R. Susanti VIRUS A VIAN INFLUENZ MONOGRAF · DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1 Segmen genom virus...

R. SusantiDiterbitkan olehFakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan AlamUniversitas Negeri SemarangGedung D5, Kampus Sekaran Gunungpati Phone : (024) 8508112 Website : http://mipa.unnes.ac.id

VIRUS AVIAN INFLUENZA & DINAMIKA MOLEKULERNYA

R. Susanti VIRUS AVIAN INFLUENZA & DINAMIKA M

OLEKULERNYA

MONOGRAF

ISBN : 978-602-18553-5-5

MONOGRAF

VIRUS AVIAN INFLUENZA dan

DINAMIKA MOLEKULERNYA

R. Susanti

Diterbitkan oleh:

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG

2013

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya ii

VIRUS AVIAN INFLUENZA dan

DINAMIKA MOLEKULERNYA

Penulis : Dr. drh R. Susanti M.P

Penyunting : _________________

Desain sampul dan tata letak : Yoris Adi Maretta

ISBN : 978-602-18553-5-5

Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip atau memperbanyak

sebagian atau seluruh isi monograf

tanpa ijin tertulis dari penulis

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya iii

KATA PENGANTAR

Puji syukur ke hadirat Allah swt atas anugerah-Nya

sehingga buku monograf berjudul “Virus Avian Influenza dan

Dinamika Molekulernya” ini dapat terselesaikan. Monograf ini

berisi konsep, teori dan hasil penelitian tentang karakter virus

avian influenza subtipe H5N1 secara molekuler. Hasil-hasil

penelitian mencakup semua isolat virus avian influenza subtipe

H5N1 di dunia, namun paparan lebih rinci pada isolat di

Indonesia.

Virus avian influenza (VAI) adalah virus influenza tipe A

yang menyerang unggas dan menyebabkan penyakit “flu

burung”. Virus ini termasuk famili Orthomyxoviridae. Virus

influenza memiliki 8 segmen genom RNA berserat tunggal

(single-stranded RNA) berpolaritas negatif yang menyandi 11

protein. Virus ini merupakan patogen intraseluler, sehingga untuk

dapat beradaptasi, bertahan hidup dan bereplikasi dalam tubuh

hospesnya, VAI mempunyai mekanisme untuk menghindar dari

respon imun hospes. Mekanisme untuk menghindar dari respon

hospes tersebut terjadi melalui fenomena yang disebut hanyutan

antigenik (antigenic drift). Hanyutan antigenik adalah

perubahan/mutasi secara periodik akibat mutasi genetik struktur

protein permukaan VAI sehingga antibodi yang telah terbentuk

oleh tubuh akibat vaksinasi atau infeksi alami sebelumnya tidak

dapat mengenali keberadaan virus tersebut.

Virus HPAI subtipe H5N1 dari Asia menunjukkan

karakteristik zoonotik paling tinggi dan dapat ditransmisikan dari

unggas ke berbagai spesies mamalia termasuk manusia.

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya iv

Tingginya tingkat kejadian dan kematian manusia dan unggas

akibat VIA subtipe H5N1 di Indonesia, bahkan penyebab

kematian manusia tertinggi di dunia, menarik dilakukan

karakterisasi molekuler gen-gen penyusunnya. Nukleotida

penyusun gen-gen VAI merupakan karakter dasar yang

menentukan karakter fenotip suatu virus. Karakter genotip secara

molekuler akan dapat mengungkap karakter zoonotik, transmisi,

resistensi terhadap obat dan patogenesitas virus berdasarkan

sekuen nukleotida dan asam amino genom-genom yang terlibat

pada proses tersebut

Buku monograf ini merupakan salah satu bahan ajar

untuk mata kuliah biokimia, imunologi, biologi molekuler,

taksonomi, virologi, mikrobiologi ataupun biologi umum. Monograf

ini juga dapat digunakan sebagai referensi bagi mahasiswa S1,

S2 dan S3, masyarakat umum maupun dinas terkait yang

berkecimpung dalam penelitian, pencegahan dan pengendalian

penyakit hewan khususnya “flu burung”. Tingginya kemanfaatan

hasil-hasil penelitian tentang avian influenza bagi mahasiswa

maupun peneliti, mendorong diterbitkannya monograf ini. Buku

monograf ini berturut-turut berisi (1) Pendahuluan, (2) Biologi virus

avian influenza, (3) Teknik menumbuhkan dan mengisolasi virus

avian influenza, (4) Teknik identifikasi virus avian influenza dan

subtipenya, (5) Teknik analisa molekuler nukleotida penyusun

gen-gen virus avian influenza, (6) Dinamika molekuler virus avian

influenza subtipe H5N1 di Indonesia, (7) Epidemiologi virus avian

influenza dan penularannya dan (8) Penutup.

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya v

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dra. Retno

Sri Iswari, SU yang telah menyunting monograf ini. Pada

kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih

kepada mahasiswa yang terlibat dalam penelitian virus avian

influenza, serta semua teman-teman yang telah memotivasi

penulis untuk menyelesaikan monograf ini. Semoga karya buku

monograf ini bermanfaat bagi dunia pendidikan dan penelitian di

Indonesia. Kritik dan saran demi kesempurnaan monograf ini

sangat penulis harapkan.

Semarang, Agustus 2013

Penulis

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya vi

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR iii

DAFTAR ISI vi

DAFTAR TABEL ………………………………… ….…………….. viii

DAFTAR GAMBAR ………………………..................................... x

BAB I PENDAHULUAN 1

Rumusan Masalah …………………………………………. 5

Tujuan ...................……………………………………............ 6

Metode...................……………………………………............ 7

BAB II BIOLOGI VRUS INFLUENZA 8

Morfologi .......................………………………………........... 8

Klasifikasi .....................………………………………............ 9

Siklus Hidup ........……………………………………….......... 14

Mutasi Gen VAI ...……………………………………….......... 20

Hanyutan antigenik ….………………………………….......... 25

Reasorsi dan transmisi VAI…………………………….......... 26

BAB III TEKNIK MENUMBUHKAN DAN MENGISOLASI VIRUS

AVIAN INFLUENZA 29

Preparasi Sampel..........………………………………........... 31

Media Perbanyakan virus ......……….………………............ 31

Metode Propagasi Virus pada Telur Ayam Berembrio SPF 34

BAB IV TEKNIK IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA

DAN SUBTIPENYA 39

Uji Hemaglutinasi (HA)..………………………………........... 39

Metode Uji Hemaglutinasi (HA)………………………........... 41

Uji Agar Gel Immunodiffusion (AGID) Test ……..……........ 42

Metode uji AGPT….…………………………………….......... 44

Identifikasi subtipe virus avian influenza secara molekuler 46

Metode Isolasi RNA Virus .…………………………….......... 47

Metode RT-PCR……..,.………………………………........... 52

Elektroforesis ………………….………………………........... 54

Metode Elektroforesis Hasil RT-PCR pada Gel Agarose 56

BAB V TEKNIK ANALISA MOLEKULER NUKLEOTIDA 59

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya vii

PENYUSUN GEN-GEN VIRUS AVIAN INFLUENZA

Contoh Metode Amplifikasi Gen HA Dengan Primer

Spesifik 60

Purifikasi produk PCR…………………………..……............ 61

Sekuensing………..…………………………………….......... 62

Metode analisis nukleotida dengan program MEGA 3.1 62

BAB VI DINAMIKA MOLEKULER VIRUS AI SUBTIPE H5N1 DI

INDONESIA 72

Gen Hemaglutnin (HA) ....……………………………............. 73

Gen Non Struktural-1 (NS1) ......…………………………...... 96

Gen Polymerase Basic 1 (PB1) .......…………………........... 102

Gen Polymerase Basic 2 (PB2) ........................................... 108

Gen Neuraminidase (NA) ….…………………………………. 112

BAB VII EPIDEMIOLOGI VIRUS AVIAN INVLUENZA DAN

PERAN UNGGAS AIR

118

Epidemiologi Virus Avian Influenza…………........................ 118

Telaah Virus Avian Influenza di Indonesia …….……........... 121

Peran unggas air pada penyebaran virus avian influenza… 123

Cara Perlindungan dan Pencegahan Infeksi Virus Avian

Influenza 128

BAB VIII PENUTUP …………………………………………………. 132

DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………… 141

GLOSARIUM………. ………………………………………………… 169

INDEKS ……………. ………………………………………………… 174

BIOGRAFI ..………. ………………………………………………… 175

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya viii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1 Segmen genom virus influenza A serta fungsi protein yang disandinya .............................................................

12

Tabel 2 Level laboratorium untuk penelitian yang berhubungan dengan mikroorganisme penyebab penyakit.................

29

Tabel 3 Sekuen basa primer untuk mengamplifikasi gen H5, H1 dan ND serta besaran produk PCR yang diharapkan…………………………………………………

53

Tabel 4 Sekuen nukleotida primer untuk mengamplifikasi gen HA ..................................................................................

59

Tabel 5 Variasi antigenik site dari gen HA virus AI subtipe H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia …............

76

Tabel 6 Variasi daerah antigenik dari gen HA virus AI subtipe H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia ................

79

Tabel 7 Variasi residu pengikat reseptor dari gen HA virus AI subtipe H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia…

80

Tabel 8 Variasi peptida fusi dari gen HA virus AI subtipe H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia .........................

86

Tabel 9 Variasi sekuen daerah pemotongan virus avian influenza H5N1 di Indonesia dari tahun 2003-2010 ….

88

Tabel 10 Variasi posisi glikosilasi dari gen HA virus AI subtipe H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia ...............

92

Tabel 11 Variasi peptida fusi dari gen HA virus AI subtipe H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia .........................

100

Tabel 12 Variasi dari gen PB1 dan PB1-F2 virus AI subtipe H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia …….......

105

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya ix

Tabel 13 Variasi dari gen PB2 virus AI subtipe H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia .............................................

109

Tabel 14 Variasi dari posisi glikosilasi gen NA virus AI subtipe H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia ...............

113

Tabel 15 Variasi dari oseltamifir binding pocket gen NA virus AI subtipe H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia ..

115

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya x

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1 Bentuk pleiomorfik virus influenza ........................... 9

Gambar 2 Struktur dan segmen-segmen genom virus influenza A ……………………………………….……

14

Gambar 3 Siklus replikasi virus influenza …............................. 15

Gambar 4 Pertumbuhan virus avian influenza subtipe H5N1 pada TAB ……………………………………………..

36

Gambar 5 Antigen virus virus HPAI H5N1 isolat unggas air pada organ-organ embrio……………………………..

38

Gambar 6 Hemaglutinasi sel darah merah oleh virus yang mampu mengaglutinasi ………………………………

40

Gambar 7 Gambaran contoh hasil uji HA ................…….......... 42

Gambar 8 Pembentukan presipitasi pada uji AGPT ................. 43

Gambar 9 Interpretasi hasil AGPT..................…...………........ 44

Gambar 10 Contoh hasil AGPT …………................................... 46

Gambar 11 Elektroforegram RT-PCR gen H5 ………………..... 57

Gambar 12 Elektroforegram RT-PCR gen N1…………….......... 57

Gambar 13 Elektroforegram RT-PCR ……………………..……. 58

Gambar 14 Tampilan program MEGA pada persiapan alignment ………………………………………………

64

Gambar 15 Tampilan prosedur alignment……………................. 66

Gambar 16 Proses menampilkan data alignment pada MEGA... 69

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya xi

Gambar 17 Proses penyimpanan data alignment ke word……... 70

Gambar 18 Pembuatan pohon filogeni dan jarak genetik…….... 71

Gambar 19 Pohon filogenetik 1695 basa gen HA virus AI H5N1 96

Gambar 20 Pohon filogenetik 690 basa gen NS virus AI H5N1.. 101

Gambar 21 Pohon filogenetik 2268 basa gen PB1 virus AI H5N1 ……………………………………………………

107

Gambar 22 Pohon filogenetik 2200 basa gen PB2 virus AI H5N1 ……………………………………………………

111

Gambar 23 Pohon filogenetik 1404 basa gen NA virus AI H5N1 117

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya 1

BAB I

PENDAHULUAN

Influenza (atau biasa disingkat menjadi flu) bukan penyakit

yang asing lagi bagi masyarakat dunia, termasuk Indonesia.

Influenza banyak dan sering menyerang manusia dan hewan.

Avian Influenza (AI) atau dikenal juga dengan “flu burung” adalah

penyakit flu pada unggas yang sangat menular, disebabkan oleh

virus influenza tipe A, termasuk famili Orthomyxoviridae (Lamb &

Krug 2001). Virus influenza yang menyerang unggas dan

menyebabkan penyakit “flu burung” disebut Virus Avian Influenza

(VAI).

Virus influenza memiliki 8 segmen genom RNA

(ribonucleic acid) serat tunggal (single-stranded RNA)

berpolaritas negatif yang menyandi 11 protein. Kedelapan

segmen RNA bersama-sama dengan nukleoprotein (NP)

membentuk ribonukleoprotein (RNP) (Bui et al. 2000; Elton et al.

2001; Munch et al. 2001). Kedelapan segmen genom RNA dari

VAI, segmen genom ke-7 yaitu matriks (M) dianggab paling

stabil/conserve dibandingkan 7 genom lainnya. Sementara genom

yang paling tinggi tingkat mutasinya adalah genom HA

(hemaglutinin). Hasil penelitian Susanti et al. (2008a)

menunjukkan bahwa domain asam amino daerah antigenik, posisi

glikosilasi dan kantong pengikat reseptor pada gen HA virus AI

isolat unggas air di Jawa Barat menunjukkan adanya

polimorfisme, namun spesifisitas reseptor avian α-2,3NeuAcGal

masih tetap dipertahankan. Genom yang berperan pada


mekanisme zoonotik, transmisi dan virulensi/patogenesitas VAI

adalah segmen genom polymerase basic 2 (PB2), PB1,

hemaglutinin (HA), neuraminidase (NA), dan non-struktural 1

(NS1).

Sebagai patogen intraseluler, VAI mempunyai mekanisme

untuk menghindar dari respon imun hospes sehingga virus dapat

bertahan hidup dan bereplikasi dalam tubuh hospes. Peningkatan

kemampuan virus untuk menghindari sistem imun hospes, secara

langsung berkorelasi dengan peningkatan patogenesitas virus.

VAI mempunyai berbagai mekanisme untuk menghindar dari

respon imun bawaan dan adaptif hospes (Coleman 2007).

Virus AI mempunyai kemampuan untuk menghindar dari

respon humoral hospes melalui fenomena yang disebut hanyutan

antigenik (antigenic drift). Mutasi yang mengarahkan pada

fenomena ini adalah perubahan asam amino glikoprotein

permukaan hemaglutinin (HA) (Plotkin & Dushoff 2003). Hanyutan

antigenik adalah perubahan secara periodik akibat mutasi genetik

struktur protein permukaan VAI sehingga antibodi yang telah

terbentuk oleh tubuh akibat vaksinasi sebelumnya tidak dapat

mengenali keberadaan virus tersebut (Munch et al. 2001). Konsep

hanyutan antigenik ini menuntut produksi vaksin selalu

diperbaharui. Ancaman yang lebih besar dari penghindaran

respon imun bawaan dan perolehan adalah kemampuan virus

untuk reasorsi melalui fenomena yang disebut lompatan antigenik

(antigenic shift) (Coleman 2007).

Virus AI dengan kepemilikan mekanisme untuk

menghindar dari respon imun bawaan dan adaptif hospes,


merupakan salah satu faktor meluasnya wabah virus ini. Wabah

VAI subtipe H5N1 patogenik tinggi (highly pathogenic avian

influenza; HPAI) pertama kali dilaporkan di Cina Selatan tahun

1996-1997, kemudian menyebar dan menyebabkan kematian

unggas di Vietnam, Thailand, Indonesia dan Negara Asia Timur

sejak awal tahun 2004 (Smith et al. 2006). Wabah virus HPAI

subtipe H5N1 pada unggas di Indonesia muncul pertama kali

pada bulan Agustus 2003 di beberapa peternakan ayam ras

komersial di Jawa Barat dan Jawa Tengah, namun secara resmi

baru dilaporkan pada Januari 2004. Kasus ini kemudian meluas

ke berbagai daerah di Jawa Tengah, Jawa Barat, Jawa Timur,

DIY, Lampung, Bali serta beberapa daerah di Sumatera dan

Kalimantan. Berdasarkan laporan Direktorat Jenderal Peternakan

dan Kesehatan Hewan (2012), sejak dideklarasikan Januari 2004,

jumlah kasus infeksi VAI secara bertahap menurun setiap

tahunnya, yakni 1411 kasus pada tahun 2011. Jumlah tersebut

lebih rendah dibanding tahun sebelumnya yaitu 1502 (tahun

2010), 2293 (tahun 2009), 1413 (tahun 2008), 2751 (tahun 2007)

dan 612 (tahun 2006).

Berdasarkan kajian epidemiologi molekuler, Pulau Jawa

merupakan pusat penyebaran (epicenter) VAI subtipe H5N1 di

Indonesia. Virus-virus H5N1 ini diintroduksi dari pulau Jawa ke

pulau-pulau di sekitarnya melalui jalur perdagangan unggas.

Sampai saat ini, avian influenza dinyatakan endemis di 32 dari 33

propinsi di Indonesia. Infeksi VAI subtipe H5N1 pada manusia

mulai terjadi pada Juli 2005. Infeksi VAI H5N1 pada manusia

terjadi secara sporadis dan menyerang beberapa klaster famili


(Kandun et al. 2006; Sedyaningsih et al. 2007). Kasus infeksi VAI

H5N1 pada klaster famili kemungkinan dipengaruhi oleh faktor

genetik, tingkah laku, imunologik, dan lingkungan (Kandun et al.

2006). Semua kasus infeksi VAI H5N1 di Indonesia merupakan

VAI H5N1 clade 2 subclade 1 (Kandun et al. 2006; Sedyaningsih

et al. 2007).



unggas ke berbagai spesies mamalia termasuk manusia (Kalthoff

et al. 2010). Sampai tanggal 10 Agustus 2012, jumlah kasus dan

kematian akibat VAI H5N1 pada manusia Indonesia tercatat

paling tinggi di dunia dengan jumlah kematian 159 orang dari 191

orang positif terinfeksi. Data kejadian dan kematian di seluruh

dunia adalah 359 kematian dari 608 kejadian (WHO 2012).

Kematian manusia paling banyak terjadi di Propinsi DKI Jakarta,

Jawa Barat dan Banten. Semakin banyaknya kasus transmisi

zoonotik ke manusia, semakin meningkatkan potensi terjadinya

pandemi (Smith et al. 2006).

Virus AI subtipe H5N1 diperkirakan akan selalu bermutasi

sehingga berpotensi meningkatkan kapasitas untuk melompati

barier spesies, dan dapat menular secara mudah antar manusia.

Penularan VAI H5N1 antar manusia merupakan awal terjadinya

pandemik secara global. Nampaknya, semua fragmen gen VAI

H5N1 secara bersama-sama menentukan apakah suatu

strain/galur dapat menginfeksi manusia atau mamalia. Tingginya

tingkat kejadian dan kematian manusia dan unggas akibat flu

burung (virus avian influenza) subtipe H5N1 di Indonesia, bahkan


penyebab kematian manusia tertinggi di dunia, menarik untuk

dikaji dinamika molekuler VAI asal manusia dan hewan di

Indonesia. Hal ini menjadi sangat penting dilakukan sebagai

dasar penentuan pengobatan, pengendalian dan pencegahan

penyebaran virus ini. Karakterisasi genotip merupakan karakter

dasar yang menentukan karakter fenotip suatu virus. Karakter

fenotip selain ditentukan karakter genotip, juga dipengaruhi oleh

lingkungan dan respon hospes yang diinfeksi. Karakter genotip

secara molekuler akan dapat mengungkap karakter zoonotik,

transmisi, resistensi terhadap obat dan patogenesitas virus

berdasarkan sekuen nukleotida dan asam amino genom-genom

yang terlibat pada proses tersebut.

Rumusan Masalah

Virus HPAI H5N1 dari Asia menunjukkan karakteristik

zoonotik paling tinggi dan dapat ditransmisikan dari unggas ke

berbagai spesies mamalia termasuk manusia. Jumlah kasus dan

kematian akibat VAI subtipe H5N1 pada manusia tercatat paling

tinggi di dunia dengan jumlah kematian 152 orang dari 184 orang

positif terinfeksi. Semakin banyaknya kasus transmisi zoonotik ke

manusia, semakin meningkatkan potensi terjadinya pandemi.

Sebagai patogen intraseluler, VAI mempunyai mekanisme untuk

menghindar dari respon imun hospes sehingga virus dapat

bertahan hidup dan bereplikasi dalam tubuh hospes. Peningkatan

kemampuan virus untuk menghindari sistem imun hospes, secara

langsung berkorelasi dengan peningkatan patogenesitas virus.

VAI mempunyai berbagai mekanisme untuk menghindar dari


respon imun bawaan dan adaptif hospes. Tingginya tingkat

kejadian dan kematian manusia dan unggas akibat virus flu

burung (VIA) subtipe H5N1 di Indonesia, bahkan penyebab

kematian manusia tertinggi di dunia, perlu dilakukan kajian

dinamika molekuler melalui karakter gen-gen penyusun VAI asal

manusia dan hewan di Indonesia. Hal ini menjadi sangat penting

dilakukan sebagai dasar penentuan pengobatan, pengendalian

dan pencegahan penyebaran virus ini. Karakterisasi genotip

merupakan karakter dasar yang menentukan karakter fenotip

suatu virus. Karakter fenotip selain ditentukan karakter genotip,

juga dipengaruhi oleh lingkungan dan respon hospes yang

diinfeksi. Karakter genotip secara molekuler akan dapat

mengungkap karakter zoonotik, transmisi, resistensi terhadap

obat dan patogenesitas virus berdasarkan sekuen nukleotida dan

asam amino genom-genom yang terlibat pada proses tersebut.

Berdasarkan hal-hal tersebut, permasalahan yang

dipecahkan/dikaji dalam buku ini adalah :

1. Bagaimana menumbuhkan dan mengisolasi virus AI ?

2. Bagaimana mengidentifikasi Virus Influenza?

3. Bagaimana mengkarakterisasi virus avian influenza

secara molekuler?

4. Bagaimana dinamika molekuler gen-gen virus AI subtipe

H5N1 di Indonesia ?

Tujuan Penulisan buku

Penulisan buku ini bertujuan untuk menyebarluaskan teori,

konsep dan hasil-hasil penelitian tentang virus AI dengan karakter


fenotip dan molekulernya. Tulisan ini diharapkan bermanfaat

sebagai (a) bahan pengayaan mata kuliah biokimia, imunologi,

biologi molekuler, taksonomi, virologi, mikrobiologi ataupun

biologi umum (b) dasar pertimbangan berbagai pihak dalam

penelitian virus AI secara molekuler dan (c) dasar pengambil

kebijakan dalam pencegahan, pengobatan dan pengendalian

virus avian influenza (VAI) di Indonesia.

Metode Pemecahan Masalah

Permasalahan tersebut dapat dipecahkan dengan

melakukan kajian pustaka dan hasil-hasil penelitian tentang

biologi virus AI, prinsip dasar isolasi dan identifikasi virus

influenza khususnya subtipe H5N1, prinsip dasar teknik

karakterisasi molekuler virus influenza,khususnya subtipe H5N1,

dan dinamika molekuler virus AI di Indonesia. Dalam tulisan ini

dibahas kajian teoritis dan hasil penelitian tentang :

1. Biologi Virus Avian Influenza (struktur, morfologi,

klasifikasi, siklus hidup)

2. Teknik menumbuhkan dan mengisolasi virus AI

3. Teknik mengidentifikasi Virus Avian Influenza

4. Teknik analisis gen-gen Virus Avian Influenza secara

molekuler

5. Dinamika molekuler gen-gen Virus Avian Influenza subtipe

H5N1 di Indonesia

6. Epidemiologi Virus Avian Influenza dan peran unggas air

dalam penyebaran virus


BAB II

BIOLOGI VIRUS AVIAN INFLUENZA

Virus bukan merupakan sel utuh dan tidak dapat

bereproduksi sendiri. Untuk dapat bereproduksi atau

memperbanyak diri, virus harus menyerang sel hidup dan

menggunakan sumber daya sel tersebut untuk memperbanyak

diri. Pada dasarnya, virus hanya merupakan material genetik

yang dibungkus kantong protein, sehingga virus tidak dapat

dikatakan “hidup”. Meskipun demikian, karena mampu

memperbanyak diri dan memiliki material genetik maka sebagian

ilmuwan sepakat virus merupakan makhluk hidup. Berdasarkan

material genetik yang dimiliki virus, ada 2 jenis virus yaitu virus

yang memiliki ribonucleic acid (RNA) atau deoxyribonucleic acid

(DNA).

Morfologi

Bentuk dan ukuran virus influenza bersifat pleiomorfik

(bentuk dan ukuran berubah-ubah), berbentuk filamen atau

sferoid (bola) dengan diameter 80-120 nm (Harris et al. 2006)

(Gambar 1). Virus yang ditumbuhkan secara in vitro, karena

pertumbuhannya yang cepat, sehingga lebih banyak

berbentuk sferoid dengan diameter dan panjang yang

konstan (review oleh Whittaker 2001). Virus yang diisolasi dari

infeksi alami biasanya berbentuk filamen dengan diameter

konstan 100-150nm tetapi panjangnya bervariasi. Virus

influenza mempunyai amplop yang dilapisi protein matriks


dengan glikoprotein integral yang menjulur keluar

membentuk duri (spike) di permukaan virion (Harris et al.

2006). Virus yang berbentuk filamen lebih infektif dan lebih

banyak mengandung RNA dibanding virus berbentuk sferoid

(Roberts & Compans 1998).

