahkan saat sel kultur sekarat. Hal ini dapat dijadikan dasar bahwa baccatin III bukanlah prekursor, melainkan produk dari degradasi paclitaxel. Selain itu Hamada et al. (1996) mengemukakan bahwa kultur pohon Eucalyptus dapat menghidrolisis paclitaxel menjadi baccatin III secara selektif.Paclitaxel sendiri hanya berjumlah sekitar 13 20 % dari total senyawa taxoid yang ada di kultur yang dielisitasi, bergantung pada umur saat kultur diambil sampelnya. Hasil ini berbeda dengan literatur yang menyatakan bahwa jumlah paclitaxel dapat mencapai 68 70% dari total taxoid (Yukimune et al. 1996). Perbedaan ini dapat disebabkan oleh penggunaan spesies yang berbeda dengan literatur (Taxus canadensis) atau perbedaan sumber taxoid yang dianalisis. Yukimune et al. (1996) menganalisis taxoid intraseluler dan ekstraseluler dari kultur, sedangkan pada penelitian ini yang dianalisis hanya taxoid ekstraseluler yang ada di medium yang bebas sel.Senyawa taxoid 13-asetil-9-dihidrobaccatin III dan baccatin VI memiliki persentase sebesar 39 62 % dari total taxoid yang ada di kultur yang dielisitasi. Meski peran keduanya belum diketahui pada biosintesis taxoid, salah satu diantara keduanya diprediksi merupakan prekursor dari paclitaxel. Namun senyawa ini juga mungkin berperan sebagai representasi ujung ireversibel dari jalur biosintesis taxoid. Hal ini disebabkan konsentrasi senyawa-senyawa ini tidak berkurang secara signifikan, baik saat paclitaxel meningkat atau saat sel menua.

KesimpulanKultur sel suspensi Taxus canadensis dan Taxus cuspidata memproduksi paclitaxel (Taxol) dan senyawa taxoid lain secara cepat setelah dilakukan elisitasi dengan metil jasmonat. Dengan mengoptimasi konsentrasi elisitor dan timing elisitasi pada kultur sel tanaman, didapatkan bahwa akumulasi paclitaxel terbanyak terdapat pada penambahan elisitor sebanyak 200 M pada hari ke-7 dari siklus kultur. Laju pertambahan konsentrasi metil jasmonat di medium ekstraseluler bebas sel meningkat sampai 117 mg/hari selama 5 hari setelah elisitasi, ekuivalen dengan laju 23,4 mg/L per hari.