Gambar 1. Bentuk pleiomorfik virus influenza

(A) bentuk filamen (Robert & Compans 1998) (B) sferoid (Whittaker 2001)

Klasifikasi

Virus influenza adalah virus anggota famili

Orthomyxoviridae (ICTV 2006). Virus ini dibagi menjadi

influenza tipe A, B dan C berdasarkan perbedaan antigenik

pada nukleoprotein (NP) dan matriks (M) (Payungporn et al.

2004). Namun, dari ketiga tipe tersebut hanya tipe A yang

berpotensi menimbulkan pandemik (Liu 2005). Influenza A dan B

memiliki kemiripan biologis, antigenik, genetik dan struktur,

namun cakupan hospes (host range), pola strategi dan evolusi

kode genetiknya bervariasi (Lamb & Krug 1996; Murphy &

Webster 1996). Influenza A dapat menginfeksi berbagai hewan

B

B

A

A


dan manusia, serta dibagi menjadi beberapa subtipe antigenik.

Influenza B hanya menginfeksi manusia dan tidak ditemukan

menginfeksi hewan secara alamiah, serta tidak dibagi menjadi

subtipe-subtipe antigenik. Virus Influenza B hanya bersirkulasi

pada manusia, dan biasanya tidak menyebabkan penyakit

sesakit akibat Influenza A. Analisis evolusi gen HA influenza B

memiliki karakteristik membentuk 2 jenis antigenik yang berbeda,

yaitu B/Yamagata/16/88-like dan B/Victoria/2/87-like (Kanegae et

al. 1990; Rota et al. 1990; Rota et al. 1992; Nerome et al. 1998;

Lindstrom et al. 1999).

Di dalam virion influenza tipe A dan B terdapat 8

segmen genom RNA serat tunggal (single-stranded RNA)

berpolaritas negatif yang menyandi 11 protein (Tabel 1).

Delapan segmen tersebut adalah PB1 (PB1 dan PB1-F2), PB2,

PA, HA, NP, NA, M (M1 dan M2), dan NS (NS1 dan NS2)

(Horimoto & Kawaoko 2001; Whittaker 2001). Kedelapan segmen

RNA bersama-sama dengan nukleoprotein (NP) membentuk

ribonukleoprotein (RNP) (Bui et al. 2000; Elton et al. 2001; Munch

et al. 2001). RNP dikelilingi oleh protein matriks M1. Pada

permukaan amplop virus terdapat glikoprotein HA dan NA serta

kanal ion (ion channel) M2 (Elton et al. 2001). Hemaglutinin (HA)

virus disandi dalam segmen ke-4 dan neuraminidase (NA) dalam

segmen ke-6. Segmen yang lain menyandi protein internal virus

dan protein lain yang penting untuk viabilitas virus seperti

misalnya segmen 8 yang menyandi NS1 yaitu suatu protein

nonstruktural yang berfungsi dalam melakukan hambatan

terhadap respon antiviral dari inang (Lamb 1989). Protein lain


yang dimiliki oleh virus ini antara lain nukleoprotein (NP) yang

menjadi protein struktural utama, protein membran/matriks (M1

dan M2), protein polimerase (PA, PB1, dan PB2), dan protein

nonstruktural (NS1 dan NS2) (Yuen et al. 1998; Chan 2002; Guan

et al. 2002; Peiris et al. 2004). Glikoprotein HA membentuk

tonjolan (spike) pada permukaan virion, berfungsi sebagai media

untuk berikatan dengan reseptor pada sel inang dan memasuki

sel inang kemudian terjadi fusi dengan membran sel inang.

Protein NA membentuk struktur pada permukaan partikel virus

dan mengkatalisis pembebasannya dari sel yang terinfeksi,

sehingga virus dapat menyebar (WHO 2005a).

Struktur dan segmen-segmen genom virus influenza A

terlihat pada Gambar 2. Virus influenza tipe C mempunyai 7

segmen genom RNA, karena hanya mempunyai satu jenis

glikoprotein permukaan yaitu hemagglutinin esterase fusion

(HEF). HEF berfungsi sebagai pengikat reseptor (H), fusi

membran (F) dan esterase (E) (review oleh Whittaker 2001).

Virus influenza tipe A secara natural dapat menginfeksi

unggas dan manusia (Khawaja et al. 2005). Virus ini dibagi ke

dalam berbagai subtipe berdasarkan analisis serologis dan

genetis glikoprotein hemaglutinin (HA) dan neuraminidase (NA)

(Lee et al. 2001). Sampai saat ini ada 16 subtipe HA (H1-H16)

dan 9 subtipe NA (N1-N9) (Russell & Webster 2005). Subtipe H16

baru ditemukan tahun 2004, pertama kali diisolasi dan

diidentifikasi pada burung camar laut kepala hitam (Fouchier et al.

2005). Semua subtipe HA dan NA ditemukan pada unggas air,

dan hanya 3 subtipe HA (H1-H3) dan 2 subtipe NA (N1-N2)


ditemukan pada manusia (Hoffman et al. 2001). Subtipe H5 dan

H7 yang sangat virulen pada unggas (Lee et al. 2001; Khawaja et

al. 2005) dilaporkan berpotensi sebagai penyebab pandemi

(Russell & Webster 2005).

Semua strain virus influenza diberi nama sesuai

nomenklatur standar, berturut-turut tersusun dari tipe virus

influenza/spesies hewan (jika bukan manusia)/wilayah

isolasi/urutan nomor isolasi laboratorium/tahun isolasi (subtipe)

(WHO 2002). Misalnya Influenza A/goose/Guangdong/1/1996

(H5N1), artinya virus ini termasuk tipe virus influenza A, diisolai

dari angsa di Guangdong dengan nomor isolat 1, diisolasi tahun

1996, virus termasuk subtipe H5N1. Jika virus diisolasi dari

manusia, tidak perlu disebutkan spesiesnya. Contohnya Influenza

A/Indonesia/2A/2005 (H5N1), artinya virus ini termasuk tipe virus

influenza A, diisolai dari manusia di Guangdong dengan nomor

isolat 2A, diisolasi tahun 2005, virus termasuk subtipe H5N1.

Tabel 1. Segmen genom virus influenza A serta fungsi protein

yang disandinya

Segmen/Gen

Protein yang disandi

Fungsi

1/PB2 Polimerase Basa 2

Perampasan tudung (cap snatching) Faktor virulensi

2/PB1 Polimerase Basa 1

Perampasan tudung Polimerisasi sintesis mRNA Perakitan kompleks RdRp (RNA dependent RNA polymerase) Menghambat respon imun seluler

PB1-frame 2 (PB1-F2)

Menginduksi apoptosis makrofag Menurunkan penghilangan


(clearance) virus Meningkatkan terjadinya infeksi sekunder oleh bakteri

3/PA Polimerase Asam Perakitan kompleks RdRp Endonuklease Replikasi Menghambat respon imun seluler

4/HA Hemaglutinin Attchment (penempelan virus pada sel hospes) Fusi dengan membran endosom Target netralisasi antibodi

5/NP Nukleoprotein Tanda isyarat (signal) impor vRNP Menghambat respon imun seluler

6/NA Neuraminidase Memotong ujung asam sialat dari reseptor sel hospes sehingga progeni virion lepas dari sel Target netralisasi antibodi

7/M Matriks 1 (M1) Perakitan (assembly) progeni virus

Matriks 2 (M2) Tanda isyarat transpor ke permukaan sel Kanal ion

8/NS Nonstruktural 1 (NS1)

Ekspor mRNA virus dari nukleus Menghambat pemotongan dan penyambungan (splicing) pre mRNA seluler Menghambat ekspor mRNA seluler Menghambat respon anti virus interferon (IFN) Menginduksi badai sitokin (sitokines storm)

Nonstruktural 2 (NS2) atau Nuclear export protein (NEP)

Bersama-sama dengan M1 sebagai tanda isyarat ekspor vRNP dari nukleus


Siklus Hidup

Siklus replikasi virus influenza A mempunyai keunikan

karena semua sintesis mRNA dan replikasi genom terjadi di

dalam nukleus sel hospes yang terinfeksi. Proses replikasi virus

sangat cepat, sekitar 10 jam/siklus (Coleman 2007). Infeksi virus

influenza diawali dengan masuknya virus ke dalam sel hospes

(entry), diikuti transkripsi, translasi, perakitan dan budding virion-

virion baru keluar sel hospes (Gambar 3).

Gambar 2. Struktur dan segmen-segmen genom virus influenza A (Webster 2001)


Gambar 3. Siklus replikasi virus influenza (Whittaker 2001)

Virus influenza masuk sel hospes melalui endositosis yang

diperantarai reseptor (receptor–mediated endositosis) (Elton et al.

2001). Ikatan pada reseptor merupakan determinan awal

patogenesitas, dan spesifisitas ikatan reseptor menentukan

tropisme suatu virus pada spesies hospes tertentu. Residu asam

amino bagian dari HA yang berikatan dengan reseptor adalah

asam amino nomor 222 dan 224 (penomoran menurut H5).

Glikoprotein HA virus influenza strain manusia yang mempunyai

asam amino leusin pada posisi 222 dan serin pada 224 dapat

berikatan dengan asam sialat α-2,6NeuAcGal. Sementara HA

virus influenza strain unggas yang mempunyai asam amino

glutamin pada posisi 222 dan glisin pada 224 dapat berikatan


dengan asam sialat α-2,3NeuAcGal (Vines et al. 1998; Zhou et al.

1999; Suzuki et al. 2000; Leung 2007).

Setelah interaksi virus dengan reseptor pada permukaan

sel, terjadi internalisasi virus secara cepat melalui endositosis

(Bui et al. 1996). Rendahnya pH dalam endosom (5,5) memacu

terjadinya pelepasan mantel (uncoating) virus. Kondisi asam itu

juga menyebabkan perubahan konformasi HA sehingga regio

peptida fusi HA dapat disisipkan ke membran endosom dan

terjadi fusi antara membran endosom dengan membran virus.

Proses fusi hanya dapat terjadi jika HA dipotong menjadi HA1 dan

HA2 oleh protease sel hospes (Steinhauer 1999).

Rendahnya pH endosom juga menyebabkan aliran ion ke

bagian interior virus melalui protein M2 dan memutus interaksi

M1-vRNP (Pinto et al. 1992; Bui et al. 1996). Pelepasan mantel

virus menyebabkan vRNP dan M1 masing-masing lepas ke

sitoplasma dan menuju nukleus melewati nuclear core protein

(NCP) (Bui et al. 1996). Impor vRNP melalui NCP diperantarai

oleh nuclear localization signal (NLS) 1 dan 2 pada protein NP

(Cros et al. 2005; Ozawa et al. 2007; Wu et al. 2007). Sementara,

impor protein M1 ke dalam nukleus terjadi secara difusi pasif (Bui

et al. 1996). Amantadin dan rimantadin yang banyak dipakai

sebagai antivirus bekerja dengan menghambat aktivitas M2 untuk

memutus interaksi M1-vRNP sehingga materi genetika virus tidak

dapat masuk nukleus (Hayden 2006)

Transkripsi dan replikasi genom RNA virus (vRNA) influenza

dilakukan di dalam nukleus sel hospes, dikatalisis oleh enzim

RdRp terdiri dari enzim PB1, PB2 dan PA (Honda et al. 2002;


Crow et al. 2004; Hara et al. 2006). Genom vRNA membentuk

kompleks dengan RdRp dan NP membentuk vRNP sebagai

cetakan transkripsi (membentuk mRNA) dan cetakan replikasi

(membentuk genom vRNA dari cRNA) (Vreede et al. 2004).

Sintesis mRNA virus diawali dengan penambahan fragmen

tudung pada ujung „5 mRNA sebagai primer inisiasi transkripsi.

Fragmen tudung (7mGppp dan 10-13 nukleotida setelah tudung)

dari pre-mRNA sel hospes dipotong oleh enzim PB1 kemudian

dikenal dan diikat oleh enzim PB2. Proses perampasan tudung

dari pre-mRNA seluler tersebut disebut dengan cap snatching

(Rao et al. 2003; Crow et al. 2004; Hara et al. 2006). Setelah

penambahan tudung, pemanjangan (elongasi) rantai mRNA

berjalan sampai pada sekuen kaya uridin yang terletak 15-22

nukleotida sebelum ujung 3‟ mRNA. Pemanjangan mRNA virus ini

dikatalisis oleh enzim PB1. Seperti juga mRNA eukariot, mRNA

virus yang baru disintesis juga mengalami poliadenilasi pada

ujung 3‟, dikatalisis oleh RdRp (Honda et al. 2002).

mRNA virus tetap terlindung dari degradasi selama

kompleks RdRp terikat pada sekuen spesifik

5‟AGCAAAAGCAGG‟3 yang ditemukan pada semua mRNA virus.

Sekuen ini komplementer dengan 12 nukleotida ujung 3‟ dari

genom vRNA. Semua segmen genom virus influenza mempunyai

12 nukleotida pada ujung „3 dan 13 nukleotida pada ujung „5 yang

bersifat stabil (Bae et al. 2001; Crow et al. 2004). Primer untuk

mengamplifikasi secara lengkap semua genom virus didisain

berdasarkan regio genom yang identik dan stabil ini (Hoffman et

al. 2001).


Replikasi genom vRNA tidak memerlukan primer dan

dibentuk dari cetakan cRNA. Pada tahap I replikasi, vRNA dikopi

menjadi cRNA berpolaritas positif. Inisiasi pembentukan cRNA

tidak memerlukan tudung 7mGppp (Crow et al. 2004; Vreede et

al. 2004; Hara et al. 2006). Tahap II replikasi adalah sintesis

vRNA berpolaritas negatif dengan cRNA sebagai cetakannya

(Hara et al. 2006). Seluruh serat cRNA disebut anti genom karena

merupakan cetakan untuk sintesis vRNA. RdRp yang

mengkatalisis replikasi genom, tidak mempunyai mekanisme

untuk memperbaiki kesalahan (proofreading) sehingga tingkat

kesalahan mencapai 1 dari 104 nukleotida per siklus replikasi

(review oleh Webster et al. 1992).

Pembentukan cRNA tidak memerlukan tudung 7mGppp.

Perubahan fungsi katalitik polimerase dari transkripsi mRNA ke

replikasi cRNA diperantarai oleh protein NP yang berikatan

langsung dengan PB1 dan PB2 (Portela & Digard 2002).

Perubahan fungsi katalitik polimerase PB1 memerlukan

perubahan strukter sekunder polimerase, karena regio ikatan

cRNA berbeda dengan regio ikatan mRNA (Gonzales & Ortin

1999). Berbeda dengan mRNA, 2 bentuk RNA lainnya (yaitu

cRNA dan vRNA) dibungkus (encapsidated) oleh protein NP

membentuk vRNP (Portela & Digard 2002).

Translasi (sintesis protein) dari mRNA virus influenza

seluruhnya menggunakan mekanisme translasi dalam sitoplasma

sel hospes. Protein PA, PB1, PB2 dan NP hasil translasi

selanjutnya masuk ke nukleus untuk mengkatalisis transkripsi dan

replikasi, kemudian dirakit dengan vRNA yang baru dan disintesis


membentuk vRNP (Klumpp et al. 1997). vRNP diekspor ke

sitoplasma melalui pembentukan kompleks NEP-M1-RNP, dan

berinteraksi dengan reseptor ekspor nuklear sel hospes

(superfamili importin-β) yang bersifat stabil (Cullen 2000;

Neumann et al. 2000; Sandri-Goldin 2004). Ekspor vRNP virus

influenza dihambat oleh antibiotik leptomisin B yang berikatan

dengan CRM-1 (Elton et al. 2001).

Fragmen gen virus influenza A ada yang menyandi satu

protein (PB1, PB2, PA, NA, HA, NP) ada yang lebih dari satu

protein (gen NS dan M). Splicing mRNA dari gen NS menjadi

mRNA NS1 dan mRNA NS2 (berturut-turut menyandi protein NS1

dan NS2) dilakukan di nukleus sel hospes menggunakan

mekanisme splicing pre-mRNA sel hospes. Splicing yang sama

juga dilakukan terhadap mRNA gen M menjadi mRNA M1 dan

mRNA M2 (Whittaker 2001).

Sebagai target protein transmembran, protein HA, NA dan

M2 mengalami modifikasi pascatranslasi, berupa glikosilasi dan

pelipatan, selama melintasi retikulum endoplasma dan aparatus

Golgi (Gomez-Puertas et al. 2000). Sebagian molekul M1

berikatan dengan vRNP dan sebagian lagi membentuk selubung

di bawah amplop virus. Glikoprotein HA pada transmembran

menstimulasi M1 untuk berikatan/menempel pada membran.

Interaksi antara ekor transmembran HA dengan M1 merupakan

target perakitan virion (Ali et al. 2000; Gomez-Puertas et al. 2000;

Ruigrok et al. 2000). Pada perakitan virion, semua komponen

virus (HA, NA, M2, M1 dan vRNP) dibawa ke regio plasma


membran sel yang kaya dengan detergent-insoluble glikolipid

(DIG) atau disebut lipid raft (Zhang et al. 2000).

Perakitan virion diikuti dengan budding, yaitu pembentukan

dan penutupan kuncup vRNP yang dikelilingi amplop pada

membran sel hospes sehingga virion terlepas ke ekstrasel tanpa

merusak membran sel (review oleh Garoff et al. 1998; Chazal &

Gerlier 2003). Budding dapat terjadi melalui permukaan apikal

atau basolateral sel epitel. Jika budding terjadi pada permukaan

membran basolateral epitel, virus akan menyebar secara sistemik

(Whittaker 2001).

Progeni virus dilepaskan ke ekstrasel jika NA memotong

asam sialat dari reseptor sel hospes, sehingga progeni virus yang

baru dilepaskan tidak berikatan kembali dengan reseptornya

(Stray et al. 2000; Mishin et al. 2005). Peningkatan afinitas HA

pada reseptor asam sialat dapat meningkatkan patogenesitas

infeksi, namun di sisi lain dapat menghambat aktivitas NA pada

proses budding. Pelepasan virus dan penyebarannya

memerlukan keseimbangan fungsi antara kedua glikoprotein (HA

dan NA) tersebut (Kobasa et al. 2001). Inhibitor neuraminidase

sebagai antivirus yaitu zanamivir (Relenza) dan oseltamivir

(Tamiflu) menghambat aktivitas NA sehingga budding tidak dapat

terjadi (Hayden 2006).

Mutasi Gen VAI

Seperti dijelaskan sebelumnya, bahwa enzim RdRp tidak

mempunyai mekanisme enzimatik perbaikan (repair) kesalahan

replikasi, sehingga perubahan nukleotida VAI terjadi terus


menerus dengan tingkatan yang cukup tinggi. Berbeda dengan

polimerase DNA yang hanya mempunyai kesalahan 1 dari 109

basa, kesalahan replikasi oleh RdRp adalah 1 dari 104 nukleotida

per siklus replikasi (review oleh Webster et al. 1992). Selain

mutasi di masing-masing gen akibat tidak adanya mekanisme

repair, mutasi juga dilakukan virus sebagai adaptasi terhadap

tekanan imun hospes atau adaptasi terhadap spesies hospes

baru. Mutasi pada level ini biasanya berbentuk delesi atau

substitusi titik/poin. Substitusi titik/poin dapat dibedakan atas

substitusi sinonim dan substitusi nonsinonim.

Substitusi sinonim adalah perubahan nukleotida tidak diikuti

perubahan ekspresi asam amino. Hal ini terjadi pada semua

asam amino, kecuali metionin dan triptofan yang hanya disandi

oleh 1 kodon. Substitusi sinonim ini menyebabkan kodon bias,

yaitu ketidakseimbangan penggunaan kodon sinonim yang

menyandi asam amino. Kodon bias ini terlihat pada semua

spesies di semua bagian genom, baik daerah intron maupun

ekson. Karena kodon bias tidak mengubah fenotip produk

ekspresi, sehingga kodon bias selalu ada dalam genom.

Penggunaan kodon (codon usage) pada gen berkorelasi dengan

akurasi dan tingkat translasi. Kodon pilihan (codon preference)

biasanya adalah kodon yang tRNA untuk kodon tersebut

melimpah sehingga dapat ditranslasi lebih cepat (Lavler & Kotlar

2005; Wu & Freeland 2005).

Seperti organisme lainnya, substitusi sinonim pada VAI juga

berkaitan dengan kelimpahan tRNA (Plotkin & Dushoff 2003).

Namun, mengingat translasi mRNA pada VAI menggunakan


mekanisme translasi sel hospes, substitusi sinonim tersebut lebih

dikarenakan seleksi penyesuaian terhadap penggunaan kodon

sel hospes. Hal ini terjadi karena perbedaan penggunaan kodon

antara virus dengan sel hospes dapat mempengaruhi kecepatan

translasi protein (Garmory et al. 2003).

Substitusi nonsinonim adalah perubahan nukleotida diikuti

dengan perubahan ekspresi asam amino. Substitusi nonsinonim

hanya terjadi pada bagian tertentu dari gen yang mengalami

tekanan. Semakin sering mengalami tekanan, semakin tinggi

tingkat substitusinya (Plotkin & Dushoff 2003). Adanya tekanan

seleksi akan menyebabkan munculnya varian dengan tingkat

efektivitas replikasi yang tinggi (Jong et al. 2000). Tingkat

perubahan asam amino virus di dalam tubuh hospes (in vivo)

lebih tinggi dibandingkan virus yang ditumbuhkan secara in vitro.

Hal ini menunjukkan bahwa tingginya tekanan imun berkorelasi

dengan perubahan asam amino (Nakajima et al. 2003).

Kecepatan substitusi nonsinonim virus influenza mencapai

2-3x substitusi per posisi per tahun (Tumpey et al. 2002; Swayne

& Suarez 2003). Rasio kecepatan mutasi nonsinonim dan sinonim

sangat penting untuk mempelajari mekanisme evolusi molekuler

sekuen gen tertentu. Rasio kecepatan mutasi nonsinonim/sinonim

(ω = dN/dS) juga merupakan indikator tekanan seleksi pada level

protein. Jika ω=1 berarti seleksi netral, ω<1 berarti seleksi

pemurnian (purifying selection) dan ω=>1 berarti seleksi positif

(Yang et al. 2000).

Analisis genom VAI subtipe H5N1 yang menginfeksi unggas

dan manusia dari tahun 1997-2004 menunjukkan bahwa gen


PB2, HA dan NS1 mengalami tekanan seleksi positif, sementara

gen lainnya (PA, PB1, M, NA, NS2, NP) mengalami tekanan

seleksi pemurnian (Campitelli et al. 2006). Namun, isolat VAI

H5N1 penyebab wabah di Indonesia dan Vietnam pada dekade

terakhir menunjukkan bahwa hanya gen M2 (ω=1,23) dan PB1-F2

(ω=3,01) yang mengalami seleksi positif. Hal ini menunjukkan

keterlibatan gen ini dalam adaptasi VAI pada hospes baru dan

transmisi interspesies. Seleksi positif pada gen M2 terjadi akibat

tekanan seleksi untuk adaptasi VAI dari unggas air ke unggas

darat. Perbedaan pH dan lingkungan seluler antara unggas air

dan unggas darat merupakan tekanan seleksi pada M2 sebagai

kanal ion hidrogen. Tekanan seleksi pada PB1-F2 dikarenakan

peran protein ini dalam menginduksi apoptosis makrofag (Smith

et al. 2006).

Virus AI subtipe H5N1 garis Asia menunjukkan jumlah asam

amino yang mengalami seleksi positif meningkat dari tahun ke

tahun, terutama pada daerah antigenik, posisi glikosilasi dan

kantong pengikat reseptor. Hal ini kemungkinan berhubungan

dengan peningkatan patogenesitas dan kemampuan virus untuk

transmisi ke manusia (Campitelli et al. 2006). Mekanisme virus

untuk menghindar dari sistem imun hospes merupakan tekanan

untuk mutasi secara gradual sehingga muncul strain-strain virus

baru yang secara imunologik berbeda (hanyutan antigenik)

(Munch et al. 2001; Smith et al. 2004). Hanyutan antigenik

berjalan lambat namun progresif dan cenderung menimbulkan

penyakit yang terbatas pada suatu kawasan tertentu (Tumpey et

al. 2002; Swayne & Suarez 2003).


Adaptasi selalu dilakukan VAI, baik adaptasi terhadap

tekanan imun maupun adaptasi pada spesies hospes baru

(Voeten et al. 2000; Taubenberger et al. 2005). Adaptasi

merupakan kekuatan utama dari evolusi. Perbedaan spesies

hospes dan perbedaan tekanan menyebabkan pebedaan

kecepatan evolusi VAI (Brown et al. 2001). Lama infeksi dan

frekuensi reinfeksi virus influenza pada manusia, menyebabkan

tingginya tekanan seleksi oleh sistem imun (Bush et al. 1999;

Suzuki & Nei 2002).

Kecepatan mutasi glikoprotein HA kira-kira 2 x 10-3

nukleotida per posisi per replikasi (Webster et al. 1992).

Kecepatan mutasi HA tersebut lebih tinggi dibanding NA karena

NA bukan merupakan determinan antigenik utama dan jumlah

NA pada permukaan virion hanya 1/5 jumlah HA (Plotkin &

Dushoff 2003). Sekuen nukleotida VAI isolat unggas air di Jawa

Barat yang disepadankan dengan nukleotida Gs/GD/1/96

menunjukkan bahwa jumlah kodon substitusi bervariasi dari 23

sampai 50, dan jumlah substitusi nonsinonim bervariasi dari 5-18

(Susanti et al. 2008a). Tingkat mutasi yang tinggi akibat lemahnya

mekanisme proofreading dari RdRp, menyebabkan perubahan

nukleotida terjadi terus menerus. Kecepatan mutasi HA lebih

tinggi dibanding NA karena NA bukan merupakan determinan

antigenik utama dan jumlah NA pada permukaan virion hanya 1/5

jumlah HA (Plotkin & Dushoff 2003).

Protein internal tidak berperan dalam pengikatan dengan

reseptor sel hospes dan tersembunyi dari antibodi, sehingga

protein ini lebih stabil dibanding glikoprotein permukaan (Plotkin &


Dushoff 2003; Berkhoff et al. 2005). Struktur dan fungsi protein

internal juga sangat mendasar sehingga tidak menguntungkan

VAI jika mutasi terjadi secara cepat. Hal ini menyebabkan VAI

menghadapi konflik intragenom tentang kecepatan mutasi. Gen

atau bagian spesifik gen tertentu dalam genom tersebut

mengalami seleksi positif untuk berubah, sementara gen lain

mengalami seleksi pemurnian untuk tidak berubah (Plotkin &

Dushoff 2003).

Protein/regio protein yang fungsinya berkaitan erat dengan

pertahanan terhadap respon imun hospes, daya adaptasi dan

patogenesitas mempunyai tingkat substitusi nonsinonim lebih

tinggi dibanding substitusi sinonim (Plotkin & Dushoff 2003).

Kecepatan substitusi nonsinonim gen subunit HA1 dari VAI

subtipe H3 sebesar 5,7 x10-3 per posisi per tahun. Hal ini

disebabkan karena pada HA1 terdapat daerah antigenik, kantong

pengikat reseptor dan posisi glikosilasi (Bush et al. 1999). Lima

virus AI subtipe H5N1 isolat unggas air (IPB1-RS s/d IPB5-RS),

mengalami substitusi nonsinonim 3 asam amino kantong pengikat

reseptor. Sebanyak 11 substitusi nonsinonim pada isolat IPB6-

RS, 10 diantaranya merupakan daerah antigenik, posisi glikosilasi

dan kantong pengikat reseptor. Dari 17-18 substitusi nonsinonim

pada 3 isolat virus (IPB7-RS, IPB8-RS dan IPB9-RS), 16

substitusi diantaranya merupakan daerah antigenik, posisi

glikosilasi dan kantong pengikat reseptor (Susanti et al. 2008a).

Hanyutan antigenik (antigenic drift)

Adaptasi terhadap tekanan imun hospes dilakukan VAI

untuk menghindar dari pengenalan dan netralisasi antibodi dan


sel T sitotoksik. Antibodi netralisasi terhadap protein HA bersifat

protektif melawan infeksi, sehingga protein ini paling tinggi

mengalami tekanan imun dibandingkan protein internal (Berkhoff

et al. 2005). Mekanisme VAI untuk menghindar dari sistem imun

hospes merupakan tekanan untuk mutasi secara gradual

sehingga muncul strain-strain virus baru yang secara imunologik

berbeda (hanyutan antigenik) (Horimoto & Kawaoka 2001; Munch

et al. 2001; Smith et al. 2004).

Hanyutan antigenik adalah perubahan secara periodik

akibat mutasi genetik struktur glikoprotein permukaan VAI

sehingga antibodi yang telah terbentuk oleh tubuh akibat infeksi

atau vaksinasi sebelumnya tidak dapat mengenali keberadaan

virus tersebut (Munch et al. 2001). Hanyutan antigenik berjalan

lambat namun progresif dan cenderung menimbulkan penyakit

yang terbatas pada suatu kawasan tertentu (Tumpey et al. 2002;

Swayne & Suarez 2003). Hanyutan antigenik menuntut

pembuatan vaksin selalu diperbarui mengikuti munculnya strain

virus baru (Plotkin et al. 2002; Smith et al. 2004).

Reasorsi dan transmisi VAI

Pandemi dapat terjadi jika subtipe virus influenza baru dapat

melintasi barier hospes antara unggas dan mamalia, termasuk

manusia. Adaptasi VAI strain unggas ke manusia antara lain

melalui reasorsi (reassortment), yaitu pertukaran atau

pencampuran gen. Genom RNA yang tersusun bersegmen-

segmen memudahkan terjadinya reasorsi, yaitu segmen gen

pada strain tertentu digantikan segmen gen sealel dari strain


lainnya. Reasorsi menyebabkan perubahan struktur antigen

secara dominan, sehingga disebut lompatan antigenik (antigenic

shift). Reasorsi hanya dapat terjadi jika suatu sel secara simultan

terinfeksi oleh 2 atau lebih strain VAI yang berbeda, sehingga

terjadi penyusunan kembali suatu strain virus baru yang

bermanifestasi sebagai genotipe virus baru. Hospes yang dapat

diinfeksi oleh 2 jenis strain VAI yaitu strain avian dan manusia

dikenal dengan “mixing vessel”. Hospes ini memungkinkan

sebagai hospes perantara transmisi VAI dari unggas ke manusia

(Ito et al. 1998; Hoffman et al. 2001; Li et al. 2004).

Virus influenza A subtipe H1N1 penyebab pandemi

influenza tahun 1918 mengalami lompatan antigenik sehingga

tahun 1958 muncul subtipe H2N2 dan tahun 1968 muncul subtipe

H3N2 (Belshe 2005). Transmisi langsung VAI Vdari unggas ke

manusia biasanya mengakibatkan kematian, seperti terjadi di

Hongkong tahun 1997-1998. Virus HPAI H5N1 yang menyerang

dan mematikan manusia dan ayam di Hongkong tersebut (Lee et

al. 2001), merupakan produk reasorsi dengan VAI H9N2 yang

bertindak sebagai donor gen internal (Guan et al. 1999). Virus

tersebut kemudian berkembang cepat di pasar unggas

Hongkong, dan mempunyai kemampuan untuk transmisi

langsung ke manusia (Zhou et al. 1999; Cauthen et al. 2000).

Kejadian tersebut merupakan kasus pertama, dimana

infeksi VAI H5N1 langsung pada manusia tanpa terlebih dulu

beradaptasi pada hospes mamalia perantara (Tumpey et al.

2002; Rowe et al. 2003; Sturm-Ramirez et al. 2004). Virus HPAI

H5N1 penyebab wabah di Danau Qianghai Cina tahun 2005 yang


mematikan ribuan unggas air migratori dilaporkan juga

merupakan virus hasil reasorsi (Zhou et al. 2006). Burung puyuh

menyediakan lingkungan yang memungkinkan VAI H3N2 babi

mengalami reasorsi dan menghasilkan virus influenza yang

berpotensi menyebabkan pandemi (Perez et al. 2003).

Transmisi VAI H5N1 dari manusia ke manusia belum

pernah dilaporkan (Buxton et al. 2000; The Writing Committee

WHO 2005; Kandun et al. 2006). Namun, VAI subtipe H5N1

berpotensi sebagai penyebab pandemi influenza pada manusia

melalui 2 mekanisme. Manusia yang terinfeksi VAI H5N1 dan

strain influenza manusia (misalnya H1N1) akan memicu reasorsi,

sehingga memunculkan VAI subtipe H5 yang mampu

ditransmisikan dari manusia ke manusia. Alternatif lain adalah

mutasi langsung VAI H5N1 yang berkemampuan untuk transmisi

dari manusia ke manusia (Russell & Webster 2005).


BAB III

TEKNIK MENUMBUHKAN DAN MENGISOLASI VIRUS AVIAN

INFLUENZA

Penelitian yang berhubungan dengan virus avian influenza

dilakukan di laboratorium standart Biosafety Level 2 (BSL-2) plus

atau BSL-3. Namun untuk propagasi virus AI subtipe H5N1 pada

hewan coba (pada tikus, marmut, ayam atau itik, dll) harus

dilakukan di laboratorium BSL-3. Semakin tinggi potensi suatu

agen penyakit (mikroorganisme) untuk menular dan

menyebabkan penyakit pada manusia (peneliti/pekerja

laboratorium), semakin tinggi tingkat (level) biosafety laboratorium

yang diperlukan. Pada Tabel 2 berisi jenjang safety laboratorium

dan penggunaannya.

Tabel 2. Level laboratorium untuk penelitian yang berhubungan dengan mikroorganisme penyebab penyakit

No Laboratorium Penggunaan Contoh

mikroorganisme

1 Biosafety Level-1 (BSL-1)

Mikroorganisme yang diketahui tidak menyebabkan penyakit pada manusia dewasa yang sehat dan potensi bahayanya minimal bagi pekerja laboratorium dan lingkungan Laboratorium tidak memerlukan lokasi terpisah dari lokasi umum dalam suatu bangunan

Bacillus subtilis

Naegleria gruberi

Infectious canine hepatitis virus

E. Coli‐K12

2 Biosafety Level-2 (BSL-

Mikroorganisme yang berpotensi secara

Epstein‐Barr virus


2) moderat dapat menyerang pekerja laboratorium dan lingkungan. Akses ke laboratorium dibatasi ketika pekerjaan tengah dilakukan

Hepatitis A, B, C, D, E

Neisseria meningitidis

Salmonella

Clostridium botulinum, tetani

Blastomyces dermatitidis

Entomeoeba histolytia


Fasilitas klinis, dignostik, riset atau produksi yang berhubungan dengan agen-agen infeksius yang berpotensi mengakibatkan penyakit berbahaya. Pekerja laboratorium memiliki pelatihan khusus dalam penanganan agen-agen patogenik berbahaya dan diawasi oleh ilmuwan yang kompeten terhadap agen-agen tersebut

Bacillus anthracis

M. tuberculosis

Yersenia pestis

Yellow fever (wild type)

Coccidioides immitis

Avian influenza

HIV

SARS


Mikroorganis/agen-agen eksotik yang ekstrem berbahaya, dan beresiko tinggi dapat menyebar melalui udara. Staf laboratorium terlatih khusus, memakai pelindung khusus dengan tabung oksigen tersendiri Fasilitas laboratorium terisolasi dari tempat-tempat umum, pekerjaan dalam tempat tertutup khusus.

Ebola


Preparasi Sampel

Tahap pertama yang harus dilakukan untuk memperbanyak

dan mengisolasi virus adalah mengambil contoh/sampel yang

diduga mengandung virus. Mengingat VAI berkembang/

bermultiplikasi pada sel epitel saluran pencernaan dan

pernafasan, maka sampel dapat diambil dari usap hidung, usap

anus atau usap kloaka. Sampel usap kloaka diambil dari hewan

yang diperiksa atau hewan/manusia yang diduga terinfeksi VAI.

Sampel usap kloaka/anus/hidung selanjutnya dimasukkan dalam

tabung berisi media transport PBS gliserol (WHO 2002). Sampel

selanjutnya dimasukkan dalam inkubator suhu dingin -4oC atau

lebih dingin lagi. Jika pengambilan sampel dari lapangan, tabung

berisi sampel dimasukkan dalam ice box kemudian dibawa ke

laboratorium. Cara membuat PBS gliserol adalah dengan

mencampurkan PBS 1x dan gliserol dengan perbandingan 1:1.

Dalam 1 liter PBS Gliserol, ditambahkan Penisilin-G 2x106 U/L

dan Srteptomisin 200 mg/L (Susanti et al. 2008b).

Media Perbanyakan virus

Untuk mengetahui apakah pada sampel terdapat virus yang

dimaksud atau tidak, sampel harus ditanam pada media yang

sesuai. Mengingat virus adalah organisme yang hanya dapat

bereplikasi pada sel hidup, maka media yang sesuai untuk

menumbuhkan virus adalah sel hidup. Virus influenza A dapat

bereplikasi secara in ovo pada telur ayam berembrio (TAB)

maupun secara in vitro pada kultur sel Madin Darby Canine


Kidney (MDCK) (Ito et al. 1997; Whittaker 2001). Sel MDCK

mempunyai reseptor α-(2,6) dan α-(2,3) sehingga efektif untuk

replikasi virus influenza isolat manusia maupun avian. Untuk

dapat menumbuhkan virus influenza pada sel MDCK, perlu

ditambahkan protease tripsin untuk memotong HA menjadi HA1

dan HA2 (Webster et al. 1992). Pertumbuhan virus ditandai

adanya cytopathogenic effect (CPE). Karena sel MDCK memiliki

2 jenis reseptor (α-(2,6) dan α-(2,3)), kultur virus influenza pada

MDCK tidak menyebabkan tekanan seleksi sehingga tidak terjadi

substitusi asam amino tertentu, namun kurang efektif jika

digunakan untuk mendapatkan virus dalam jumlah besar (Ito et al.

1997).

Ruang alantois TAB hanya mempunyai reseptor α-(2,3),

sementara pada sel amnion mempunyai reseptor α-(2,6) dan α-

(2,3). Secara in ovo, perbedaan reseptor sel hospes dengan

spesifisitas asam amino titik pengikat reseptor merupakan

tekanan seleksi yang memicu substitusi hemaglutinin (HA). Kultur

virus influenza strain manusia pada sel amnion (yang mempunyai

reseptor α-(2,6) dan α-(2,3)), sampai pasase ke-2 masih

mempertahankan spesifisitas reseptor pada α-(2,6). Namun, jika

virus influenza strain manusia ini dikultur pada sel alantois yang

hanya mempunyai reseptor α-(2,3) menyebabkan mutasi

substitusi L226G sehingga spesifisitas reseptor bergeser dari α-

(2,6) menjadi α-(2,3) (Ito et al. 1997). Isolasi virus dalam TAB

lebih tepat untuk strain avian (Ito et al. 1997). Meskipun demikian,

menurut hasil-hasil penelitian selanjutnya menunjukkan bahwa

semua virus influenza dapat tumbuh baik di TAB (Webster et al.


1992; Harimoto & Kawaoka 2001; Whittaker 2001). Hal ini

disebabkan karena protease serupa dengan faktor pembeku

darah “Xa” (anggota famili protrombrin) dalam cairan alantois

bertanggung jawab atas proteolitik HA pada cleavage site

sehingga virus dapat bereplikasi secara in ovo (Harimoto &

Kawaoka 2001). Protease yang dapat memotong HPAI dan LPAI

adalah enzim “trypsin like”, yaitu faktor pembeku darah “Xa”,

triptase, mini plasmin dan protease bakterial (Harimoto &

Kawaoka 2005). Enzim proteolitik mengenal sekuen asam amino

motif B-X-B-R (B=asam amino basa, X=asam amino non-basa)

(Harimoto & Kawaoka 2001).

Propagasi virus pada TAB merupakan metode yang

banyak dilakukan untuk diagnosis, isolasi virus, identifikasi virus

dan uji neutralisasi. TAB merupakan metode terbaik untuk isolasi

virus influenza, karena lebih sensitif dibandingkan sel kultur

MDCK (Clavijo et al. 2002). Meskipun demikian, MDCK

merupakan sel yang paling sensitif untuk isolasi virus influenza A

dibanding sel kultur Vero dan MRC-5 (Reina et al. 1997).

Propagasi virus pada TAB digunakan sebagai metode pembuatan

vaksin influenza A yang telah beredar selama beberapa dekade

(kurang lebih 30 tahun) (Scannon 2006). Lebih lanjut disebutkan

bahwa TAB merupakan media utama produksi vaksin influenza

baik inaktif maupun vaksin hidup yang dilemahkan (Lu et al. 2005;

Szecsi et al. 2006).


Metode Propagasi Virus pada Telur Ayam Berembrio SPF

Setiap sampel dari setiap ekor hewan yang diduga

mengandung virus, idealnya ditumbuhkan pada 1 butir TAB.

Namun, hal ini bergantung pada tujuan penelitian dan

ketersediaan biaya. Jika tujuannya untuk mengetahui apakah

hewan-hewan di suatu tempat (biasanya hewan dipelihara

berkelompok) terinfeksi, maka sampel diambil secara sampling

atau diambil semua. Jika sampel diambil semua, untuk efisiensi

biaya dan tujuan tercapai, maka sampel di-polling. Setiap 1-4

sampel usap kloaka/anus/hidung (masing masing sebanyak 100

µl) dikumpulkan (polling) menjadi satu inokulum berdasarkan jenis

hewan dan pemilik. Hal ini ditujukan untuk efisiensi jumlah TAB.

Jika sampel yang dianalisa menunjukkan hasil positif, hal ini

berimplikasi pada pengambilan keputusan bahwa hewan di lokasi

dan hewan tersebut terdapat hewan positif terinfeksi virus AI

sehingga pencegahan dan pengendaliannya ditujukan pada

semua hewan dan manusia di kawasan tersebut (Susanti et al.

2008b). Inokulum yang berhasil ditumbuhkan dalam TAB,

menunjukkan bahwa pada sampel mengandung virus yang hidup

dengan jumlah melebihi ambang batas untuk dapat tumbuh

dalam TAB yaitu 1 egg infectious dose 50% (EID50) (Beato et al.

2007; Terregino et al. 2007).

TAB yang digunakan hendaknya specific pathogen free

(SPF). Artinya, jika kita akan menumbuhkan sampel yang diduga

mengandung virus AI, maka TAB yang digunakan minimal bebas

dari virus tersebut. Hal ini sangat penting dilakukan untuk

memastikan bahwa jika hasilnya positif, virus tersebut bebar-


benar berasal dari sampel dan bukan dari TAB. TAB dapat

diperoleh di laboratorium-laboratorium yang memproduksi TAB

SPF, seperti laboratorium pada perusahaan yang memproduksi

vaksin.

Sampel usap kloaka ditumbuhkan pada TAB (SPF) umur 9

hari. Inokulum dibuat dengan mencampur sampel usap kloaka ke

dalam tabung yang telah berisi 10 µl phosphate buffer saline

(PBS) yang mengandung 2x106 U/L penisilin dan 200 mg/L

streptomisin. Setelah diinkubasi 30 menit pada suhu kamar,

inokulum diinokulasikan pada ruang alantois TAB SPF. Telur

diinkubasi pada suhu 37 oC dan diamati setiap hari selama 4 hari.

Telur ayam berembrio yang mati sebelum hari keempat dan

embrio yang masih hidup sampai hari ke empat, dipanen cairan

alantoisnya untuk diidentifikasi kemampuannya mengaglutinasi

sel darah merah (SDM) (WHO 2002; Susanti et al. 2008b).

Berdasar hasil penelitian, kurva pertumbuhan virus HPAI

H5N1 pada TAB selama 24 jam menunjukkan bahwa virus telah

bereplikasi dengan jumlah titer virus cukup tinggi (Gambar 4)

(Susanti 2009; data tidak dipublikasi). Menurut Coleman (2007),

proses replikasi virus terjadi sangat cepat, yaitu 10 jam. Ambang

batas jumlah virus yang viabel yang dapat tumbuh dalam telur

ayam berembrio adalah 1 EID50 (Beato et al. 2007; Terregino et

al. 2007). Pada kurva pertumbuhan nampak bahwa pertumbuhan

mencapai titer tertinggi pada inkubasi 48 jam (2 hari). Setelah 48

jam, titer virus pada cairan alantois mulai menurun. Menurunnya

jumlah titer virus pada inkubasi lebih dari 48 jam, kemungkinan

disebabkan oleh semakin banyaknya penyebaran virus pada


berbagai organ embrio, sehingga pada cairan alantois

menunjukkan penurunan titer virus (Susanti 2009, data tidak

dipublikasi).

Gambar 4. Pertumbuhan virus avian influenza subtipe H5N1 pada

TAB (Susanti 2009)

Pada inkubasi 24 jam, virus dapat terdeteksi di sebagian

besar pembuluh darah (Susanti 2009, data tidak dipublikasikan).

Virus berikatan dengan reseptor α-(2,3) pada sel alantois,

bereplikasi dan dilepaskan dalam cairan alantois. Dari cairan

alantois, virus masuk sistem pembuluh darah dan keluar pada

tissu-blood junction (Kuiken et al. 2006). Virus HPAI dilaporkan

dapat bereplikasi secara efisien pada sel endotel pembuluh darah

dan perivaskuler sel parenkim, sehingga virus dapat terdeteksi

pada berbagai organ internal dan pembuluh darah (Harimoto &

Kawaoka 2005; Swayne 2007). Dengan metoda imunohistokimia,

0

5

10

15

20

15 jam 24 jam 39 jam 48 jam 63 jam

Tite

r vi

rus

(lo

g 2

)

Kurva pertumbuhan virus

Isolat BP6

Isolat SB6


antigen virus dapat terdeteksi pada organ ginjal, paru-paru, hati

dan intestinum (Gambar 5). Pada ginjal, virus banyak terdapat di

glomerulus. Pada intestinum, virus banyak terdeteksi di epitel vili,

lumen dan serosa. Pada paru, terutama virus banyak terdapat di

pembuluh darah (Susanti 2009, data tidak dipublikasikan). Infeksi

virus HPAI H5N1 secara in vivo pada itik menunjukkan bahwa

virus menyebar secara sistemik pada trakea, paru, hati, pankreas,

rektum, bursa fabrisius, limpa, otak, jantung dan ginjal (Songserm

et al. 2006). Pada mamalia (mencit), infeksi HPAI H5N1 isolat itik

juga menyebar secara sistemik pada limpa, ginjal dan otak (Chen

et al. 2004).

C D

A B


Gambar 5. Antigen virus virus HPAI H5N1 isolat unggas air pada

organ-organ embrio. (A) Glomerulus, (C) Intestinum, (E) Paru-

paru. B, D dan F adalah kontrol negatif (Susanti 2009)

E F


BAB IV

TEKNIK IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA DAN

SUBTIPENYA

Deteksi atau identifikais virus AI dapat dilakukan dengan uji

hemaglutinasi (HA), Uji Agar Gel Immunodiffusion (AGID) Test

atau dikenal juga dengan Agar gel Presipitation test (AGPT),

haemagglutination inhibition (HI), atau PRC (WHO 2002; OIE

2005b). Uji HI dan AGID dilakukan untuk mengetahui variasi

antigenik molekul HA virus dengan mereaksikannya dengan

antibodi monoklonal/poliklonal (WHO 2002; OIE 2005).

Uji Hemaglutinasi (HA)

Sebagai skrining awal keberadaan virus influenza adalah uji

hemaglutinasi (HA). Uji hemaglutinasi digunakan untuk

mendeteksi keberadaan virus yang mempunyai kemampuan

mengaglutinasi sel darah merah. Hemaglutinasi adalah terjadinya

penggumpalan sel darah merah (SDM). Penggumpalan dapat

diakibatkan oleh protein hemaglutinin yang dimiliki oleh beberapa

virus seperti golongan virus influenza, virus New castle disease,

virus mixo, dan virus rabies. Dengan demikian, untuk identifikasi

virus AI menggunakan uji HA ini memiliki diagnostik banding virus

New-castle yang juga memiliki hemaglutinin. Hemaglutinin akan

melekat secara spontan pada SDM. Bagian dari virus yang

melekat SDM merupakan bagian spesifik (yaitu glikoprotein

hemaglutinin), yang mampu berikatan dengan reseptornya (yang


spesifik juga) pada SDM. Secara sederhana, konsep dasar

hemaglutinasi digambarkan di Gambar 6.

Jika sampel yang diduga mengandung berasal dari unggas,

virus yang berkemampuan mengaglutinasi SDM merupakan virus

golongan Orthomyxoviridae (misal: virus influenza) atau

Paramyxoviridae (misal: New Castle Disease; ND) (OIE 2004).

Dengan demikian, jika hasil uji HA positif, kemungkinan sampel

mengandung virus ND atau virus AI, sehingga perlu diuji lebih

lanjut dengan penanda lain (misal dengan PCR atau uji

antigenesitas). Uji HA dapat dilakukan 2 tahap, yaitu secara

makro dan secara mikro (Susanti et al. 2008b). Uji HA secara

makro hanya ditujukan untuk mendeteksi keberadaan virus yang

memiliki protein hemaglutinin (kualitatif) sehingga mampu

mengaglutinasi, sementara uji HA mikro ditujukan untuk

mengatahui titer virus (kuantitatif) yang mampu mengaglutinasi

sel darah merah.

Gambar 6. Hemaglutinasi sel darah merah oleh virus yang

mampu mengaglutinasi


Metode Uji Hemaglutinasi (HA)

Sebelum uji HA titrasi secara mikro, dilakukan uji aglutinasi

cepat dengan mencampurkan satu tetes cairan alantois dengan

SDM ayam 5% (v/v). Keberadaan virus ditunjukkan adanya

aglutinasi SDM dalam waktu 15 detik setelah dicampur. Cairan

alantois yang positif berdasar uji HA cepat, selanjutnya dilakukan

uji HA secara mikro menggunakan microplate U buttom (Nunc).

Uji hemaglutinasi cairan alantois dilakukan sesuai dengan

prosedur standar yang berlaku. Sumur 1–12 dari microplate diisi

dengan PBS pH 7,2 masing-masing 25 l dengan mikropipet

kapasitas 10-100 l. Cairan alantois diambil sebanyak 25 l dan

dimasukkan ke dalam sumur yang telah ditandai dengan nomor

sampel uji. Selanjutnya cairan alantois diencerkan bertingkat

kelipatan dua dengan PBS, kemudian ditambahkan 25 l

suspensi SDM ayam 0,5% ke dalam seluruh sumur. Tahap

terakhir dilakukan pengocokan microplate dengan menggoyang-

goyangkannya, kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama

kurang lebih 30 menit. Pembacaan hasil uji dapat dilakukan

apabila SDM pada sumur kontrol telah teraglutinasi di dasar

sumur. Sampel dinyatakan positif apabila SDM pada sumur

sampel mengalami aglutinasi. Titer HA dihitung berdasarkan

pengenceran tertinggi alantois yang dapat mengaglutinasi SDM

(WHO 2002; Susanti et al. 2008b). Contoh hasil uji HA terlihat

pada Gambar 7.


Gambar 7. Gambaran contoh hasil uji HA

Uji Agar Gel Immunodiffusion (AGID) Test

Uji AGID atau dikenal juga dengan Agar gel Presipitation

test (AGPT) adalah teknik imunopresipitasi, merupakan salah

satu cara yang banyak dipakai untuk mengukur secara kualitatif

antigen atau antibodi. Walaupun uji ini kurang peka dibanding

dengan uji pengikatan primer, namun relatif mudah dilakukan.

Pada uji ini digunakan selapis media agar yang dilubangi (dengan

alat khusus) membentuk sumur-sumur. Kemudian ke dalam

sumur-sumur tersebut masing-masing diisi dengan antigen dan

serum yang mengandung antibodi pereaksi. Antigen dan antibodi

akan merembes, berdifusi ke sekitar sumur secara radial

(Gambar 8). Apabila antigen bereaksi dengan antibodi spesifik,

akan terbentuk kompleks antigen-antibodi yang besar sehingga

kompleks akan mengendap dan terjadi presipitasi yang


membentuk garis putih (homolog). Tetapi bila tidak ada

kesesuaian antara antigen dan antibodi (heterolog), maka garis

presipitasi tidak akan terbentuk.

Gambar 8. Pembentukan presipitasi pada uji AGPT

Perbandingan antigen dengan antibodi merupakan faktor

penting dalam reaksi presipitasi. Presipitat terbentuk apabila

antara konsentrasi antigen dengan antibodi tercapai

keseimbangan. Kondisi antigen berlebihan akan mengakibatkan

melarutnya kembali komplek yang terbentuk, hal ini disebut

postzone effect. Sementara jika antibodi berlebih mengakibatkan

komplek antigen-antibodi tetap ada dalam larutan, kondisi ini

disebut prozone effect.

Uji ini dapat juga digunakan dalam penentuan hubungan

antara dua antigen. Pada percobaan ini menggunakan tiga

lubang di media agar, satu sumur diisi antibodi dan dua sumur

lainnya diisi antigen (Gambar 9). Bila kedua garis presipitasi yang

terbentuk tepat bersesuaian, maka kedua antigen dianggap

identik (9a) Garis-garis presipitasi yang bersilangan menunjukkan


kedua antigen berbeda (9b) Garis presipitasi yang melanjut

sebagai taji mempunyai determinan antigen yang tidak ada pada

yang lain (9c). Bila garis-garis bersatu dengan pembentuk taji,

maka terdapat identitas parsial dengan masing-masing antigen

mempunyai determinan antigen bersama (9d).

Gambar 9. Interpretasi hasil AGPT

Metode uji AGPT

Pada identifikasi virus AI, uji AGPT lebih spesifik

dibandingkan uji HA. Karena uji AGPT dapat digunakan untuk

menentukan subtipe virus AI, meskipun masih sangat kasar

sehingga pelu dilakukan uji subtipe lebih lanjut secara molekuler.

Jika sampel cairan alantois yang positif berdasarkan uji HA, akan

kita identifikasi subipenya menggunakan uji AGPT, maka kita

harus memiliki antibodi spesifik terhadap virus subtipe yang

dimaksud. Misalnya kita akan uji virus subtipe H5N1, maka kita

harus punya antibodi terhadap H5N1.

1 2

3

1 2

3

1 2

3

1 2

3

a b

c

d

d


Pertama disiapkan agarnya. Caranya adalah Agar Nobel atau

Agarose(0,4gram), Polyethylene Glikol (PEG) 6000 (1,2 gram),

Phosphat Buffer Saline (PBS) pH 7,2 (25 ml) dan Aquadest (25

ml) dicampur sampai larut menggunakan magnetic stirer.

Selanjutnya dipanaskan sampai mendidih dan terlihat bening

semua, yang berarti agar sudah larut sempurna. Kemudian, 4 ml

agar yang masih hangat dituang di atas objek gelas secara

merata. Selanjutnya dibiarkan sampai dingin dan membeku.

Setelah dingin, dibuat sumur-sumur dengan cara melubangi agar

menggunakan cetakan khusus untuk AGPT (Gel Puncher).

Diusahakan supaya pinggiran sumur tidak retak/pecah.

Setelah terbentuk sumur-sumur pada agar, setiap sumur

diisi dengan antigen (cairan alantois) dan serum (berisi antibodi

spesifik H5N1 misalnya). Pengisisan pada sumur-sumur

dilakukan sesuai dengan jumlah sampel yang akan kita uji. Jika

memiliki 6 sampel, maka antibodi dimasukkan pada sumur yang

di tengah, dan masing-masing sampel dimasukkan pada sumur di

tepinya sehingga semua sampel punya kesempatan berinteraksi

dengan antibodi yang posisinya di tengah. Jika sampel sedikit,

polanya disesuaikan dengan kebutuhan, namun yang perlu

diingat bahwa setiap sampel berkesempatan untuk berinteraksi

dengan antibodi. Media agar yang telah diisi (sampel dan

antibodi) tersebut dimasukkan ke dalam baskom yang diberi alas

kertas yang dibasahi PBS. Baskom ditutup dan diinkubasi pada

suhu kamar selama 20-48 jam. Kelembapan dijaga dengan

membasahi alas.kertas. Hasil percobaan diketahui dengan

mengamati terbentuknya garis presipitasi (Gambar 10). Jika


terbentuk garis presipitat diantara sumur sampel (berisi cairan

alantois) dan antibodi terhadap H5N1 (misalnya), sampel tersebut

mengandung virus AI subtipe H5N1. Namun untuk meneguhkan

dugaan tersebut perlu diuji lebih lanjut secara molekuler.

Gambar 10. Contoh hasil AGPT

Identifikasi subtipe virus avian influenza secara molekuler

Cairan alantois yang positif bersadarkan uji HA, diisolasi

RNA-nya dan diidentifikasi subtipe virus AI-nya berdasarkan gen

hemaglutinin (HA) dan neuraminidase (NA). Seperti disebutkan

sebelumnya bahwa virus influenza dikelompokkan berdasarkan

tipe A, B dan C. Masing-masing tipe dikelompokkan lagi

berdasarkan sub-sub tipe gen HA dan NA. Sampai saat ini telah

diketahui ada 9 subtipe N (N1 s/d N9) dan 16 subtipe H (H1 s/d

H16). Secara garis besar, identifikasi subtipe virus AI adalah


isolasi RNA virus, RT-PCR menggunakan primer spesifik HA dan

NA dan elektroforesis produk RT-PCR.

Metode Isolasi RNA Virus

Mengapa RNA, dan bukan DNA? Karena material genetik

virus AI adalah RNA, dan bukan DNA. Isolasi RNA virus dapat

dilakukan dengan kit/reagen yang telah dikomersialkan secara

luas. Contoh yang ditampilkan dalam buku ini menggunakan

Trizol®LSReagent, sesuai dengan petunjuk produsen. Sebanyak

250 μl cairan alantois dan 750 μl Trizol dimasukkan dalam tabung

1,5 ml, dan dicampur sampai homogen. Setelah diinkubasi 5

menit pada suhu ruang (15-30 oC), ditambah 200 μl kloroform,

kemudian dikocok dan diinkubasi 10 menit pada suhu ruang (15-

30 oC). Larutan selanjutnya disentrifus 12000 g selama 15 menit

pada suhu 4 oC. Supernatan (fase aqueous) diambil dan

dimasukkan pada tabung 1,5 ml baru (jangan sampai endapan

dan lapisan berwarna merah ikut terambil). Setelah ditambah

isopropanol 500 μl dan dicampur sampai homogen, larutan

diinkubasi 10 menit pada suhu ruang (15-30 oC). Larutan

selanjutnya disentrifus 15 menit dengan kecepatan 12000 g pada

suhu 4 oC. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang, dan

endapannya dicuci dengan 1000 μl etanol 70% (dalam H2O

dietylpirocarbonat (DEPC)). Setelah divorteks beberapa menit,

larutan disentrifus 12000 g pada suhu 4 oC selama 20 menit.

Supernatan hasil sentrifugasi dibuang, dan pelet RNA dikeringkan

pada suhu ruang selama 15-20 menit. Setelah pelet kering,

disuspensi kembali dengan 30μl H2O bebas nuklease (ultrapure


H2O). Larutan RNA selanjutnya disimpan pada suhu -20oC

sampai dilakukan RT-PCR (Susanti et al. 2008b).

Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Reverse transcription (RT) adalah pembuatan cDNA yang

bersifat komplementer dengan RNA virus, menggunakan enzim

reverse transcriptase. Mengapa RT-PCR dan bukan PCR biasa?

Perlu diingat bahwa material genetik virus AI adalah RNA, bukan

DNA. Setelah reaksi pembentukan cDNA dari RNA (melalui

reverse transcription), cDNA selanjutnya diperbanyak pada

sekuen gen spesifik menggunakan sepasang primer

oligonukleotida menggunakan teknik PCR. PCR merupakan

metode alternatif untuk mengidentifikasi virus AI, meskipun

material genetik virus hanya terdapat dalam jumlah sedikit (WHO

2002; Payungporn et al. 2004; OIE 2005). Dengan metode ini,

berbagai subtipe virus dapat didentifikasi, tergantung primer yang

digunakan.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reaksi rantai polimerase (polymerase chain

reaction/PCR), yang ditemukan oleh Kary Mullis pada

pertengahan 1980-an, merupakan salah satu tonggak revolusi

dalam genetika molekuler. Teknik ini memungkinkan pendekatan-

pendekatan baru dalam studi dan analisis gen. Di masa lalu,

masalah utama dalam analisis molekuler adalah gen dalam

genom suatu makhluk yang dianggab sangat rumpil, lebih-lebih

pada mamalia. Mamalia dapat mempunyai sampai lebih dari


seratus ribu gen. Berbagai teknik dalam genetika molekuler

ditujukan untuk mengatasi masalah ini. Teknik tersebut umumnya

memerlukan waktu yang relatif lama dan prosedur yang sangat

sulit, meliputi pengklonan dan pelacakan urutan DNA yang khas.

PCR merupakan metode yang memungkinkan kita memperoleh

urutan DNA tertentu tanpa melalui pengklonan.

Teknik PCR sebenarnya mengekploitasi berbagai sifat

alami replikasi DNA. Dalam proses tersebut, polimerase-DNA

menggunakan DNA berserat tunggal sebagai cetakan untuk

mensintesis serat baru yang komplementer. Di laboratorium,

cetakan berserat tunggal dapat diperoleh dengan mudah melalui

pemanasan DNA berserat ganda pada temperatur mendekati titik

didih. Polimerase-DNA juga memerlukan suatu wilayah berserat

ganda pendek untuk memulai (“prime“) proses sintesis. Pada

PCR, posisi awal dan akhir sintesis DNA dapat ditentukan dengan

menyediakan suatu oligonukleotida sebagai primer yang

menempel secara komplementer pada cetakan sesuai dengan

tujuan penelitian. Inilah keunggulan PCR yang pertama, yaitu

polimerase-DNA dapat diarahkan untuk sintesis wilayah DNA

tertentu.

Kedua serat DNA dapat berfungsi sebagai cetakan untuk

sintesis bila primer oligonukleotida disediakan untuk masing-

masing serat. Sepasang primer dapat dipilih untuk membatasi

(“flanking“) wilayah DNA yang akan diperbanyak, sehingga serat

DNA yang baru akan disintesis dari posisi primer membentang

sampai melewati posisi primer dari serat lainnya. Dengan

demikian, tempat ikatan primer baru akan dibuat pada serat DNA


yang baru disintesis. Campuran reaksi kemudian dipanaskan lagi

untuk memisahkan serat awal dengan baru, yang kemudian

berperan sebagai cetakan untuk siklus penempelan primer,

sintesis serat DNA dan pemisahan serat. Hasilnya adalah,

setelah n kali siklus, campuran reaksi mengandung sebanyak 2n

molekul DNA serat ganda, yang merupakan salinan dari urutan

DNA di antara kedua primer. Ini merupakan keunggulannya PCR

yang kedua, yaitu PCR menghasilkan amplifikasi wilayah DNA

tertentu.

PCR merupakan teknik laboratorium yang relatif mudah,

sehingga dapat diterapkan pada berbagai bidang kajian makhuk

hidup. Bahan awal dari PCR adalah DNA yang mengandung

urutan yang akan diampliflikasi. Jumlah DNA yang diperlukan

juga relatif kecil. Pada percobaan yang biasa, kurang dari 1μg

DNA dari seluruh DNA genom sudah cukup digunakan untuk

PCR. Bahkan PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi dari

satu molekul DNA. Selain DNA, untuk PCR diperlukan primer

oligonuklotida yang ditujukan sebagai posisi awal untuk sintesis

serat baru, polimerase-DNA, dan campuran keempat dNTP

ditambahkan ke dalam tabung yang mengandung DNA. Volume

keseluruhan biasanya 25-100μl.

Langkah berikutnya adalah pemanasan dari campuran

reaksi pada temperatur 94°C selama beberapa menit. Pada

temperatur ini, molekul DNA yang berserat ganda terpisah

dengan sempurna, menjadi serat tunggal. Temperatur kemudian

diturunkan agar primer oligonukleotida menempel pada posisi

yang sesuai pada cetakan. Temperatur penempelan (“annealing“)


ini dapat sangat beragam sesuai urutan DNA yang diamplifikasi.

Penempelan primer menghasilkan posisi awal untuk aktivitas

polimerase-DNA.

Langkah berikutnya adalah peningkatan temperatur pada

72°C, sebagai temperatur optimum dari enzim polimerase-DNA

Taq. Kondisi ini dipertahankan beberapa menit untuk

penyelesaian sintesis DNA. Setelah satu siklus berakhir,

temperatur ditingkatkan lagi sampai 94°C selama beberapa puluh

detik, sehingga DNA serat ganda yang pendek (serat awal dan

serat baru) terpisah. Serat tunggal tersebut kemudian berfungsi

sebagai cetakan untuk siklus sintesis DNA berikutnya. Satu

siklus, yang terdiri dari pemanasan untuk pemisahan serat,

penempelan primer, dan sintesis oleh polimerase-DNA, diulang

sampai 30-40 kali.

Polimerase Taq menyederhanakan dan meningkatkan

penampilan PCR. Pada mulanya, Polimerase-DNA dari E. coli

digunakan dalam PCR. Tetapi, karena enzim ini sangat peka

pada panas dan rusak pada temperatur 94oC, enzim segar harus

selalu ditambahkan pada setiap siklus. Ini merupakan proses

yang memerlukan tenaga dan tidak praktis. Dengan

ditemukannya bakteri yang hidup pada sumber air panas,

merupakan penemuan penting untuk mempermudah PCR.

Bakteri ini mempunyai polimerase-DNA yang bekerja optimum

pada temperatur tinggi. Bakteri ini adalah Thermus aquaticus,

yang hidup dalam air dengan temperatur 75°C. Polimerase-DNA-

nya (disebut polimerase Taq) mampunyai temperatur optimum

72°C dan masih stabil pada 94°C. Polimerase Taq cukup


ditambahkan sekali saja pada awal reaksi dan akan tetap aktif

setelah melewati siklus PCR secara lengkap. Perkembangan ini

memungkinkan otomatisasi PCR melalui mesin penyiklus panas,

merupakan blok pemanas yang dapat diprogram untuk

pelaksanakan siklus PCR dengan waktu dan temperatur tertentu.

Sekarang ini, tabung reaksi dengan komponen reaksinya dapat

diletakkan pada mesin penyiklus panas tanpa intervensi manual.

Metode RT-PCR

Identifikasi subtipe H5 dan N1 dapat dilakukan berturut-

turut menggunakan pasangan primer H5-1 dan H5-3 (WHO

2005a) serta CU-N1F dan CU-N1R (Payungporn et al. 2004).

Sementara, untuk isolat yang bukan subtipe H5 dan bukan N1

identifikasi lebih lanjut terhadap Newcastle disease virus (NDV)

menggunakan pasangan primer NDVF dan NDVR (Creelan et al.

2002). Besaran produk PCR dari ketiga pasang primer tersebut

relatif kecil (yaitu 219bp untuk H5, 131bp untuk N1 dan 202bp

untuk NDV) sehingga lebih sensitif dan spesifik (Payungporn et

al. 2004). Untuk identifikasi subtipe virus, setiap isolat

diamplifikasi dengan primer H5 dan N1. Isolat yang positif

berdasarkan uji hemaglutinasi, namun hasil PCR negatif H5 dan

N1, dilakukan PCR menggunakan primer spesifik untuk NDV

(Creelan et al. 2002) (Susanti et al. 2008b). Sekuen primer gen

H5, N1 dan ND terlihat pada Tabel 3. Selain menggunakan primer

tersebut, dapat juga menggunakan pasangan primer lain yang

direkomendasikan oleh peneliti-peneliti lain, atau didesain

berdasarkan pustaka genom virus ini yang tersedia di GenBank.


Tabel 3. Sekuen basa primer untuk mengamplifikasi gen H5, N1 dan ND serta besaran produk PCR yang diharapkan

Primer Sekuen basa Fragmen Gen

Produk (bp)

1a H5-1: 5‟GCC ATT CCA CAA CAT

ACA CCC‟3 H5-3: 5‟CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG‟3

H5 (basa 915-

1133)

219

2b CU-N1F:

5‟GTTTGAGTCTGTTGCTTGGTC‟3 CU-N1R: 5‟TGATAGTGTCTGTTATTATGCC‟3

N1 (basa

479-609)

131

3c NDVF:

5‟GGTGAGTCTATCCGGARGATACAAG‟3* NDVR: 5‟TCATTGGTTGCRGCAATGCTCT‟3*

NDV (basa 4829-

5030)

202

*R=(A/G) aWHO (2005b), bPayungporn et al (2004), cCreelan et

al (2002)

Metode RT-PCR sangat bervariasi tergantung pada primer

dan reagen kit yang digunakan. Salah satu cara RT-PCR untuk

virus AI adalah menggunakan SuperscriptTM III One-step RT-

PCR system. Reaksi PCR dibuat sebanyak 50 l dengan

komposisi 25 l 2x reaction mix, 2 l primer forward (10 M), 2 l

primer reverse (10 M), 2 l Superscript III RT/Platinum Taq Mix,

3 l sampel RNA dan ultrapure H2O sampai volume 50l. Primer

yang digunakan untuk mengamplifikasi gen H5 dan N1 terlihat

pada Tabel 3. Program RT-PCR adalah reverse transcription 45

oC selama 60 menit predenaturasi 95 oC selama 5 menit, 35


siklus terdiri dari denaturasi 95 oC 30 detik, anneling 55 oC 30

detik, ekstensi 72 oC 40 detik, dan post ekstensi 72 oC 10 menit

(Payungporn et al. 2004; WHO 2005a; Susanti et al. 2008b).

Untuk identifikasi subtipe virus, setiap isolat diamplifikasi dengan

primer H5 dan N1. Isolat yang positif berdasarkan uji

hemaglutinasi, namun hasil PCR negatif H5 dan N1, dilakukan

PCR menggunakan primer spesifik untuk NDV (Tabel 3) dengan

anneling 48 oC (Creelan et al. 2002). Adanya pita DNA spesifik

hasil PCR diidentifikasi dengan elektroforesis pada gel agarose

2%.

Elektroforesis

Elektroforesis merupakan salah satu teknik pemisahan

molekul yang banyak digunakan dalam ilmu-ilmu hayati. Dasar

teknik pemisahan ini adalah molekul yang memiliki gugus

bermuatan memiliki perbedaan migrasi jika diletakkan dalam

suatu medan listrik. Pemisahan terjadi berdasarkan pada

perbedaan kecepatan bergerak dari masing-masing substansi,

tanpa terjadi pengaruh timbal balik secara kimiawi atau absorbsi

antara gel dengan sampel. Molekul biologis yang memiliki gugus

bermuatan antara lain adalah asam amino, peptida, protein dan

asam nukleat.

Gerak medan listrik pada elektroforesis (katoda/anoda)

dapat terjadi karena adanya arus listrik yang berlawanan. Kation

akan bergerak ke arah kutub bermuatan (-) atau anoda,

sedangkan anion akan bergerak ke arah kutub bermuatan (+)

atau anoda. Kecepatan gerak dari masing-masing substansi


secara individu adalah proporsional dengan mobilitet relatif

secara elektroforesis dari suatu molekul. Mobilitet relatif tersebut

merupakan karakteristik fisiko-kimiawi molekul, hal ini dapat

dibandingkan dengan mobilitet dari substansi standart seperti

bromphenol blue, Xylen-cyanol atau bromkresolgreen. Mobilitet

elektroforesis suatu molekul sangat bergantung pada muatannya,

sedangkan muatannya sendiri tergantung pada pH substansi, pH

buffer, konsentrasi ion dari buffer dan temperatur. Bilamana

diameter molekul dari pori-pori gel mempunyai kesamaan, maka

pergerakan substansi dalam medium (gel) ditentukan pula oleh

kuat gesekan masing-masing molekul besar. Dalam hal ini,

kecepatan bergerak suatu molekul ditentukan oleh muatannya,

diameter ataupun bentuk molekul (seperti struktur tertier dari

protein).

Agar elektroforesis dapat berjalan lancar, sampel harus

dilarutkan atau disuspensikan dalam larutan buffer supaya arus

dapat diantarkan, medium pendukung harus dijenuhkan dengan

buffer. Selama elektroforesis, arus dapat dipertahankan karena

ada elektrolit pada elektroda yang tercelup dalam tendon buffer.

Deteksi dasil pemisahan proses elektroforesis dapat dilakukan

langsung pada gel pewarna, dengan reagen spesifik, enzim

substrat reaction system, immunopresipitasi, autoradiografi,

fluorografi atau secara langsung dengan immunoprint (bloting

teknik).


Metode Elektroforesis Hasil RT-PCR pada Gel Agarose 2%

DNA hasil PCR yang diperoleh dianalisa dengan teknik

elektroforesis menggunakan ultrapureTM agarose 2%. Sebanyak 2

g agarose dilarutkan dengan 100 ml Tris Buffer EDTA (TBE) 1x,

kemudian dipanaskan dalam microwave sampai larutan menjadi

jernih. Larutan didinginkan pada suhu kamar sampai dingin

(hangat-hangat kuku), kemudian dimasukkan 3 µl ethidium

bromide (10mg/ml) dan dicampur sampai homogen. Agarose

kemudian dituang pada cetakan gel yang telah dipasang sisir,

dan dibiarkan sampai membeku. Setelah membeku, gel

dimasukkan bak elektroforesis yang telah diisi larutan buffer TBE

1x sampai semua gel terendam. Sebanyak 7 µl produk PCR

dicampur dengan 2 µl loading dye kemudian dimasukkan ke

dalam sumur-sumur pada gel. Running dilakukan pada 135 volt

selama 20 menit. Keberadaan pita-pita DNA produk PCR diamati

di atas UV transluminator. Hasil positif ditunjukkan adanya pita

berwarna jingga pada gel agarose (Susanti et al. 2008b). Contoh

hasil elektroforesis produk RT-PCR dengan primer H5-1 dan H5-3

(WHO 2005a), CU-N1F dan CU-N1R (Payungporn et al. 2004),

dan pasangan primer NDVF dan NDVR (Creelan et al. 2002)

berturut-tururt terlihat pada Gambar 11-13. Jika ada sampel

positif H5 tetapi negatif N1, hal ini menunjukkan isolat virus yang

diisolasi subtipe H5 tetapi bukan subtipe N1 (kemungkinan

subtipe N2, N3, N4 dst). Demikian juga jika negatif H5 tetapi

positif N1, isolat yang diisolasi subtipe N1 tetapi bukan H5

(kemungkinan subtipe selain H5). Jika sampel positif H5 dan

positif N1, sampel ini positif subtipe H5N1.


M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Gambar 11. Elektroforegram RT-PCR gen H5 menggunakan

primer H5-1 dan H5-3 (produk 219bp). Sumur M: DNA ladder

100bp. Sumur P: Kontrol positif subtipe H5. Sumur 4, 8-11:

Sampel positif subtipe H5. Sumur 1-3, 5-7: Sampel negatif

subtipe H5

M P 1 2 3 4

Gambar 12. Elektroforegram RT-PCR gen N1 menggunakan

primer CU-N1F dan CU-N1R (produk 131bp). Sumur M: DNA

ladder 100bp. Sumur P: Kontrol positif subtipe N1. Sumur 2, 4:

Sampel positif subtipe N1. Sumur 1, 3: Sampel negatif subtipe N1

219bp

131bp

bp

2000

1650

1000

850


M P 1 2 3 4 5

Gambar 13. Elektroforegram RT-PCR menggunakan primer

NDVF dan NDVR (produk 202bp). Sumur M: DNA ladder 100bp.

Sumur P: Kontrol positif virus ND. Sumur 3-5: Sampel positif virus

ND. Sumur 1, 2: Sampel negatif virus ND

202bp

bp

2000

1650

1000

850


BAB V

TEKNIK ANALISA MOLEKULER NUKLEOTIDA PENYUSUN

GEN-GEN VIRUS AVIAN INFLUENZA

Untuk menganalisis gen-gen virus AI, langkah pertama

yang dilakukan adalah mengamplifikasi gen yang dimaksud dan

disekuensing. Pada analisis gen, biasanya panjang nukleotida

yang dianalisis cukup panjang (partial) atau bahkan komplit

(lengkap) menggunakan primer full leng atau primer lain yang

didesain sendiri. Contoh primer untuk mengamplifikasi gen H5

yang didisain khusus adalah 2 pasang primer yaitu primer HA01-

HA645 yang mengamplifikasi nukleotida 1-645, dan primer

HA548-HA1215 yang mengamplifikasi nukleotida 548-1215

(Tabel 4; Susanti et al. 2008a). Tingginya tingkat mutasi pada gen

HA, tidak semua isolat virus dapat diamplifikasi menggunakan

primer tertentu. Jika dengan primer yang didesain sendiri tidak

dapat teramplifikasi, sebagai alternatif dapat juga dicoba

menggunakan primer lain yang telah dipublikasi di jurnal-jurnal

ilmiah. Primer untuk amplifikasi secara lengkap masing-masing

genom telah banyak dipublikasikan di jurnal-jurnal ilmiah, salah

satunya adalah Hoffmann et al. (2001).

Tabel 4. Sekuen nukleotida primer untuk mengamplifikasi gen HA

Primer Sekuen basa Fragmen gen

Produk (bp)

1a HA01: 5‟

ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGC‟3

HA645: 5‟

H5

(basa 1-645)

645


GGAAATATAGGTGGTTGGGTTTTG‟3

2a HA548F:

5‟CCAACCRAGARGATCTTTTGG‟3*

HA1215R: 5‟AYRGCCTCAAACTGAGTGTTC‟3*

H5

(bada 548-1215)

667

* Y=(CT), R=(AG) adidisain oleh Dr. Drh. IGN Mahardika & Dr.

Drh. R. Susanti, MP

Contoh Metode Amplifikasi Gen HA Dengan Primer Spesifik

RNA isolat VAI subtipe H5N1 diekstraksi dengan Trizol®LS

Reagent sesuai manual. RT-PCR dilakukan dengan

menggunakan SuperscriptTM III One-step RT-PCR system.

Reaksi PCR dibuat sebanyak 50 l dengan komposisi 25 l 2x

reaction mix, 2 l primer forward (10 M), 2 l primer reverse (10

M), 2 l Superscript III RT/Platinum Taq Mix, 3 l sampel RNA

dan ultrapure H2O sampai volume 50 l. Program PCR untuk

primer HA01-HA645 adalah 45 oC reaksi RT 60 menit,

predenaturasi 95 oC 5 menit, 35 siklus terdiri dari denaturasi 95

oC 30 detik, anneling 55oC 30 detik, ekstensi 72oC 40 detik, dan

post ekstensi 72oC 10 menit. Program PCR untuk primer HA548-

HA1215 menggunakan suhu anneling 51oC (Susanti et al. 2008a).

Isolat yang tidak dapat diamplifikasi dengan primer HA01-HA645,

dilakukan amplifikasi menggunakan primer H5-155F

(5‟ACACATGCYCAR GACATACT‟3) dan H5-699R

(5‟CTYTGRTTYAGTGTTGATGT‟3) (Lee et al. 2001) dengan

anneling 50oC (Susanti et al. 2008a). Adanya pita DNA spesifik

hasil PCR diidentifikasi dengan elektroforesis pada gel agarose

2%.


Purifikasi produk PCR

Pita-pita DNA spesifik produk PCR pada gel elektroforesis

selanjutnya dipurifikasi, sebelum disekuensing. Purifikasi pita

DNA pada gel dapat dilakukan dengan kit, antara lain Wizard® SV

Gel and PCR Clean-Up System sesuai manual dari produsen.

Pita DNA target pada gel elektroforesis dipotong dan dimasukkan

pada tabung 15 ml, kemudian ditambah membrane binding

solution sebanyak 10µl/10mg gel. Setelah divortek, diinkubasi

pada suhu 50-65 oC sampai gel terlarut sempurna. Larutan gel

dimasukkan pada SV minicolumn (pada tabung koleksi),

diinkubasi pada suhu kamar selama 1 menit, dan disentrifuse

pada 16000 g selama 1 menit. Tabung koleksi dan larutan isinya

dibuang, SV minicolumn dipindahkan pada tabung koleksi baru.

Pada SV minicolumn dimasukkan 700 ul membrane wash

solution, kemudian disentrifus 16000 g selama 1 menit. Larutan di

dalam tabung koleksi dibuang, SV minicolumn kembali

dimasukkan pada tabung koleksi. Pada SV minocolumn

dimasukkan 500 µl membrane wash solution, kemudian

disentrifus pada 16000 g selama 1 menit. Larutan di dalam

tabung koleksi dibuang, SV minicolumn kembali dimasukkan

pada tabung koleksi, kemudian disentrifus pada 16000 g selama

1 menit. SV minicolumn dipindahkan ke tabung 1,5 ml yang

bersih, kemudian dimasukkan 50 µl nuclease free water. Setelah

diinkubasi pada suhu kamar selama 1 menit, SV minocolumn

disentrifus 16000 g selama 1 menit. DNA hasil purifikasi yang

terdapat pada tabung 1,5 ml selanjutnya disimpan pada suhu -20

oC sampai dilakukan sekuensing (Susanti et al. 2008a).


Sekuensing

Sekuensing dilakukan dengan metode dideoksi

menggunakan ABI automatic sequencer sesuai prosedur

standart. Runutan nukleotida gen hasil sekuensing dan turunan

asam aminonya dianalisis dengan software tertentu seperti

MEGA 3.1 (Kumar et al. 2004). Sekuen nukleotida yang diperoleh

dengan metode yang standart dan telah diyakini kebenarannya,

didaftarkan di GenBank sebagai salah satu bentuk etika moral

peneliti terhadap peningkatan khasanah keilmuan secara

universal.

Metode analisis nukleotida dengan program MEGA 3.1

Data sekuen nukleotida yang akan dianalisa dapat

bersumber dari hasil sekuensing atau data dari GenBank. Jika

data berasal dari GenBank, sekuen nukleotida dari Genbank

harus dipindahkan dulu dalam file Notepad. Sekuen nukleotida

dari Genbank dikopi, kemudian program Notepad dibuka, dan di-

klik edit, pilih paste. Semua nomor dan spasi harus dihilangkan

sebelum dimasukkan pada program MEGA (Molecular

Evolutionary Genetics Analysis). Caranya adalah dengan meng-

klik edit, kemudian dipilih replace. Selanjutnya isikan pada “find

what” dengan nomor atau spasi yang akan dihapus, kemudian

klik replace all. Jika nomor yang dihapus banyak, penghapusan

dilakukan satu per satu, sampai semua nomor dan spasi tidak

ada lagi (yang ada hanya urutan nukleotida). Setelah selesai,

kemudian disimpan dengan diberi nama.


Langkah pertama dalam menggunakan program MEGA

3.1 adalah membuka program dengan cara meng-klik Mega 3.1

dua kali (Gambar 14a). Selanjutnya, di-klik alignment dan

muncul beberapa pilihan (Gambar 14b). Kemudian dipilih

(klik)alignment exploler/ CLUSTAL dan muncul alignment

editor (Gambar 14c). Pada alignment editor muncul beberapa

pilihan, dan dipilih create a new alignment kemudian di-klik

(Gambar 14c). Akan muncul pertanyaan konfirmasi “Are you

building a DNA (yes) sequence alignment (otherwise choose

(No) for protein)?” (Gambar 14d), dan dijawab/di-klik yes.

Setelah diklik “yes” akan muncul menu-menu dari alignment

explorer (Gambar 14e).

Untuk memasukkan data dari GenBank yang telah

disimpan dalam file notepad, di- klik edit, kemudian dipilih insert

sequence from file (Gambar 14f). Selanjutnya dicari file notepad

yang akan dianalisis,dan klik open. Nama file dan sekuen

nukleotida akan muncul di program (Gambar 14g). Semua

sekuen nukleotidyang akan dianalisa, dimasukkan semua ke

dalam program alignment, dengan cara yang sama.

14a

aa

14b 14b


Gambar 14. Tampilan program MEGA pada persiapan

alignment

Untuk menganalisa data sekuen nukleotida hasil

sekuensing, langkah pertama sampai muncul alignment

explorer caranya sama dengan penjelasan sebelumnya. Setelah

program alignment explorer terbuka, pilih/klik sequencer,

kemudian klik edit sequencer file (Gambar 14h). Selanjutnya file

14c 14d

14e 14f

14g

14h

14d

14f

14h


elektrogram hasil sekuensing dibuka, kemudian di-klik data, klik

add to aligment exploler, dan klik ok.

Jika sekuensing dilakukan 2 arah (2 reaksi dengan 2

primer), hasil sekuen dengan primer F (forward) dan R (reverse)

harus disepadankan terlebih dahulu. Sekuen nukleotida hasil

sekuensing dengan primer F dan R, masing-masing dimasukkan

dalam program alignment explorer. Sebelum disepadankan,

sekuen nukleotida dengan primer R harus dibalik terlebih dahulu.

Sekuen yang akan dibalik, di-klik kanan kemudian pilih/klik

reverse complement. Selanjutnya, blok kedua sekuen (atau

tekan Ctrl A), kemudian klik alignment, pilih/klik alignment by

ClustalW, pilih/klik Ok. Jika ada pasangan basa yang tidak sama,

perlu dicermati lagi. Caranya adalah sekuen di sebelah kanan/kiri

dari basa yang meragukan/tidak jelas diblok, kemudian klik

kanan, dipilih copy, kemudian nama file (di sebelah kiri) diklik

kanan, pilih/klik open sequence file, pilih/klik search, pilih find,

klik kanan kotak kosong di bawah sekuen yang disepadankan,

klik paste, klik Ok.

Penyepadanan sekuen nukleotida dilakukan setelah

semua sekuen dimasukkan dalam program alignment explorer

seperti dijelaskan di atas (Gambar 15a). Untuk penyepadanan,

semua sekuen nukleotida diblok, kemudian klik alignment, pilih

alignment by ClustalW (Gambar 15b). Selanjutnya muncul

tampilan seperti Gambar 15c, kemudian klik ok dan terjadi proses

alignment (Gambar 15d).


Gambar 15. Tampilan prosedur alignment

15a 15b

15c 15d

15b

15d


Untuk menyimpan data alignment, klik data, pilih exit

alnExplorer (Gambar 16a) kemudian muncul pertanyaan “save

the current alignment session to file? (Gambar 16b), di-klik yes

dan diberi nama sesuai keinginan kemudian klik save (file mas)

(Gambar 16c). Selanjutnya akan muncul pertanyaan “save the

data to MEGA file? (Gambar 16d) Klik yes kemudian disimpan

dalam file MEGA (Gambar 16e). Selanjutnya muncul form input

data (Gambar 16f), dan setelah diisi klik Ok. Selanjutnya akan

muncul pertanyaan konfirmasi “protein coding nucleotide

sequence data?” (Gambar 16g) dan dijawab ok. Selanjutnya

akan muncul pertanyaan konfirmasi “open the data in MEGA?”

(Gambar 16h). Setelah dijawab ok, akan muncul tampilan data

seperti Gambar 17a.

Untuk mengambil data alignment ke file word, klik data

dan pilih write data to file (Gambar 17b). Selanjutnya muncul

exporting sequence data yang harus diisi (Gambar 17c). Pada

kolom site per line diisi sesuai keinginan (biasanya 60; artinya 1

baris berisi 60 nukleotida). Pada kolom missing data and

alignment gabs, dipilih include sites with missing/ambiguous

data and gabs. Pada kolom writing site numbers, dipilih sesuai

keinginan, yaitu at the end of line atau for each site. Setelah

terisi semua, kemudian tekan ok, dan akan muncul tampilan

seperti pada Gambar 17d. Selanjutnya semua data yang akan

dikopi diblok, kemudian pilih/klik copy. File word dibuka,

kemudian klik paste. Data di file word, font nya diganti courier

new, karena ukuran setiap jenis huruf pada tipe courier new

adalah sama.


Data alignment dalam bentuk Mega, selanjutnya dapat

dianalisis jarak genetik (distance matrix) dan dibuat pohon

filogenetiknya. Untuk membuat pohon filogenetik, file mega

dibuka kemudian klik phylogeny, pilih construct phylogeny,

pilih menu Neighbor-Joining (NJ) (Gambar 18a), sehingga

muncul analysis preference (Gambar 18b) kemudian klik

compute dan muncul pohon filogeni (Gambar 18c). Untuk

menyimpan pohon filogeni tersebut ke file word, klik images dan

pilih copy to clipboard. Selanjutnya file word dibuka, kemudian

klik paste.

Untuk melihat distance matrix, pilih menu distances pada

file mega, kemudian klik compute pairwise dan akan muncul

analysis preference (Gambar 18d). Setelah diklik compute akan

muncul matrik jarak genetik (Gambar 18e). Untuk menyimpan

matrik jarak genetik, klik file dan pilih export/print distances.

Selanjutnya akan muncul option pilihan (Gambar 18f), dan

setelah diisi semua klik print/save matrix dan akan muncul

tampilan seperti Gambar 18g. Matrik distance dapat dikopi dan

dipindahkan ke file word. Jarak genetik 0.016 artinya adalah ada

perbedaan 1,6% antara 2 unit taksonomi (isolat virus)

berdasarkan karakter yang digunakan (dalam hal ini adalah

nukleotida) atau ada persamaan (homologi) 98,4% atau 0.984.

Untuk mengetahui overall distance dan standart error, klik

distance dan pilih compute overall mean, pilih

distance&std.Err kemudian klik compute dan akan muncul hasil

overal mean distance dan standart error.


Gambar 16. Proses menampilkan data alignment pada MEGA

16a

16c

16b

16d

16e 16f

16g 16h

16b

16d

16f

16h


Gambar 17. Proses penyimpanan data alignment ke word

17a 17b

17c 17d

18a 18b

18c 18d

17b

17d

18b

18d


Gambar 18. Pembuatan pohon filogeni dan jarak genetik

18g 18e

18f


BAB VI

DINAMIKA MOLEKULER VIRUS AVIAN INFLUENZA SUBTIPE

H5N1 DI INDONESIA

Sebagai patogen intraseluler, virus avian influenza (VAI)

mempunyai mekanisme untuk menghindari respon imun hospes

sehingga virus dapat bertahan hidup dan bereplikasi dalam tubuh

hospes. Peningkatan kemampuan virus untuk menghindari sistem

imun hospes, secara langsung berkorelasi dengan peningkatan

patogenesitas virus. VAI mempunyai berbagai mekanisme untuk

menghindar dari sistem imun bawaan dan respon imun perolehan

(adaptif) hospes (Coleman 2007). Implikasi dari berbagai

mekanisme penghindaran dari sistem kekebalan hospes tersebut,

adalah mutasi pada gen-gen yang terlibat pada mekanisme

tersebut. Hal inilah yang mengakibatkan terjadinya dinamika

molekuler VAI dari berbagai isolat, dari waktu ke waktu. Dari 8

genom VAI, hanya beberapa gen yang terlibat pada mekanisme

patogenesitas dan adaptasi lintas spesies.

Berdasarkan analisa data gen virus avian influenza

subtipe H5N1 di GenBank diketahui bahwa data yang paling

banyak teregristrasi di GenBank adalah gen HA (sebanyak 565

isolat), disusul berturut-turut gen NA (262 isolat), gen NS (173

isolat), gen PB1 (155 isolat), dan gen PB2 (137 isolat). Dari 5 gen

yang dianalisa, gen HA yang paling banyak memiliki variasi akibat

substitusi nonsinonim (Susanti 2012a).


Gen Hemaglutinin (HA)

Glikoprotein yang disandi gen HA, merupakan faktor

patogenesitas virus influenza. HA berperan sebagai pengikat

reseptor sel, fusi membran serta target utama netralisasi oleh

antibodi sel hospes (Cross et al. 2001; Hulse et al. 2004; Hoffman

et al. 2005; Gambaryan et al. 2006). Protein HA disintesis

sebagai polipeptida 76 kDa. Setelah translasi di retikulum

endoplasma, HA mengalami maturisasi di aparatus Golgi menjadi

homotrimer HA masing-masing 220 kDa. Setiap monomer

awalnya merupakan prekursor polipeptida tunggal (HA0)

kemudian dipotong menjadi 2 subunit yaitu HA1 dan HA2. Kedua

subunit ini dihubungkan oleh ikatan disulfida antara residu asam

amino 14 dari HA1 dengan residu asam amino 137 dari HA2.

Tanpa proteolisis HA menjadi HA1 dan HA2, proses fusi virus

dengan membran endosom tidak terjadi sehingga virus bersifat

noninfeksius (Steinhauer 1999).

Cleavage site (daerah pemotongan) adalah sekuen asam

amino sebagai daerah pemotongan prekursor HA (HA0) menjadi

HA1 dan HA2 secara enzimatis oleh protease sel hospes,

sehingga proses fusi dengan membran endosom pada saat

infeksi VAI ke dalam sel hospes dapat terjadi. Daerah

pemotongan menentukan patogenesitas VAI. Daerah

pemotongan HA0 tergantung pada keberadaan asam amino basa

arginin (R) atau lisin (K). Kebanyakan VAI non-virulen atau low

pathogenic mempunyai satu asam amino basa (monobasic) pada

daerah pemotongan, namun strain highly pathogenic mempunyai

lebih dari satu asam amino basa (polybasic) pada posisi tersebut


(Munch et al. 2001). Sekuen HA dengan daerah pemotongan

monobasic (contoh: HA1-PSIQVR-GL-HA2) dapat dipotong oleh

tryptase yang dihasilkan sel epitel traktus respirasi dan

pencernaan (Whittaker 2001; Chen et al. 2004). Secara in vitro,

daerah pemotongan HA monobasic juga dapat dipotong oleh

trypsin-like enzyme, seperti faktor pembeku darah “Xa”, mini

plasmin dan protease bakteri (Murakami et al. 2001). Protease

dari Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa juga

dilaporkan dapat memotong daerah pemotongan monobasic

(Zhirnov et al. 2002).

Sekuen HA dengan daerah pemotongan polybasic (contoh:

HA1-KKREKR-GL-HA2), memungkinkan proses proteolitik dapat

dilakukan oleh protease lain seperti furin dan proprotein

konvertase 6 (PC6) yang terdapat di aparatus Golgi semua sel

(Horimoto et al. 1994). Enzim proteolitik furin mengenal sekuen

asam amino motif B-X-B-R (B=asam amino basa, X=asam amino

nonbasa) (Walker et al. 1994).Virus AI dengan daerah

pemotongan polybasic mempunyai jaringan distribusi yang tidak

terbatas dan menyebabkan infeksi sistemik yang fatal (Whittaker

2001; Chen et al. 2004). Daerah pemotongan polybasic pada VAI

H5N1 bertanggung jawab terhadap infeksi sistemik sehingga

virus dapat diisolasi dari darah, cairan serebrospinal dan feses

(WHO et al. 2005).

Identifikasi gen penyandi sekuen asam amino cleavage

site VAI subtipe H5N1 isolat unggas air di Jawa Barat

menunjukkan bahwa semua virus H5N1 (21 isolat) mempunyai

asam amino polibasik dengan 2 pola sekuen yaitu QRERRRKKR


(20 isolat) dan QRESRRKKR (1 isolat). Hal ini menunjukkan

bahwa semua isolat tersebut termasuk strain patogenik tinggi

(highly pathogenic avian influenza /HPAI) (Susanti et al. 2008c).

Sekuen daerah pemotongan QRERRRKKR khas pada strain

patogenik VAI H5N1 penyebab kematian unggas di Indonesia dan

Vietnam (Smith et al. 2006; Stevens et al. 2006). Titik

pemotongan QRESRRKKR adalah khas pada VAI H5N1

penyebab kematian manusia di Indonesia tahun 2005-2007 (CDC

2007).

Analisis sekuen asam amino daerah pemotongan HA

semua VAI H5N1 penyebab kematian manusia dan unggas di

Indonesia berdasarkan data dari GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) menunjukkan bahwa semua VAI

H5N1 yang bersirkulasi di Indonesia memiliki karakter molekuler

HPAI dengan sekuen daerah pemotongan bervariasi (Tabel 5;

Susanti 2012a). Pola sekuen asam amino daerah pemotongan

QRERRRKKR adalah khas penyebab wabah kematian unggas di

Hong Kong tahun 1997 dan negara-negara Asia (2003-2007)

(Guan et al. 2004; Smith et al. 2006; Stevens et al. 2006). Isolat

VAI H5N1 penyebab wabah kematian unggas di Indonesia tahun

2003-2004 mempunyai pola asam amino daerah pemotongan

QRERRRKKR, kecuali isolat A/Chicken/Kulonprogo/BBVet-XIII

yang mengalami delesi satu asam amino lisin (K) sehingga

mempunyai pola daerah pemotongan QRERRK_R. Mulai tahun

2005, muncul isolat VAI H5N1 dengan sekuen daerah

pemotongan QRESRRKKR, QIERRRKKR, QRERRREKR,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/


QGERRRKKR, QRERRRK_R dan QRE_RRKKR (Tabel 5;

Susanti 2012a).

Tabel 5. Variasi sekuen asam amino daerah pemotongan virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Daerah Pemotongan

Tahun Isolasi

Spesies/Isolat

1 QRERRRKKR 2003-2010

Manusia, ayam, itik, puyuh, kalkun, babi

2 QRESRRKKR 2005-2010

Manusia, ayam, itik, entok, puyuh

3 QRERRRK_R 2004 A/Chicken/Kulonprogo/BBVet-XIII-1

A/Chicken/Kulonprogo/BBVet-XIII-2

4 QIERRRKKR 2005-2007

A/Duck/Pali/BVW1358/2005

A/Chicken/Badung/BBVD-302/2007

5 QRERRREKR 2005-2007

A/Duck/Bufeleng BPPVI/2005

A/Chicken/Denpasar/BBVD-182/2007

6 QRE_RRKKR 2005 A/Chicken/Wates83/2005

7

8

QGERRRKKR

QREGRRKKR

2005

2007

A/Duck/Badung Bali/05

A/Chicken/Inhu/BPPVRII/2007

Sejak Juli 2005 sampai 2007, muncul kasus kematian

manusia Indonesia akibat VAI H5N1 dengan sekuen daerah

pemotongan QRESRRKKR. Namun pada tahun 2006 juga

ditemukan VAI H5N1 dengan sekuen daerah pemotongan

QRERRRKKR pada isolat manusia. Substitusi daerah

pemotongan HA virus AI subtipe H5N1 (dari QRERRRKKR


menjadi QRESRRKKR) kemungkinan berhubungan dengan

adaptasi virus pada hospes mamalia terutama manusia. Hal ini

didukung data bahwa kasus kematian manusia akibat VAI H5N1

paling banyak dilaporkan di Jawa Barat (Depkes 2007).

Pada HA1 terdapat daerah antigenik, kantong pengikat

reseptor, residu pengikat reseptor dan posisi glikosilasi. Daerah

antigenik fungsinya berkaitan erat dengan pertahanan terhadap

respon imun hospes, sementara kantong pengikat reseptor

fungsinya berkaitan dengan daya adaptasi pada hospes dan

patogenesitas strain. Posisi glikosilasi turut menentukan afinitas

ikatan reseptor serta pengenalan daerah antigenik oleh antibodi

(Hulse et al. 2004; Gambaryan et al. 2006; Smith et al. 2006;

Stevens et al. 2006). Peptida fusi pada ujung N subunit HA2

berperan pada fusi membran saat infeksi virus ke dalam sel

hospes (Cross et al. 2001).

Meskipun tingkat mutasi HA paling tinggi dibanding protein

lain, namun pada bagian-bagian tertentu dari HA bersifat stabil

pada semua influenza A (Wagner et al. 2005). Pada ujung C

glikoprotein HA mempunyai 3 residu sistein pada posisi 551, 559,

562 yang bersifat sekuen stabil (Wagner et al. 2005). Bagian

transmembran HA terdiri dari 10-11 asam amino, dan 5

diantaranya bersifat stabil pada semua influenza A. Meskipun

sekuen ini tidak esensial untuk perakitan dan daya infeksi virus

(Jin et al. 1994), namun interaksi bagian transmembran HA

dengan protein internal sangat menentukan bentuk virion (Jin et

al. 1997). Asam amino pertama (D:aspartat) dan terakhir


(P:prolin) dari subunit HA1 juga bersifat stabil pada semua

influenza A (Stevens et al. 2006).

Daerah antigenik adalah asam amino sebagai target

pengenalan dan netralisasi oleh antibodi. Substitusi asam amino

pada daerah antigenik meningkatkan potensi terjadinya hanyutan

antigenik (antigenic drift), karena berkaitan dengan mekanisme

virus untuk menghindar dari respon imun hospes. Substitusi ini

disebabkan tekanan seleksi untuk menghindar dari respon

antibodi hospes, termasuk penghindaran pengenalan antibodi

yang terbentuk akibat vaksinasi (Plotkin & Dushoff 2003; Smith et

al. 2004; Campitelli et al. 2006).

Pada glikoprotein HA dikenal 5 epitop daerah antigenik

sebagai target netralisasi antibodi (Smith et al. 2004). Penentuan

5 epitop (A sampai E) daerah antigenik tersebut didasarkan pada

struktur HA virus influenza A subtipe H3N2 penyebab pandemi flu

di Hongkong 1968. Daerah antigenik tersebut tampaknya tidak

bersifat linier, melainkan konformasional. Masing-masing epitop

terbentuk pada struktur tersier molekul HA, sehingga asam-asam

amino yang saling berjauhan bersama-sama membentuk satu

epitop. Kelima epitop tersebut terdapat pada 25 residu asam

amino subunit HA1. Epitop A dibentuk oleh residu asam amino

135, 124, 133, 145, 144, 142, dan 131. Epitop B dibentuk oleh

asam amino 156, 197, 189, 190, 157, 196, 193 dan 158. Epitop C

dibentuk oleh asam amino 276, 278, 275 dan 299. Epitop D

dibentuk oleh asam amino 226, 121 dan 172. Epitop E dibentuk

oleh residu asam amino 262, 62 dan 83 (penomoran menurut H3)

(Plotkin & Dushoff 2003).


Asam amino daerah antigenik pada 5 isolat VAI unggas air

(IPB1-RS s/d IPB5-RS) sama dengan isolat Gs/GD/1/96. Isolat

VAI IPB6-RS mengalami substitusi nonsinonim pada 4 asam

amino daerah antigenik (N45D, S84N, H138Q dan R140S),

sementara 3 isolat VAI unggas air lainnya (IPB7-RS, IPB8-RS

dan IPB9-RS) mengalami substitusi nonsinonim pada 8 asam

amino daerah antigenik (N45D, S84N, A86T, N124D, H138L,

R140S, S141P dan K189R) (Susanti et al. 2008a). Hasil analisis

pada 17 posisi asam amino antigenik site, hanya 3 posisi yang

tidak mengalami substitusi (Tabel 6; Susanti 2012a). Demikian

juga analisis pada sekuen daerah antigenik, semunya (4 daerah)

mengalami substitusi (Tabel 7; Susanti 2012a). Substitusi asam

amino pada daerah antigenik merupakan salah satu pendorong

evolusi gen hemaglutinin (Shih et al. 2007).

Tabel 6. Variasi asam amino antigenik site virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Posisi Asam Amino

Variasi No Posisi Asam Amino

Variasi

1 45 D, N 10 138 L, Q, H

2 83 A, V 11 140 S, K, R, T,Q,D, N

3 84 N, S 12 141 S, P, A, H

4 86 A, T, I, N 13 155 S, N, R

5 121 S, Y, D, F 14 189 R, K, S, M

6 124 D, N, G 15 212 K

7 125 H 16 223 S

8 129 S, L 17 263 A, T

9 137 Y, S, L


Tabel 7. Variasi asam amino daerah antigenik virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Daerah Antigenik

Variasi

1 Antigenik 1 RINHFEKIQI, RINHFEKIQR, RINHFKKIQI, RIKHFEKIRI, RINRFEKIQI, RINHFEKTQI, RINHFEKLQI, RINHFEKIRI, STNHFEKIRI

2 Antigenik 2 SPSFFRNVVW, KSSFFRNVVW, RSSFFRNVVW, RSSFFRNVMW, TSSFFRNVVW, RASFFRNVVW, DPSFFRNVVW, TPSFFRNVVW, RPSFFRNVVW, SPSFFRNGVW, RSSFFRNGVW, WSSFFRNVVW, QSSFFRNVVW, SPSFFRNVIW, NPSFFRNVVW, SHSFFRNVVW, SSSFFRNVVW

3 Antigenik 3 LYQNPTTYIS, LYQNPTTHIS, LYQNPSTYIS, LYQNQITYIS, LYQNPITYIS, LYQNLTTYIS, LYQNSITYIS, LYQNPATYIS, LYQNPTTYIF

4 Antigenik 4 SKVN, SKVH, TKVH, PKVN

Substitusi asam amino 138 dan 140 juga berhubungan

dengan patogenesitas virus, karena asam amino ini juga terlibat

dalam ikatan dengan reseptor (Hulse et al. 2004). Substitusi

N124S, L138Q dan K189R pada genotipe Z kemungkinan

berhubungan dengan adaptasi virus pada mamalia (Guan et al.

2004). Daerah antigenik pada asam amino 189 (R atau K) pada

isolat unggas air dalam penelitian ini sama dengan isolat

Hongkong, Vietnam dan Singapura (Hoffman et al. 2005). Daerah

antigenik A-E pada asam amino 86, 138, 140 dan 141 isolat

unggas dan manusia di Indonesia dan Vietnam mengalami

seleksi positif (Smith et al. 2006). Analisis sekuen asam amino

subunit HA1 pada virus influenza A tahun 1968-2005 berhasil

mengidentifikasi 95 substitusi pada 63 asam amino, dan 57

substitusi diantaranya adalah asam amino daerah antigenik (Shih


et al. 2007). Dari 25 asam amino pada 5 epitop tersebut, 14

residu asam amino diantaranya (121, 124, 133, 135, 142, 145,

156, 158, 190, 193, 197, 226, 262, 275) menunjukkan seleksi

positif (Bush et al. 1999). Perubahan epitop terjadi terus menerus,

dan perubahan epitop pada jangka 2-5 tahun biasanya hanya

didominasi oleh satu epitop saja. Dengan demikian setiap 2-5

tahun terjadi pergeseran dominasi perubahan epitop (Plotkin et al.

2002).

Residu pengikat reseptor adalah asam amino yang

berikatan secara langsung dengan reseptor sel hospes. Residu

pengikat reseptor menentukan spesifisitas ikatan virus dengan

reseptor sel hospes. Bagian dari HA yang berikatan dengan

reseptor adalah asam amino nomor 222 dan 224 (penomoran

menurut H5). Glikoprotein HA virus influenza strain manusia yang

mempunyai asam amino leusin pada posisi 222 dan serin pada

224 hanya dapat berikatan dengan asam sialat α-2,6NeuAcGal.

Sementara HA virus influenza strain unggas yang mempunyai

asam amino glutamin pada posisi 222 dan glisin pada 224 hanya

dapat berikatan dengan asam sialat α-2,3NeuAcGal (Vines et al.

1998; Zhou et al. 1999; Suzuki et al. 2000; Leung 2007). Residu

pengikat reseptor seperti itu dianggap spesifik berikatan dengan

reseptor avian α-2,3NeuAcGal (Gambaryan et al. 2006; Smith et

al. 2006; Leung 2007). Namun, teori yang menyatakan bahwa

ayam hanya mempunyai reseptor α-2,3NeuAcGal dan manusia

hanya mempunyai reseptor α-2,6NeuAcGal tampaknya tidak

berlaku lagi. Pada sel epitel tak bersilia dan sel goblet saluran

respirasi manusia predominan mempunyai asam sialat α-


2,6NeuAcGal (Ibrecevich et al. 2006; Thompson et al. 2006),

namun pada jaringan trakheobronkhial bersilia mengandung α-

2,6NeuAcGal dan α-2,3NeuAcGal meskipun dalam proporsi

terbatas (Thompson et al. 2006). Pada manusia, reseptor α-

2,3NeuAcGal juga dapat ditemukan pada pneumosit tipe II

(Ibrecevich et al. 2006). Pada saluran respirasi dan pencernaan

ayam dominan mempunyai reseptor α-2,3NeuAcGal, namun

reseptor α-2,6NeuAcGal juga dapat ditemukan pada paru-paru

(minor) maupun sel epitel kolon (mayor) (Kim et al. 2005). Seperti

juga ayam, sel epitel kolon burung puyuh juga banyak terdapat

reseptor α-2,6NeuAcGal. Hal ini menunjukkan bahwa ayam dan

puyuh berpotensi sebagai hospes intermediate untuk transmisi

VAI ke manusia (Guo et al. 2007).

Residu pengikat reseptor pada VAI H5N1 isolat unggas air

di Jawa Barat adalah glutamin (Q) dan glisin (G) berturut-turut

pada asam amino nomor 222 dan 224 (Susanti et al. 2008a).

Demikian juga residu pengikat reseptor pada semua VAI H5N1

isolat hewan dan manusia di Indonesia adalah glutamin (Q222)

dan glisin (G224) (Tabel 8; Susanti 2012a). Residu pengikat

reseptor seperti itu dianggap spesifik berikatan dengan reseptor

avian α-2,3NeuAcGal (Gambaryan et al. 2006; Smith et al. 2006;

Leung 2007).

Substitusi asam amino pada residu pengikat reseptor

menyebabkan perubahan spesifisitas ikatan reseptor. Substitusi

S224G dan L222Q (penomoran menurut H5) pada virus influenza

strain manusia menyebabkan virus ini dapat bereplikasi pada

intestinum itik (Vines et al. 1998). Bahkan disebutkan bahwa


hanya dengan mutasi 1 asam amino pada residu pengikat

reseptor menyebabkan perubahan spesifisitas ikatan dengan

reseptor (Glasser et al. 2005; Gambaryan et al. 2006). Substitusi

asam amino S223N virus HPAI H5N1 garis Asia, menurunkan

afinitas pada reseptor α-2,3NeuAcGal dan memberi kemampuan

virus berikatan pada α-2,6NeuAcGal secara moderat (Gambaryan

et al. 2006). Hal ini menunjukkan bahwa untuk transmisi lintas

spesies tidak selalu melalui reasorsi, tetapi dapat juga melalui

mutasi pada residu pengikat reseptor (Harvey et al. 2004).

Virus AI yang menginfeksi manusia dapat mengalami mutasi

pada residu pengikat reseptor, sehingga afinitas HA terhadap α-

2,3NeuAcGal menurun dan afinitas terhadap α-2,6NeuAcGal

meningkat (Harvey et al. 2004). Pergeseran spesifisitas reseptor

ini terjadi pada awal setelah transmisi virus pada hospes

(Matrosovich et al. 2000). Perubahan spesifisitas reseptor akibat

tekanan seleksi juga terjadi pada kultur virus secara in ovo. Virus

influenza strain manusia yang ditumbuhkan pada sel amnion

(mempunyai reseptor α-2,6NeuAcGal dan α-2,3NeuAcGal),

sampai pasase ke-2 masih mempertahankan spesifisitas reseptor

pada α-2,6NeuAcGal. Sementara jika dikultur pada sel alantois

yang hanya mempunyai reseptor α-2,3NeuAcGal menyebabkan

substitusi L222Q sehingga spesifisitas reseptor bergeser dari α-

2,6NeuAcGal menjadi α-2,3NeuAcGal (Ito et al. 1997). Hal ini

menunjukkan bahwa defisiensi suatu reseptor spesifik terhadap

residu pengikat reseptor virus influenza merupakan tekanan

seleksi yang memacu terjadinya substitusi sehingga kompatibel


dengan reseptor yang dimiliki sel hospes. Hal ini dilakukan virus

influenza sebagai prasyarat untuk efisiensi replikasi.

Kantong pengikat reseptor adalah residu asam amino

yang terlibat mempertahankan integritas struktur residu pengikat

reseptor serta mempengaruhi afinitas ikatan pada reseptor sel

hospes. Secara struktural, terdapat 3 elemen dasar kantong

pengikat reseptor VAI H5N1 yaitu α-helix (asam amino HA1 188-

190), loop-130 (asam amino HA1 134-138) dan loop-220 (asam

amino HA1 221-228) (Stevens et al. 2006). Residu asam amino

kantong pengikat reseptor yang bersifat stabil adalah Y94, W149,

H179. Sekuen stabil ini (Y94, W149 dan H179) (penomoran

menurut H5) terlibat kontak secara langsung dengan residu asam

sialat reseptor hospes (Stevens et al. 2006). Substitusi asam

amino kantong pengikat reseptor menyebabkan perubahan

pelipatan protein sehingga mempengaruhi afinitas ikatan virus

pada reseptor (Harvey et al. 2004; Gambaryan et al. 2006;

Auewarakul et al. 2007).

Virus influenza strain avian yang mengalami perubahan

afinitas pada reseptor sel hospes berpeluang memunculkan strain

virus yang mempunyai afinitas tinggi pada sel mamalia (Campitelli

et al. 2006). Substitusi asam amino 129 dan 134 pada subunit

HA1 dari VAI H5N1 isolat manusia menyebabkan pergeseran

spesifisitas ikatan reseptor dari α-2,3NeuAcGal menjadi α-

2,3NeuAcGal dan α-2,6NeuAcGal (Auewarakul et al. 2007).

Variasi asam amino kantong pengikat reseptor terjadi dapa

VAI isolat manusia dan hewan di Indonesia (Tabel 8; Susanti

2012a). Virus AI subtipe H5N1 isolat unggas air (IPB1-RS, IPB2-


RS, IPB3-RS, IPB4-RS dan IPB5-RS), mengalami 3 substitusi

nonsinonim pada asam amino kantong pengikat reseptor (L175M,

E212K dan P217S). VAI H5N1 isolat IPB6-RS mengalami 7

substitusi nonsinonim asam amino kantong pengikat reseptor

(D94N, T108I, D126E, H138Q, R140S, E212K dan P217S). Tiga

VAI H5N1 isolat unggas air (IPB7-RS, IPB8-RS, IPB9-RS)

mengalami substitusi nonsinonim pada 10 asam amino

pembentuk kantong pengikat reseptor (D94S, T108I, N124D,

D126E, H138L, R140S, D183N, K189R, E212K dan P217S)

(Susanti et al. 2008a). Patogenesitas VAI H5N1 pada hospes

sangat dipengaruhi oleh susunan asam amino kantong pengikat

reseptor. VAI H5N1 dengan asam amino D97, I108, E126, L138,

K212 dan S217 menunjukkan fenotipe highly pathogenic,

sementara asam amino T108, D126, H/Q138 menunjukkan

fenotipe patogenik moderat (Hulse et al. 2004). Tiga VAI H5N1

isolat unggas air (IPB7-RS, IPB8-RS dan IPB9-RS) kemungkinan

mempunyai fenotipe patogenik tinggi, karena mempunyai asam

amino kantong pengikat reseptor khas D97, I108, E126, L138,

K212 dan S217. Sementara 5 VAI H5N1 isolat unggas air lainnya

(IPB1-RS s/d IPB5-RS) mempunyai asam amino khas (T108,

D126, H138) penanda fenotipe patogenik moderat. Fenotipe

patogenesitas VAI H5N1 isolat unggas air dalam penelitian ini

perlu dikaji lebih lanjut dengan uji biologis (Susanti et al. 2008a).


Tabel 8. Variasi asam amino kantong pengikat reseptor virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

Virus AI subtipe H5N1 garis Asia menunjukkan jumlah asam

amino yang mengalami seleksi positif meningkat dari tahun ke

tahun, terutama pada daerah antigenik, posisi glikosilasi dan

kantong pengikat reseptor. Hal ini kemungkinan berhubungan

dengan peningkatan patogenesitas dan kemampuan virus untuk

transmisi ke manusia (Campitelli et al. 2006). Mekanisme virus

untuk menghindar dari sistem imun hospes merupakan tekanan

untuk mutasi secara gradual sehingga muncul strain-strain virus

baru yang secara imunologik berbeda (hanyutan antigenik)

(Munch et al. 2001; Smith et al. 2004). Hanyutan antigenik

berjalan lambat namun progresif dan cenderung menimbulkan

No Nomor asam amino

Variasi No Nomor asam amino

Variasi

1 94 S, N, K, M, D 16 186 E

2 97 D, N 17 188 T, K

3 108 I, T 18 189 R, K, S, M

4 124 D, N, G 19 190 L

5 126 E, D 20 212 K

6 129 S, L 21 217 S, T

7 130 G 22 218 K

8 132 S 23 221 G

9 138 L, Q, H 24 222 Q

10 140 S, K, T, R, Q, D, N

25 223 S

11 149 W 26 224 G

12 151 I, T 27 263 A, T

13 175 L, M 28 Alpha helix TRL, TKL, KSL, TML

14 179 H 29 Loop 130 ACP, ACS, PKN, SCS

15 183 D, N, G 30 Loop 120 QGS


penyakit yang terbatas pada suatu kawasan tertentu (Tumpey et

al. 2002; Swayne & Suarez 2003).

Peptida fusi adalah peptida yang berperan pada fusi

membran virus influenza saat infeksi virus ke dalam sel hospes,

terdapat pada ujung N dari HA2. Peptida ini bersifat stabil pada

semua influenza A, terdiri dari 23 asam amino hidrofobik kaya

glisin (G). Sebelas asam amino pertama ujung N dari HA2

(GLFGAIAGFIE) lebih stabil dibandingkan 12 asam amino

berikutnya. Hidrofobisitas asam amino pada peptida fusi sangat

diperlukan untuk destabilisasi membran, sehingga fusi membran

virus influenza dapat dilakukan dengan mudah. Substitusi glisin

(G) menjadi asam amino serin (S), leusin (L) atau fenilalanin (F)

secara signifikan menurunkan fusi virus influenza. Namun

substitusi asam amino pada peptida fusi menjadi glisin juga

menurunkan kemampuan fusi. Hal ini menunjukkan bahwa

stabilitas glisin diperlukan bukan hanya karena hidrofobisitasnya

tetapi juga strukturnya (Cross et al. 2001).

Sekuen asam amino peptida fusi VAI H5N1 asal hewan

dan manusia di Indonesia ada 3 varian, yaitu

GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG (345 isolat),

GLFGAIAGFIEG GWQGMIDGWYG (4 isolat),

GLFGAIADFIEGGWQGMVDGWYG (1 isolat) (Tabel 9; Susanti

2012a). Sekuen peptida fusi VAI H5N1 isolat unggas air di Jawa

Barat sama dengan isolat VAI H5N1 penyebab wabah di Asia

(Susanti et al. 2008a), yaitu GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG.

Jika dibandingkan dengan peptida fusi virus influenza subtipe

H3N2 penyebab pandemi influenza di Hongkong tahun 1968


(GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG), peptida fusi ini hanya

mengalami substitusi 3 asam amino selama hampir 40 tahun

(Cross et al. 2001; Smith et al. 2006).

Tabel 9. Variasi sekuen asam amino peptida fusi virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Peptida fusi Isolat, tahun

1 GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG

Ayam, manusia, itik, kalkun, babi, angsa, entok, puyuh 2003-2010

2 GLFGAIADFIEGGWQGMVDGWYG

A/Chicken/west jawa 1074/2003

3 GLFGAIAGFIEGGWQGMIDGWYG

A/Chicken/salatiga/BBVet-I/2005 A/Chicken/Kulon Progo/BBVW-822-545/2007 A/Chicken/Kulon Progo/BBVW-922-511/2007 A/Chicken/Sleman/BBVW-493-214/2007

Sekuen GLFGAIADFIEGGWQGMVDGWYG (mutasi G8D

dari ujung N HA2) kemungkinan mengakibatkan penurunan

kemampuan fusi membran virus saat infeksi ke dalam sel hospes.

Hidrofobisitas asam amino pada peptida fusi sangat diperlukan

untuk destabilisasi membran, sehingga fusi membran virus

influenza dapat dilakukan dengan mudah. Substitusi glisin (G)

menjadi asam amino serin (S), leusin (L) atau fenilalanin (F)

secara signifikan menurunkan fusi virus influenza. Namun

substitusi asam amino pada peptida fusi menjadi glisin juga

menurunkan kemampuan fusi. Hal ini menunjukkan bahwa

stabilitas glisin diperlukan bukan hanya karena hidrofobisitasnya

tetapi juga strukturnya (Cross et al. 2001). Sekuen

GLFGAIAGFIEGGWQGMIDGWYG pada 4 isolat ayam di

Indonesia mempunyai mutasi V18I ujung HA2. Peptida fusi


bersifat stabil pada semua influenza A, terdiri dari 23 asam amino

hidrofobik kaya glisin (G). Sebelas asam amino pertama ujung N

dari HA2 (GLFGAIAGFIE) lebih stabil dibandingkan 12 asam

amino berikutnya (Cross et al. 2001).

Posisi glikosilasi adalah sekuen asam amino yang

berpotensi sebagai tempat penempelan oligosakarida.

Penempelan oligosakarida ini sangat penting dalam orientasi

pelipatan HA untuk berikatan dengan reseptor sel atau antibodi.

Substitusi asam amino pada posisi glikosilasi merupakan strategi

virus untuk mask (menutup) atau unmask (membuka) daerah

antigenik dari pengenalan antibodi sel hospes (Rajakumar et al.

1990; Hoffmann et al 2005; Campitelli et al. 2006; Stevens et al.

2006). Penambahan glikan pada posisi berdekatan dengan asam

amino residu pengikat reseptor dapat mengubah efisiensi ikatan

HA pada reseptor sel (Mishin et al. 2005). Posisi glikosilasi asam

amino terkait asparagin (N) dengan pola sekuen NXS dan NXT

yang berpotensi sebagai tempat penempelan oligosakarida

(Hoffman et al. 2005; Smith et al. 2006; Stevens et al. 2006).

Posisi glikosilasi biasanya tidak stabil karena berhubungan

dengan patogenesitas dan imunogenesitas. Posisi glikosilasi

pada asam amino 154-156 dan 193-195 berdekatan dengan

daerah antigenik dan residu pengikat reseptor, sehingga

mempengaruhi afinitas ikatan pada reseptor dan mekanisme virus

VAI menghindar respon imun hospes (Matrosovich et al. 1999;

WHO 2005b; Campitelli et al. 2006; Gambaryan et al. 2006; Smith

et al. 2006). Penambahan posisi glikosilasi pada asam amino 84-

86 merupakan mekanisme virus untuk menghindar pengenalan


daerah antigenik oleh antibodi (WHO 2005b; Smith et al. 2006).

Hal ini merupakan strategi virus VAI untuk menutup atau

membuka daerah antigenik dari sistem imun (Hoffmann et al

2005; Campitelli et al. 2006; Stevens et al. 2006).

Posisi glikosilasi dari VAI H5N1 isolat hewan dan manusia di

Indonesia menunjukkan bahwa 2 dari 7 posisi glikosilasi masih

konserv/stabil dengan pola NNS (posisi 10-12) dan NVT (posisi

23-25) pada semua isolat yang dianalisis (Tabel 10; Susanti

2012a). Posisi glikosilasi dari VAI H5N1 isolat unggas air di Jawa

Barat menunjukkan bahwa asam amino nomor 84-86 dan 154-

156 pada 5 isolat unggas air (IPB1-RS s/d IPB5-RS) tidak

berpotensi sebagai tempat penempelan oligosakarida. Asam

amino isolat unggas air IPB6-RS mengalami substitusi pada

A156T, sehingga terbentuk sekuen N-S-T pada asam amino 154-

156 yang berpotensi sebagai posisi glikosilasi. Akibat substitusi

pada A86T dan A156T pada 3 VAI isolat unggas air (IPB7-RS,

IPB8-RS, IPB9-RS) menginduksi munculnya posisi glikosilasi

pada asam amino 84-86 dan 154-156 (Susanti et al. 2008a).

Penambahan glikan pada asam amino residu pengikat reseptor

menurunkan efisiensi ikatan HA pada reseptor sel (Mishin et al.

2005). Substitusi S223N dapat meningkatkan sensitivitas uji HI

melalui perubahan spesifisitas reseptor dan/atau ikatan antigen-

antibodi (Hoffmann et al. 2005). Penambahan glikosilasi pada

protein NA juga terlibat dalam peningkatan virulensi VAI (Hulse et

al. 2004).

Isolat VAI tahun 2003-2006, asam amino posisi 84-86

kebanyakan memiliki sekuen NPA (tidak berpotensi sebagai


posisi glikosilasi). Namun mulai tahun 2005 dan seterusnya mulai

muncul mutasi-mutasi yang mengarah pada potensi glikosilasi

yaitu NPT (Susanti 2012a). Posisi glikosilasi pada asam amino

84-86 merupakan mekanisme VAI untuk menghindar pengenalan

daerah antigenik oleh antibodi (WHO 2005b; Smith et al. 2006).

Asam amino nomor 84-86 pada beberapa isolat mengalami

mutasi pada satu atau lebih asam amino (dari NPT menjadi SPA,

SPT, NPI, NPA, dan NPN) sehingga tidak berpotensi sebagai

tempat penempelan oligosakarida (Susanti 2012a).

Dari 15 isolat, hanya 2 isolat VAI tahun 2003

(A/chicken/Legok dan A/Ck/Indonesia 2A) yang asam amino

posisi 154-156 berpotensi sebagai glikosilasi yaitu NST. Mulai

tahun 2004, posisi 154-156 mengalami mutasi sehingga sebagian

besar isolat tahun 2004 dan seterusnya memiliki potensi

glikosilasi pada posisi tersebut (Tabel 10; Susanti 2012a).

Substitusi pada A156T pada VAI H5N1 garis Asia dihubungkan

dengan adaptasi virus pada hospes unggas darat dan

meningkatkan virulensi pada unggas darat ini (WHO 2005b;

Smith et al. 2006; Stevens et al. 2006). Asam amino nomor 154-

156 pada beberapa isolat mengalami mutasi pada satu atau lebih

asam amino (dari NST menjadi DSA, NNA, NSA, NSI dan DST)

sehingga tidak berpotensi sebagai tempat penempelan

oligosakarida. Namun ada beberapa isolat yang mengalami

mutasi asam amino pada posisi 154-156, tetap berpotensi

sebagai posisi glikosilasi (yaitu dari NST menjadi NNT, NSS dan

NRT) (Tabel 10; Susanti 2012a).


Asam amino nomor 193-195 pada beberapa isolat

mengalami mutasi pada satu atau lebih asam amino (dari NPT

menjadi NQI, NPE, NPI, NSI dan NPA) sehingga tidak berpotensi

sebagai tempat penempelan oligosakarida. Namun ada beberapa

isolat yang mengalami mutasi salah satu asam amino pada posisi

193-195, tetap berpotensi sebagai posisi glikosilasi (yaitu dari

NPT menjadi NPS dan NLT) (Tabel 10; Susanti 2012a). Posisi

glikosilasi pada asam amino posisi 154-156 dan 193-195

berdekatan dengan daerah antigenik dan residu pengikat

reseptor, sehingga mempengaruhi afinitas ikatan pada reseptor

dan mekanisme virus menghindar respon imun hospes

(Matrosovich et al. 1999; WHO 2005b; Campitelli et al. 2006;

Gambaryan et al. 2006; Smith et al. 2006).

Asam amino nomor 165-167 pada beberapa isolat

mengalami mutasi pada salah satu asam amino (dari NNT

menjadi SNT, KNT dan NNA) sehingga tidak berpotensi sebagai

tempat penempelan oligosakarida.Asam amino nomor 286-288

pada 1 isolat mengalami mutasi pada salah satu asam amino

(dari NSS menjadi SSS) sehingga tidak berpotensi sebagai

tempat penempelan oligosakarida (Tabel 10; Susanti 2012a).

Tabel 10. Variasi asam amino posisi glikosilasi HA virus AI

subtipe H5N1 di Indonesia

No Posisi glikosilasi

Variasi Isolat, Tahun

1 10-12 NNS Semua isolat tahun 2003-2010

2 23-25 NVT Semua isolat tahun 2003-2010

3 84-86 NPT Ayam, Manusia, itik puyuh, kalkun, babi tahun 2005-2010


NPA Ayam, manusia, unggas air tahun 2003-2010

SPA, SPT, NPI, NPN

Ayam dan unggas air 2005-2010

4 154-156 NST Ayam, Manusia, itik, puyuh, kalkun, babi tahun 2003-2010

NNT Ayam, Manusia, itik, puyuh, kalkun, babi tahun 2004-2010

NRT Manusia tahun 2006

NSS Ayam tahun 2005

DSA, NNA, NSA, NSI, DST

Ayam, itik, puyuh, kalkun, babi tahun 2003-2010

5 165-167 NNT Ayam, Manusia, itik, puyuh, kalkun, babi tahun 2003-2010

SNT, KNT,NNA

Ayam 2005-2010, unggas air 1 isolat

6 193-195 NPT Ayam, Manusia, itik, puyuh, kalkun, babi tahun 2003-2010

NPS Ayam tahun 2004

NLT Ayam tahun 2006

NQI, NPE, NPI, NSI,NPA

Ayam 2005-2010, Human tahun 2005

7 286-288 NSS Ayam, Manusia, itik, puyuh, kalkun, babi tahun 2003-2010

SSS Ayam bali 2007

Analisis filogenetik 1695 nukleotida gen HA dari 11 virus

AI subtipe H5N1 Asia dan 27 isolat VAI H5N1 Indonesia baik asal

hewan maupun manusia ditampilkan pada Gambar 19. Pohon


filogenetik pada Gambar 19 menunjukkan bahwa dari semua

virus yang dianalisa, secara umum membentuk dua klaster

(cluster) terpisah, yaitu klaster Indonesia-Asia (klaster 1) dan

klaster Asia (klaster 2). Pada klaster Indonesia-Asia terbentuk 2

subklaster, yaitu subklaster 1 dan 2. Isolat virus dari Indonesia

semuanya berada pada subklaster 1 (Indonesia), dan virus dari

Asia berada pada subklaster 2. Hal ini menunjukkan bahwa

semua VAI dari Indonesia berkerabat dekat dengan virus garis

Asia. Hasil ini sesuai dengan postulat bahwa semua VAI H5N1

Indonesia membentuk satu kelompok terpisah dengan kelompok

virus dari negara-negara lain (Smith et al. 2006).


A chicken Badung BBVD-175 2007

A chicken Kulon Progo BBVW-453-110

A duck Sleman BBVW-29-32185 2008

A chicken East Kalimantan UT498

A chicken East Java UT551 2010

A chicken Riau UT531 2010

A chicken Indonesia D10014 2010

A Indonesia 5 2005

A Indonesia 292H 2006

A Duck Indramayu BBPW109 2006

A chicken Inhu BPPVRII 2007

A Chicken Papua TA5 2006

A chicken Banten Pdgl-Kas 2004

A Chicken Madiun BBVW1420 2005

A duck Bangli BBVD-246 2007

A Quail Central Java SMRG 2006

A chicken Kupang-1-NTT BPPV6 2004

A Chicken Indonesia Wates83 2005

A chicken Simalanggang BPPVI 2005

A chicken Legok 2003

A chicken Indonesia R60 05

A swine Banten UT3062 2005

A chicken Indonesia 7 2003

A chicken Malang BBVet-IV 2004

A Duck Tabanan BPPV1 2005


A duck East Java UT1046 2004

A duck guangxi 1793 2004

A goose Fujian bb 2003

A chicken Jilin9 2004

A chicken Cambodia LC1AL 2007

A duck Cambodia 072D6 2011

A Vietnam UT3047III 2004

A Thailand1(KAN-1) 2004

HA duck Thailand TS01 2006

A chicken Vietnam200 2005

A muscovy duck Vietnam LBM66

A great crested-grebe Qinghai1 2009

0.005


Gambar 19. Pohon filogenetik 1695 basa gen HA virus AI H5N1

asal Indonesia baik dari hewan dan manusia, serta virus asal Asia

Gen NS1

Protein yang disandi gen NS1 merupakan faktor virulensi

VAI, berperan sebagai antagonis IFN α/β. NS1 menghambat

pengaktifan dsRNA-dependent protein kinase R (PKR) dari signal

IFN α/β sehingga produksi IFN α/β terhambat (Talon et al. 2000;

Fernandez-Sesma et al. 2006; Garcia-Sastre 2006; Hale et al.

2006; Coleman 2007). Hambatan sintesis IFN α/β oleh sel

terinfeksi VAI juga terjadi melalui penghambatan NS1 pada

pengaktifan 2‟-5‟ oligoadenilat sintetase (2‟-5‟-OAS) (Hale et al.

2006; Min & Krug 2006). Patogenesitas NS1 juga terjadi melalui

ikatan langsung NS1 dengan p85β, yaitu subunit regulator

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K), sehingga replikasi virus dalam

sel terinfeksi tidak terhambat (Hale et al. 2006).

Patogenesitas infeksi VAI H5N1 pada manusia berbeda

dengan influenza biasa (H1N1, H3N2), yaitu adanya hiperinduksi

sitokin proinflamasi sehingga menimbulkan hipersitokinemia,

yang secara populer disebut „badai sitokin‟ (Guan et al. 2004; Lee

et al. 2005). Sintesis berlebihan (overekspresi) protein HA, NP

atau M di dalam sel terinfeksi VAI akan memicu NF-кB signaling

pathway melalui pengaktifan IкB kinase (IKK) (Flory et al. 2000).

Kedua virus influenza A subtipe H5N1 dan H1N1 ini menginduksi

produksi sitokin melalui pengaktifan NF-кB atau degradasi IкB-α.

Namun, VAI subtipe H5N1 mengaktifkan mitogen activated

protein kinase (MAPK) secara dominan, termasuk p38 MAPK dan


extracellular signal regulated kinase 1 dan 2 (ERK1/2), sehingga

meningkatkan ekspresi TNFα oleh makrofag (Lee et al. 2005).

Mutasi NS1 menyebabkan penurunan kemampuan virus

menghambat produksi IFN α/β, sehingga NS1 berpotensi besar

sebagai target pembuatan antivirus dan vaksin (Solorzano et al.

2005; Fernandez-Sesma et al. 2006; Garcia-Sastre 2006).

Imunitas adaptif juga dihambat NS1 melalui induksi

transkripsi faktor-faktor yang terlibat dalam maturasi sel dendritik

serta migrasi dan stimulasi sel T. Hal ini menyebabkan maturasi

dan kapasitas sel dendritik untuk menstimulasi respon imun sel T

terhambat. Imunitas seluler melalui sel T merupakan mekanisme

pertahanan tubuh untuk penghilangan virus dari tubuh

(Fernandez-Sesma et al. 2006). Sel T sitotoksik (cytotoxic T

lymphocyte; CTL) berperan penting mengontrol infeksi virus

(Wherry & Ahmed 2004; Thomas et al. 2006). Untuk menghindari

respon CTL, VAI mengakumulasi substitusi asam amino pada

epitop atau dekat epitop CTL, seperti asam amino 380-388 dan

383-391 pada NP. Substitusi R384G pada NP menyebabkan

hilangnya epitop CTL sehingga virus terhindar dari respon CTL

(Berkoff et al. 2005).

Di dalam nukleus, NS1 menghambat ekspresi gen sel

hospes dengan menghambat ekspor mRNA seluler ke

sitoplasma. Mekanisme tersebut dilakukan NS1 melalui

penghambatan poliadenilasi mRNA seluler dan interaksi NS1

dengan kompleks protein ekspor nuklear sel hospes (Satterly et

al. 2007). Terhambatnya ekspor mRNA seluler dari nukleus


menyebabkan translasi hanya dilakukan pada mRNA lama yang

diekspor ke sitoplasma sebelum sel terinfeksi VAI.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen NS1 dari 168

virus AI subtipe H5N1 isolat manusia dan hewan di Indonesia

yang dianalisis, semuanya mengalami delesi 5 asam amino

nomor 80-84, kecuali isolat A/Chicken/Pessel/BPPVRII/2007

(Tabel 11; Susanti 2012a). Namun, asam amino nomor 92 (salah

satu marka patogenesitas) dari semua virus yang dianalisis

adalah D (aspartat), atau dengan kata lain tidak mengalami

mutasi D92E (Tabel 11; Susanti 2012a). Strain H5N1 yang

bersifat letal mempunyai mutasi D92E dan atau delesi 80-84

(berdasarkan sistem penomoran H3) atau pada posisi 88-92

(berdasar sistem penomoran H5) pada gen NS1 (Lipatov et

al.2005; Seo et al.2004; Viseshakul et al. 2004). Delesi 5 asam

amino pada gen NS1 menyebabkan resistensi sitokin namun

tidak berpengaruh terhadap virulensi virus (Seo et al. 2002;

Lipatov et al. 2005). Mutasi NS1 menyebabkan penurunan

kemampuan virus menghambat produksi IFN α/β, sehingga NS1

berpotensi besar sebagai target pembuatan antivirus dan vaksin

(Solorzano et al. 2005; Fernandez-Sesma et al. 2006; Garcia-

Sastre 2006). Peran antagonis interferon dari gen NS1 terletak

pada asam amino nomor 92 dan 149 (Li et al. 2006; Min & Krug

2006; Quinlivan et al. 2005). Hasil penelitian Triyana et al. (2010)

menunjukkan bahwa virus AI subtipe H5N1 asal unggas di

Purworejo dan Bantul tidak mengalami mutasi D92E, tetapi

mengalami delesi 5 asam amino nomor 80-84. Hal ini


menunjukkan bahwa 167 isolat virus AI tersebut bersifat resisten

terhadap sitokin.

Hasil analisis gen NS1 juga menunjukkan bahwa 168 isolat

virus yang dianalisis menunjukkan bahwa asam amino nomor 149

adalah Alanin (A) (Tabel 11; Susanti 2012a). Asam amino A149

merupakan salah satu penentu patogenesitas virus, yaitu bersifat

antagonis terhadap induksi interferon (Li et al. 2006). Seperti

disampaikan Jia et al. (2010), gen NS1 menghambat signal

interferon. NS1 juga berperan menginduksi apoptosis (dependent

caspase) pada sel epitel basal paru manusia (Zhang et al. 2010).

NS1 menghambat pengaktifan dsRNA-dependent protein kinase

R (PKR) dari signal IFN α/β sehingga produksi IFN α/β terhambat

(Talon et al. 2000; Fernandez-Sesma et al. 2006; Garcia-Sastre

2006; Hale et al. 2006; Coleman 2007). Hambatan sintesis IFN

α/β oleh sel terinfeksi VAI juga terjadi melalui penghambatan

NS1pada pengaktifan 2‟-5‟ oligoadenilat sintetase (2‟-5‟-OAS)

(Hale et al. 2006; Min & Krug 2006). Patogenesitas NS1 juga

terjadi melalui ikatan langsung NS1 dengan p85β, yaitu subunit

regulator fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K), sehingga replikasi virus

dalam sel terinfeksi tidak terhambat (Hale et al. 2006). Mutasi

NS1 menyebabkan penurunan kemampuan virus menghambat

produksi IFN α/β, sehingga NS1 berpotensi besar sebagai target

pembuatan antivirus dan vaksin (Solorzano et al. 2005;

Fernandez-Sesma et al. 2006; Garcia-Sastre 2006).


Tabel 11. Variasi asam amino yang disandi gen NS1 virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Isolat, Tahun Jumlah Isolat

Urutan asam amino ke-

92 149 80-84

1. Manusia 2005 8 D A Delesi



4. Ayam 2003 15 D A Delesi




8. Ayam 2007 9 D A Delesi (1)


10. Itik (5), Muscovy duck (4) 2004-2007

9 D A Delesi

11. Babi 2005-2007 12 D A Delesi

12. Puyuh (5), kalkun (1), 2004

6 D A Delesi

Analisis filogenetik 690 nukleotida gen NS dari 15 virus






klaster goose/Guangdong (klaster 2). Pada klaster Indonesia-Asia

terbentuk 2 subklaster, yaitu subklaster 1 dan 2. Subklaster 1

merupakan kelompok VAI Indonesia-Asia, sedangkan subklaster

adalah isolat ayam Pessel/BPPVRII/2007. Nampak bahwa VAI

isolat Indonesia tidak membentuk kelompok terpisah dengan

kelompok virus dari negara-negara Asia.


Gambar 20. Pohon filogenetik 690 basa gen NS virus AI H5N1

asal Indonesia baik dari hewan dan manusia, serta virus asal Asia

A Indonesia CDC887 2006

A Indonesia CDC1031T 2007

A chicken Banten Srg-Fadh 2008


A chicken Indonesia CDC24 2005


A chicken Inhu BPPVRII 2007

A chicken Gunung Kidal BBVW 2005

A chicken Magetan BBVW 2005

A Indonesia 5 2005


A chicken West Java 1074 2003


A chicken Salatiga BBVet-I 2005

NS A turkey Kedaton BPPV3 2004

A chicken Malang BBVet-IV 2004

A Dk Indonesia MS 2004

A chicken East Kalimantan UT1035 2004

A chicken East Java BL-IPA 2003

A chicken Kulon Progo BBVW 2005

A swine East Java UT6003 2006


A swine South Kalimantan UT6015 2006

A chicken Dairi BPPVI 2005

A chicken Tebing Tinggi BPPVI 2005


A chicken Wonosobo BPPV4 2003

A duck Hubei3 2005



A duck Thailand TS01 2006


A quail Malaysia 6309 2004


A chicken Vietnam NCVD10 2005



A goose fujian bb 2003



A Hong Kong97 98

A chicken Pessel BPPVRII 2007

A goose guangdong1 96

0.05


Gen PB1-F2 dan PB1

Sesuai dengan namanya, gen PB berfungsi utama

sebagai enzim polimerase sintesis mRNA. Selain itu, PB1 juga

berperan dalam perampasan tudung (cap snatching), perakitan

kompleks RdRp (RNA dependent RNA polimerase) dan

menghambar respon imun seluler. Ketika replikasi, inti sel

menyediakan lingkungan untuk sintesis mRNA virus influenza

melalui proses yang tidak biasa, yaitu inisiasinya memerlukan

primer yang mempunyai cap-m7GpppXm (Lamb & Krug 2001).

Fragmen tudung (7mGppp dan 10-13 nukleotida setelah tudung)

dari pre-mRNA sel hospes dipotong oleh enzim PB1 kemudian

dikenal dan diikat oleh enzim PB2. Proses perampasan tudung

dari pre-mRNA seluler tersebut disebut dengan cap snatching

(Rao et al. 2003; Crow et al. 2004; Hara et al. 2006).

Protein PB1-F2 adalah protein yang diekspresikan dari

bingkai pembacaan terbuka (open reading frame:ORF) alternatif

pada segmen gen polimerase PB1. Protein PB1-F2 terdiri dari 87

asam amino (Gibbs et al. 2003). ORF alternatif terletak pada basa

ke (+)120 setelah ORF gen PB1. Ekspresi ORF alternatif ini

melalui mekanisme ribosomal scanning, yaitu pembacaan

ribosom pada kodon inisiasi translasi (AUG). Jika ribosom

mengenali AUG pada ORF alternatif, polipeptida baru akan

terbentuk. PB1-F2 hanya bertahan dalam sel selama 5 jam

pascainfeksi (Coleman 2007). Protein ini terlokalisasi di membran

mitokondria dan secara dramatik menyebabkan degradasi

morfologi mitokondria, menurunkan potensial membran dan

menginduksi apoptosis (Garcia-Sastre 2006; Coleman 2007).


Protein ini merupakan faktor patogenesitas virus influenza

secara in vivo (Garcia-Sastre 2006; Coleman 2007). Protein PB1-

F2 mampu menginduksi apoptosis makrofag sehingga

menurunkan kemampuan sel hospes untuk menghilangkan virus

dan meningkatkan infeksi sekunder bakteri oportunistik (Coleman

2007). Menurut Pena et al.(2012), PB1-F2 terlibat dalam

mekanisme virulensi, replikasi virus dan respon imun innate.

Protein PB1-F2 merupakan target untuk lokalisasi virus pada

membran dalam mitokondria sel hospes sehingga mengganggu

fungsi mitokondria (Gibbs et al. 2003).

Virus AI yang dihilangkan ORF alternatif PB1-F2 tetap

hidup secara in vitro, namun secara in vivo menurunkan

kemampuan induksi apoptosis makrofag sampai 50%. Hal ini

menunjukkan bahwa protein PB1-F2 hanya meningkatkan

patogenesitas virus secara in vivo (Zamarin et al. 2006). Karena

PB1-F2 dapat menyebabkan apoptosis makrofag sebagai antigen

presenting cell (APC) profesional, kematian makrofag juga

mempengaruhi presentasi antigen pada cabang respon imun

adaptif (Coleman 2007).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa 148 isolat virus AI

subtipe H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia mempunyai

asam amino N66 pada gen PB1-F2 (Tabel 12; Susanti 2012a).

Disebutkan bahwa PB1-F2 berperan sebagai faktor patogenesitas

virus melalui pro-apoptosis mitokondrial. Asam amino N66 PB1-

F2 merupakan indikator letalitas tinggi pada virus AI tahun 1918

(Schnolke et al. 2011). Lebih lanjut disebutkan bahwa asam

amino N66 berimplikasi patogenesitas pada mamalia (Conello et


al. 2007; Schnolke et al. 2011). Virus AI yang dihilangkan

ORFalternatif PB1-F2 tetap hidup secara in vitro, namun secara

in vivo menurunkan kemampuan induksi apoptosis makrofag

sampai 50%. Hal ini menunjukkan bahwa protein PB1-F2 hanya

meningkatkan patogenesitas virus secara in vivo (Zamarin et al.

2006). Karena PB1-F2 dapat menyebabkan apoptosis makrofag

sebagai antigen presenting cell (APC) profesional, kematian

makrofag juga mempengaruhi presentasi antigen pada cabang

respon imun adaptif (Coleman 2007).

Sebanyak 148 isolat vrus AI subtipe H5N1 asal manusia

dan hewan di Indonesia yang dianalisis menunjukkan bahwa

asam amino F251 dan F254 dari PB1 (Tabel 12; Susanti 2012a)

merupakan sentral dari sekuen konserv untuk proses polimerase

(Jung et al. 2006). Sebagai gen yang berperan pada proses vital,

biasanya tidak banyak mengalami mutasi yang bermakna.

Menurut Xu et al. (2012), asam amino 473V dan 598P PB1 virus

AI asam unggas berkontribusi pada mekanisme polimerase

terutama pada sel mamalia. Semua virus AI di Indonesia yang

dianalisis mempunyai asam amino 473V dan 598L, hanya 1 isolat

yang mempunyai 598P. Hal ini kemungkinan merupakan faktor

penyebab mudahnya virus asal unggas bereplikasi pada mamalia

termasuk manusia.

Asam amino PB1 semua isolat virus di Indonesia yang

dianalisis adalah T677 (Tabel 12; Susanti 2012a). Mutasi dua

asam amino yaitu T677M dari PB1 dan I63T dari PB2

menurunkan patogenesitas virus. Mutasi T677M menurunkan

efisiensi replikasi virus tetapi meningkatkan aktivitas polimerase


(Li et al. 2011). Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa

asam amino PB2 semua isolat virus di Indonesia yang dianalisis

adalah I63, kecuali 5 isolat yang mengalami mutasi I63V (yaitu

A/Chicken/Bangli Bali BBPV6-1/2004; A/Chicken/Bangli Bali

BBPV6-2/2004; A/Chicken /Kupang2 NTT/BBPV6/2004;

A/Chicken/Kupang 3NTT/BBPV6/2004; A/Chicken/ Manggarai

NTT/BBPV6/2004) (Tabel 12; Susanti 2012a). Mutasi I63T protein

PB2 tidak mengubah kemampuan replikasi virus (Li et al. 2011).

Dari hasil analisis asam amino posisi 677 PB1, dapat disimpulkan

bahwa virus AI di Indonesia tidak mengalami mutasi T677M.

Mutasi I63V pada gen PB2 dari 5 isolat VAI di Indonesia perlu

dikaji lebih lanjut tentang fenotip virus secara biologis.

Tabel 12. Variasi asam amino yang disandi gen PB1 dan PB1-F2

virus AI subtipe H5N1 di Indonesia



66 PB1-F2

252 PB1

254 PB1

473 PB1

598 PB1

677 PB1

1. Manusia 2005 12 N F F V L T

2. Manusia 2006 42 N F F V L(1) T

3. Manusia 2007 11 N F F V L T

4. Ayam 2003 13 N F F V L (9 data)

T (9 data)

5. Ayam 2004 16 N F F V L (1 data)

T (1 data)

6. Ayam 2005 17 N F F V L T

7. Ayam 2006 9 N F F V L T

8. Ayam 2007 5 N F F V L T

9. Itik 2004-2005 4 N F F V L T

10. Babi 2005-2007 13 N F F V L T

11. Puyuh (5), kalkun (1), 2004

6 N F F V L T

(1) kecuali 1 isolat A/Indonesia/ CDC759/2006: asam amino P


Analisis filogenetik 2268 nukleotida gen PB1 dari 11

virus AI subtipe H5N1 Asia dan 27 isolat VAI H5N1 Indonesia

baik asal hewan maupun manusia ditampilkan pada Gambar 21.

Pohon filogenetik pada Gambar 21 menunjukkan bahwa dari

semua virus yang dianalisa, secara umum membentuk dua

klaster (cluster) terpisah, yaitu klaster Indonesia-Asia (klaster 1)

dan klaster Hongkong (klaster 2). Pada klaster 1 (Indonesia-Asia)



2 adalah isolat ayam Jilin9/2004. Nampak bahwa VAI isolat

Indonesia tidak membentuk kelompok terpisah dengan kelompok

virus dari negara-negara Asia.


Gambar 21. Pohon filogenetik 2268 basa gen PB1 virus AI H5N1

asal Indonesia baik dari hewan dan manusia, serta virus asal Asia.


A duck Parepare BBVM 2005

A chicken Bali UT2091 2005

A chicken Gunung Kidul BBVW 2005


A chicken Banten UT6025 2006

A chicken Jakarta DKI-Nurs 2007

A Indonesia 5 2005



A chicken Purworejo BBVW 2005


A chicken Central Java UT3091 2005

PB1 A Indonesia CDC326T 2006




A chicken West Java UT1001 2003





A chicken Simalanggang BPPVI 2005

A chicken Deli Serdang BPPVI 2005

A chicken Tarutung BPPVI 2005










A duck Hubei3 2005


A Hong Kong97 98

0.01


Gen PB2

Protein yang disandi oleh gen PB2, berperan sebagai

pengenalan cap-m7GpppXm pada RNA sel (Lamb & Krug

2001).Domain pengikat cap telah diidentifikasi pada posisi 242-

252 dan 533-564 (Honda et al. 1999; Li et al. 2001). Perubahan

adaptif protein PB2 diperlukan untuk mengatasi barier spesies

dan letalitas strain (Solomon et al. 2006). Asam amino nomor 627

disebutkan sangat menetukan letalitas suatu virus. Pada posisi

tersebut, virus yang teradaptasi dengan baik pada mamalia

mempunyai residu lisin (K), sedangkan virus avian mempunyai

asam amino glutamate (E) (Hatta et al. 2001; Shinya et al. 2004;

Solomon et al. 2006).

Hasil analisis 158 isolat VAI di Indonesia menunjukkan

bahwa hanya 5 isolat virus AI asal manusia

(A/Indonesia/CDC759/2006; A/Indonesia/CDC390/2006;

A/Indonesia/ CDC370E/2006; A/Indonesia/321H/2006; dan

A/Indonesia/CDC1031/2007) yang asam amino pada posisi 627

adalah K (Tabel 13; Susanti 2012a). Hal ini menunjukkan bahwa

bukan hanya mutasi E627K dari PB2 yang berkontribusi pada

mekanisme adaptasi virus dari unggas ke manusia. Hasil

penelitian juga menunjukkan bahwa virus yang diisolasi dari

kasus kematian manusia akibat H5N1 sangat sedikit yang

menunjukkan mutasi E627K (de Jong et al. 2006; Guan et al.

2004; Li et al. 2004; Shinya et al.2005; Steel et al. 2009).


Tabel 13. Variasi asam amino yang disandi gen PB2 virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Isolat, Tahun Jumlah

Isolat Urutan asam amino ke-

63 242-252 363 404 627

1. Manusia 2005 12 I QMPYTPGGEVR F F E

2. Manusia 2006 55 I QMPYTPGGEVR F F E (1)

3. Manusia 2007 11 I QMPYTPGGEVR F F E(2)

4. Ayam 2003 12 I QMPYTPGGEVR F F E

5. Ayam 2004 16 I (3)

QMPYTPGGEVR F F E

6. Ayam 2005 19 I QMPYTPGGEVR F F E

7. Ayam 2006 9 I QMPYTPGGEVR (4)

F F E

8. Ayam 2007 4 I QMPYTPGGEVR (5)

F F E

9. Itik 2004-2005 4 I QMPYTPGGEVR F F E

10. Babi 2005-2007 11 I QMPYTPGGEVR F F E

11. Puyuh (3), kalkun (1), feline(1) 2004-2006

5 I QMPYTPGGEVR F F E

(1) 4 isolat asam amino K: A/Indonesia/CDC759/2006; A/Indonesia/CDC390/2006; A/Indonesia/CDC370E/2006; A/Indonesia/321H/2006

(2) 1 isolat asam amino K: A/Indonesia/CDC1031/2007 (3) 5 isolat asam amino V: A/Chicken/Bangli Bali BBPV6-

1/2004; A/Chicken/Bangli Bali BBPV6-2/2004; A/Chicken/Kupang 2 NTT/BBPV6/2004; A/Chicken/Kupang 3 NTT/BBPV6/2004; A/Chicken/Manggarai- NTT/BBPV6/2004

(4) 1 isolat asam amino QMPYTPGGDVK : A/Chicken/South Kalimantan/UT6029/2006

(5) 1 isolat asam amino QMPYTPGGEVR : A/Chicken/Indonesia/3/2007)

Dua asam amino yaitu F363 dan F404 dilaporkan

membentuk „sandwich aromatic‟ yang terlibat dalam „cap binding‟

(Fechter et al. 2003). Hasil penelitian menunjukkan bahwa asam


amino pada PB2 VAI di Indonesia adalah F363 dan F404. Hal ini

menunjukkan bahwa protein untuk proses vital virus tidak banyak

mengalami mutasi bahkan bersifat konserv/stabil. Hasil-hasil

penelitian lain tentang PB2 belum banyak diungkap. Hasil analisis

virus di Indonesia menunjukkan bahwa sekuen asam amino 242-

252 dari PB2 adalah QMPYTPGGEVR, dan hanya 2 isolat yang

mengalami mutasi yaitu QMPYTPGGDVK

(A/Chicken/SouthKalimantan/UT6029/2006) dan

QMPYTPGGEVK (A/Chicken/Indonesia/3/2007) (Tabel 13;

Susanti 2012a). Peran mutasi pada fenotip virus perlu dikaji lebih

lanjut.

Analisis filogenetik 2200 nukleotida gen PB2 dari 11

virus AI subtipe H5N1 Asia dan 22 isolat VAI H5N1 Indonesia

baik asal hewan maupun manusia ditampilkan pada Gambar 22.

Pohon filogenetik pada Gambar 22 menunjukkan bahwa dari

semua virus yang dianalisa, secara umum membentuk dua

klaster (cluster) terpisah, yaitu klaster Indonesia-Asia (klaster 1)

dan klaster Hongkong (klaster 2). Pada klaster Indonesia-Asia



2 adalah isolat itik Guangxi1793/2004. Nampak bahwa VAI isolat

Indonesia tidak membentuk kelompok terpisah dengan kelompok

virus dari negara-negara Asia.


Gambar 22. Pohon filogenetik 2200 basa gen PB2 virus AI H5N1



A chicken Mangarai-NTT BPPV6 2004


A chicken West Java UT1001 2003







A feline Indonesia CDC1 2006

A Indonesia CDC370E 2006

A Indonesia 5 2005


A chicken Banten UT6025 2006

A chicken Indonesia CDC24 2005


A chicken Wajo BBVM 2005

A duck Parepare BBVM 2005



A swine East Java UT6003 2006











A Hong Kong97 98

0.02


Gen Neuraminidase (NA)

Pada protein NA, semua virus H5N1 Indonesia asal

manusia dan hewan tahun 2003-2010, mempunyai delesi 20

asam amino pada regio stalk yaitu pada posisi 48-67 (Tabel 14;

Susanti 2012b). Tempat glikosilasi pada regio stalk dari protein

neuraminidase berperan dalam menjaga struktur tetramer dari

protein (Luo et al. 1993). Virus AI H5N1 asal unggas dan manusia

di Hongkong tahun 1997-1998 semuanya mengalami delesi 19

asam amino regio stalk NA (Bender et al. 1999). Hasil penelitian

Nga et al. (2011) menunjukkan bahwa virus AI subtipe H5N1

yang diisolasi tahun 2004-2009 di Vietnam mengalami delesi 20

asam amino, sama seperti strain virus tahun 2003. Namun isolat

yang beredar sebelum tahun 2003 tidak mengalami delesi 20

asam amino, sehingga mempunyai 1410 nukleotida (469 asam

amino). Delesi 20 asam amino pada regio stalk juga terjadi pada

isolat H5N1 berbagai spesies unggas di Thailand tahun 2003-

2004. Hal ini sangat berbeda dengan strain virus H5N1 penyebab

outbreak di Asia Timur tahun 1996-1997 dan 2000-2001

(Keawcharoen et al. 2005). Mutasi drift pada NA ini kemungkinan

merupakan bagian dari proses evolusi virus sehingga memiliki

varian yang penting pada mekanisme patogenesitas virus (Nga et

al. 2011).

Posisi glikosilasi asam amino terkait asparagin (N)

dengan pola sekuen NXS dan NXT yang berpotensi sebagai

tempat penempelan oligosakarida (Hoffman et al. 2005; Smith et

al. 2006; Stevens et al. 2006). Penambahan glikosilasi pada

protein NA juga terlibat dalam peningkatan virulensi VAI (Hulse et


al. 2004). Semua virus pada penelitian ini tidak mempunyai

tempat glikosilasi pada stalk protein neuraminidase karena

mengalami delesi di daerah ini. Delesi pada daerah glikosilasi ini

akan meningkatkan retensi virion pada membran plasma

(Matrosovich et al. 1999). Analisis posisi glikosilasi pada protein

NA dari 251 isolat VAI subtipe H5N1 di Indonesia menunjukkan

adanya 3 posisi glikosilasi yaitu 87-89 (NSS), 145-147 (NGT) dan

234-236 (NGS) (Tabel 14; Susanti 2012b). Dari ke-3 posisi

tersebut, posisi 234-236 tidak menunjukkan adanya variasi,

semuanya berpola NGS.Terdapat 1 isolat yang kehilangan

glikosilasi posisi 87-89, yaitu A/chicken/Sleman BBVW 626-

233/2007, sedangkan isolat lainnya glikosilasi posisi 87-89

berpola NGT (Tabel 14; Susanti 2012b). Sementara glikosilasi

posisi 145-147 terdapat beberapa variasi pola, yaitu NGT (238

isolat), NGS (1 isolat) dan NET (12 isolat).

Tabel 14. Variasi asam amino posisi glikosilasi yang disandi gen

NA virus AI subtipe H5N1 di Indonesia



48-67 87-89 145-147

234-236

1. Manusia 2005 10 Delesi NSS NGT NGS

2. Manusia 2006 49 Delesi NSS NGT(1) NGS

3. Manusia 2007 11 Delesi NSS NGT NGS

4. Ayam 2003 13 Delesi NSS NGT NGS


6. Ayam 2005 43 Delesi NSS NGT(2) NGS


8. Ayam 2007 20 Delesi NSS(3) NGT NGS

9 Ayam 2008 5 Delesi NSS NGT NGS

10 Ayam 2010 7 Delesi NSS NGT(4) NGS


11 Itik (25), swan (1), muscovy duck (5)2004-2008

31 Delesi NSS NGT(5) NGS

12 Babi 2005-2007

12 Delesi NSS NGT NGS

13 Puyuh (5), kalkun (2), pigeon(1), tree sparow (2) 2004-2010

10 Delesi NSS NGT(6) NGS

(1) 8 isolat asam amino NET: A/Indonesia/534H/2006; A/Indonesia/535H/2006; A/Indonesia/536H/2006; A/Indonesia/538H/2006; A/Indonesia/546H/2006; A/Indonesia/546bH/2006; A/Indonesia/560H/2006; A/Indonesia/CDC599/2006; A/Indonesia/CDC625/2006; A/Indonesia/CDC625L/2006

(2) 2 isolat asam amino NET: A/chicken/Dairi BPPVI/2005; A/chicken/Langkat BBPVI/2005

(3) 1 isolat asam amino SSS: A/chicken/Sleman BBVW 626-233/2007

(4) 2 isolat asam amino NGS: A/chicken/East Kalimantan UT581/2010; A/chicken/East Kalimantan UT581/2010

(5) 1 isolat asam amino NET: A/duck/Madium BBVW 109/2004 (6) 1 isolat asam amino NET: A/turkey/Langkat BBPVI/2005

Sekuen asam amino pembentuk oseltamifir binding

pocket pada protein NA adalah E119, R224, H274, E276, R292

dan N294 (Moscona 2005a; 2005b). Binding pocket yang sama

juga digunakan oleh zanamivir, obat anti influenza yang lain

(Moscona 2005a). Mutasi pada bagian ini dilaporkan

menyebabkan resistensi terhadap tamiflu. Hasil penelitain pada

virus AI subtipe H5N1 isolat hewan dan manusia tahun 2003-

2010 menunjukkan bahwa asam amino pembentuk oseltamivir

binding pocket yang dapat diidentifikasi adalah R224, H274,


E276, R292 dan N294.Asam amino posisi tersebut masih konserv

pada semua virus di Indonesia yang datanya terdaftar di

Genbank, kecuali 1 isolat yang mengalami mutasi H274Y yaitu

isolat A/Indonesia/560H/2007. Asam amino posisi 119 mengalami

mutasi E119R pada semua isolat virus yang diidentifikasi (Tabel

15; Susanti 2012b).

Tabel 15. Variasi asam amino oseltamifir binding pocket virus AI

subtipe H5N1 di Indonesia



119 224 274 276 292 294

1. Manusia 2005 10 R R H E R N

2. Manusia 2006 49 R R H (1) E R N

3. Manusia 2007 11 R R H E R N

4. Ayam 2003 13 R R H E R N

5. Ayam 2004 15 R R H E R N

6. Ayam 2005 43 R R H E R N

7. Ayam 2006 25 R R H E R N

8. Ayam 2007 20 R R H E R N

9 Ayam 2008 5 R R H E R N

10 Ayam 2010 7 R R H E R N

11 Itik (25), angsa (1), entok (5)2004-2008

31 R R H E R N

12 Babi 2005-2007 12 R R H E R N

13 Puyuh (5), kalkun (2), burung dara (1), tree sparow (2) 2004-2010

10 R R H E R N

(1) 1 isolat Y, yaitu A/Indonesia/560H/2007

Mutasi NA pada posisi 116, 117, 274, dan 294

menurunkan kepekaan virus terhadap oseltamivir karboksilat

(IC50s meningkat 5-940 fold). Mutasi pada posisi Y252H pada NA

berkontribusi pada penurunan kepekaan virus H5N1 terhadap

oseltamivir (Ilyushina et al. 2010). Tingkat resistensi tinggi


terhadap oseltamivir terjadi akibat mutasi H274T.Varian tersebut

telah dideteksi pada 16% anak-anak terinfeksi virus H1N1 setelah

memperoleh pengobatan oseltamivir (Ward et al. 2005). Hal

serupa juga terjadi pada beberapa pasien positif terinfeksi H5N1

yang memperoleh pengobatan oseltamivir (deJong et al. 2005;

WHO 2008). Penurunan aktivitas NA melalui inhibitor NA sangat

esensial untuk adaptasi virus pada manusia (Ilyushina et al.

2012). Hal ini perlu menjadi perhatian, terutama dalam hal

manajemen pandemi H5N1 yang lebih tepat.

Analisis filogenetik 1404 nukleotida gen NA dari 12 virus






klaster Asia (klaster 2). Pada klaster Indonesia-Asia terbentuk 2

subklaster, yaitu subklaster 1 dan 2. Subklaster 1 merupakan

kelompok VAI Indonesia, sedangkan subklaster 2 merupakan

kelompok VAI Asia. Nampak bahwa VAI isolat Indonesia

membentuk kelompok terpisah dengan kelompok virus dari

negara-negara Asia.


Gambar 23. Pohon filogenetik 1404 basa gen NA virus AI H5N1




A chicken Kupang-1-NTT BPPV6 2004

A Dk Indonesia MS 2004



A Indonesia 6 2005






A chicken Deli Serdang BPPVI 2005

A chicken Tarutung BPPVI 2005



A quail Tasikmalaya BPPV4 2004


A chicken Bali UT2092 2005

A swine East UT6005 2006

NA A swine North Sumatra UT6004 2006


A chicken EastKalimantan UT581 2010


A Indonesia CDC634P 2006


A chicken EastKalimantan UT498 2010

A chicken Sleman BBVW-626-233 2007

A duck Magelang BBVW-24-44380 2008


A Goose Guangdong1 96






A quail Malaysia 6309 2004





0.005


BAB VII

EPIDEMIOLOGI VIRUS AVIAN INFLUENZA DAN

PENULARANNYA

Epidemiologi Virus Avian Influenza

Sejak 1959 sampai akhir tahun 2003, dilaporkan hanya

terjadi 24 wabah virus influenza pada ternak unggas di seluruh

dunia. Kebanyakan wabah tersebut terbatas secara geografis

pada daerah tertentu, dan tidak satupun dari wabah-wabah

tersebut yang ukurannya mendekati wabah H5N1 di Asia tahun

2004. Sampai saat ini, semua wabah virus HPAI disebabkan oleh

virus influenza A dari subtipe H5 dan H7. Faktor utama

penyebaran virus HPAI adalah perdagangan unggas hidup dan

produknya serta melalui mobilitas manusia (wisatawan dan

pengungsi) (WHO 2004).

Dimensi baru wabah virus HPAI mencuat di akhir tahun

2003. Dari pertengahan Desember 2003 sampai awal Februari

2004, wabah yang disebabkan oleh virus HPAI H5N1 garis Asia

dilaporkan telah menyerang unggas di Korea Selatan, Vietnam,

Jepang, Thailand, Kamboja, Republik Demokratik Rakyat Laos,

Indonesia dan Cina (Maines et al. 2005; OIE 2005). Kejadian

wabah yang serentak di banyak negara oleh virus HPAI H5N1

belum pernah terjadi sebelumnya. Virus HPAI H5N1 dijumpai

pertama kali tahun 1997, merupakan hasil reasorsi dari VAI H5N1

isolat angsa domestik (A/goose/Guangdong/ 1/96) yang

menyumbangkan gen HA dan VAI H9N2 yang menyumbangkan

segmen-segmen gen penyandi protein internal (Guan et al. 1999).


Meskipun beberapa genotipe pernah dilaporkan (Cauthen et al.

2000), namun genotipe “Z” telah mendominasi wabah yang terjadi

sejak Desember 2003 (Li et al. 2004).

Pada bulan April 2005, untuk pertama kalinya, VAI H5N1

dapat mematikan ungas liar dalam skala besar (Zhou et al. 2006).

Di danau Qinghai Barat Laut Cina, beberapa ribu unggas air

migratori sakit dan mati terkena infeksi VAI H5N1 (Feare & Yasua

2006). Virus “Qinghai-like” tersebut selanjutnya menyebar ke

Rusia, Eropa dan Afrika oleh burung migratori (Webster &

Govorkova 2006). Kematian ternak unggas banyak dilaporkan di

daerah yang berdekatan dengan danau dan rawa-rawa yang

menjadi tempat singgah unggas air liar. Hal ini memperkuat

dugaan bahwa unggas migratori menjadi penyebar virus,

termasuk virus HPAI H5N1 garis Asia. Unggas air liar

diperkirakan dapat membawa virus hanya selama masa inkubasi,

atau beberapa spesies yang masih bertahan meskipun sudah

terinfeksi H5N1 (Sturm-Ramirez et al. 2004).

Virus AI subtipe H5N1 dari berbagai negara, secara

filogenetik terpisah menjadi 2 clade. Clade 1 adalah virus yang

diisolasi pada unggas dan manusia di Kamboja, Thailand,

Vietnam, Laos, Korea Selatan dan Jepang tahun 2003-2004.

Clade 2 terbagi menjadi 3 subclade. Subclade 1 adalah virus dari

Indonesia tahun 2004-2006 dan isolat Hongkong tahun 2003.

Subclade 2 adalah isolat virus dari Rusia, Turki dan Timur

Tengah tahun 2005-2006. Subclade 3 adalah isolat dari Laos,

Thailand, Kamboja dan Vietnam tahun 2005-2006 (WHO 2005b;

Webster & Govorkova 2006).


Virus-virus AI dalam clade dan subclade terpisah

mempunyai perbedaan struktur antigenik, sehingga setiap clade

atau subclade memerlukan vaksin yang berbeda. Studi pada feret

menunjukkan bahwa vaksin terhadap satu clade tidak protektif

terhadap clade lainnya (Webster & Govorkova 2006). Disamping

struktur antigenik, antar clade dan subclade yang berbeda juga

menunjukkan perbedaan sensitifitas terhadap obat antivirus

influenza (Webster & Govorkova 2006). Mayoritas virus clade 1

resisten terhadap amantadin dan rimantadin, namun mayoritas

virus clade 2 sensitif terhadap kedua jenis antivirus tersebut.

Meskipun demikian, semua VAI H5N1 sensitif terhadap inhibitor

neuraminidase (Webster & Govorkova 2006; Kandun et al. 2006).

Penyebaran VAI H5N1 secara global disebabkan oleh

perdagangan unggas dan/atau produk unggas serta pergerakan

unggas migratori (Capua & Marangon 2006; Chen et al. 2006).

Analisis penyebaran global VAI H5N1 di Asia menunjukkan

bahwa 9 dari 21 introduksi virus ke negara-negara Asia melalui

perdagangan unggas atau produk unggas. Burung migratori juga

berperan pada penyebaran dan introduksi VAI H5N1 ke 3 dari 21

negara-negara di Asia. Sementara introduksi VAI H5N1 pada 20

dari 23 negara di Eropa terjadi melalui unggas migratori. Di Afrika,

2 dari 8 negara mengalami introduksi VAI H5N1 melalui

perdagangan unggas dan 3 dari 8 negara melalui unggas

migratori (Kilpatrick et al. 2006). Hasil penelitian Susanti et al.

(2008d) menunjukkan bahwa analisis filogenetik VAI H5N1 isolat

unggas air dari Jawa Barat membentuk tiga percabangan secara

terpisah, yaitu satu percabangan pada klaster Indonesia dan dua


percabangan pada klaster Asia. Hasil ini mengindikasikan bahwa

introduksi VAI H5N1 ke Indonesia terjadi lebih dari satu kali.

Burung liar migratori nampaknya juga berperan penting pada

introduksi VAI H5N1 ke Indonesia. Enam virus isolat unggas air

(IPB1-RS s/d IPB6 RS) merupakan strain virus yang berbeda

dengan VAI H5N1 yang telah diisolasi di Indonesia sebelumnya.

Hasil ini didukung dengan uji reaksi silang antara VAI H5N1 isolat

ayam Legok 2003 dengan 9 virus AI H5N1 isolat unggas air

tersebut, bahwa semua virus mempunyai struktur antigenik yang

berbeda dengan strain ayam Legok 2003 (Susanti et al. 2008d).

Telaah Virus Avian Influenza di Indonesia

Kasus VAI H5N1 pada unggas di Indonesia muncul pertama

kali pada bulan Agustus 2003 di beberapa peternakan ayam ras

komersial di Jawa Barat dan Jawa Tengah. Kasus ini kemudian

meluas ke berbagai daerah di Jawa Tengah, Jawa Barat, Jawa

Timur, DIY, Lampung, Bali serta beberapa daerah di Sumatera

dan Kalimantan. Sampai akhir tahun 2003, kasus VAI dinyatakan

endemik di 9 propinsi, terdiri dari 51 kabupaten/kota dengan

jumlah kematian unggas mencapai 4,13 juta ekor (Data Dirjen

Peternakan RI 2004). Jumlah kematian unggas sampai bulan

November 2005 diperkirakan mencapai 10,45 juta ekor. Jumlah

kematian unggas pada tahun 2005 cenderung menurun drastis

dibanding tahun 2003 dan 2004, meskipun daerah yang terserang

cenderung lebih luas.

Virus AI subtipe H5N1 di Indonesia termasuk genotipe Z.

Genotipe ini pertama kali ditemukan pada unggas di Cina Selatan


tahun 2002 (Smith et al. 2006). Analisis filogenetik gen HA dari

VAI H5N1 dari berbagai wilayah geografi dan berbagai spesies

hewan di Indonesia menunjukkan bahwa VAI H5N1 di Indonesia

membentuk satu klaster (cluster), terpisah dengan isolat dari

negara lain. Analisis serupa juga menunjukkan bahwa virus

Indonesia mengelompok berdasarkan wilayah geografis,

sehingga terbentuk 3 grup (A, B dan C). Grup A adalah kelompok

virus dari kawasan tengah dan timur Indonesia, yaitu Jawa,

Sulawesi Selatan dan Timor Barat. Grup B juga terdiri dari isolat

virus di kawasan tengah dan timur Indonesia yaitu Jawa, Bali,

Flores dan Timor Barat. Termasuk grup C adalah isolat virus dari

pulau Jawa, Sumatera dan Bangka (Smith et al. 2006). Infeksi

VAI H5N1 pada manusia mulai terjadi pada Juli 2005. Infeksi VAI

H5N1 pada manusia terjadi secara sporadis dan menyerang

beberapa klaster famili (Kandun et al. 2006; Sedyaningsih et al.

2007). Sejak awal infeksi sampai bulan Juni 2006, tercatat 54

kasus infeksi dan 21 infeksi diantaranya terjadi pada 7 klaster

famili. Tingkat fatalitas kasus VAI H5N1 mencapai 76%, terutama

menginfeksi manusia usia kurang dari 40 tahun dan 57,4%

menyerang laki-laki (Sedyaningsih et al. 2007). Kasus infeksi VAI

H5N1 pada klaster famili kemungkinan dipengaruhi oleh faktor

genetik, tingkah laku, imunologik, dan lingkungan (Kandun et al.

2006). Semua kasus infeksi VAI H5N1 di Indonesia merupakan

VAI H5N1 clade 2 subclade 1 (Kandun et al. 2006; Sedyaningsih

et al. 2007).

Sampai saat ini (24 Januari 2008), dikonfirmasi sebanyak

120 kasus penularan VAI H5N1 pada manusia dan 97


diantaranya meninggal dunia (Depkes 2008; WHO 2008). Jumlah

kematian manusia akibat VAI H5N1 di 12 propinsi di Indonesia ini

tercatat paling tinggi di dunia (WHO 2008). Dari tahun 2003-2008

dilaporkan WHO 352 kasus penularan, dan 219 diantaranya

meninggal dunia (WHO 2008). Transmisi VAI dari unggas ke

manusia masih dianggap terjadi secara langsung dari unggas

(ayam) atau lingkungan yang terkontaminasi virus AI (Smith et al.

2006). Sampai tanggal 10 Agustus 2012, jumlah kasus dan



orang positif terinfeksi (WHO 2012). Data kejadian dan kematian

di seluruh dunia adalah 359 kematian dari 608 kejadian (WHO

2012).

Peran Unggas Air pada Penyebaran Virus Avian Influenza

Unggas air, termasuk ordo Anseriformes (itik, entok,

angsa) dan Charadriiformes (burung camar dan burung dara

laut) adalah inang alami semua subtipe virus influenza A,

sehingga sangat memungkinkan sebagai reservoir (penampung)

virus influenza A (Olsen et al. 2006; Fouchier et al. 2007; Webster

et al. 2007). Sementara, semua unggas termasuk unggas

domestik (ayam, kalkun, puyuh) termasuk rentan terinfeksi. Pada

inang alami, virus berada dalam keadaan seimbang dan tidak

menunjukkan gejala klinis. Dalam tubuh hospes alami ini, secara

evolusioner virus dalam keadaan statis, yang secara molekuler

ditandai dengan rendahnya rasio substitusi N/S (Taubenberger et

al. 2005). Antara hospes dengan virus terjadi toleransi yang


seimbang, dimana replikasi virus secara efisien dan tidak

menyebabkan penyakit. Virus bereplikasi di saluran pencernaan

unggas air, sehingga ekskresi virus bersama feses dapat

ditransmisikan ke unggas atau mamalia lain melalui fecal-oral

(Sturm-Ramirez et al. 2004).

Penelitian di Pakistan menunjukkan bahwa 15% itik dan

angsa merupakan reservoir VAI. Selain unggas air, burung liar

juga dilaporkan sebagai reservoir VAI (Khawaja et al. 2005).

Prevalensi VAI subtipe H5N1 di pasar unggas di Hongkong tahun

1997 paling tinggi ditemukan pada ayam (19,5%), diikuti angsa

(2,5%) dan itik (2,4%) (Sortridge 1997). Sementara di pasar

unggas Nanchang, Cina tahun 2000, prevalensi VAI paling tinggi

dijumpai pada itik (1,3%), diikuti ayam (1,2%), puyuh (0,8%) dan

merpati (0,5%) (Liu et al. 2003). Prevalensi virus HPAI subtipe

H5, H7, H9 pada unggas air di Minnesota mencapai 21,5%,

sementara prevalensi subtipe H3, H4 dan H6 mencapai 63,8%.

Prevalensi subtipe H5 dan H9 masing-masing sebesar 0,4% dan

prevalensi subtipe H7 mencapai 0,7% (Hanson et al. 2003).

Sistem penggembalaan itik secara bebas, terutama pada

saat panen padi dilaporkan juga merupakan faktor yang berperan

pada penyebaran virus HPAI H5N1 (Gilbert et al. 2006).

Sebanyak 27% flock itik backyard di Thailand positif terinfeksi VAI

H5N1. Dan pada saat wabah VAI H5N1 pada unggas dan

manusia akhir tahun 2004, 47% flock itik backyard positif

terinfeksi VAI H5N1. Infeksi VAI H5N1 pada itik tersebut di atas

bersifat subklinis, namun virus tetap diekskresikan bersama

feses dalam waktu cukup lama (Songserm et al. 2006).


Seroprevalensi VAI pada unggas air (itik, entok dan angsa)

secara signifikan lebih tinggi dibandingkan seroprevalensi pada

ayam kampung. Hal ini semakin nyata terlihat pada sampling

pemeriksaan terhadap itik di daerah sangat tercemar seperti

daerah Jawa Barat (FKH IPB 2006). Hasil penelitian Susanti et al.

(2008b) menunjukkan bahwa dari total 460 sampel, 21 isolat

positif VAI H5N1 (4,57%), 13 isolat HxN1(2,83%), 3 isolat H5Nx

(0,65%) dan 8 isolat HxNx (1,74%). Sebaran VAI subtipe H5N1

yang berhasil diisolasi dari unggas air di peternakan skala rumah

tangga di Jawa Barat adalah 17 isolat dari Kabupaten Bogor dan

4 isolat dari Kabupaten Sukabumi. Prevalensi di masing-masing

kabupaten adalah 6,49% di Bogor dan 2,02% di Sukabumi.

Angka prevalensi pada masing-masing spesies adalah 6,67%

pada angsa, 4,85% pada itik, dan 4,04% pada entok. Di

Kabupaten Bogor, prevalensi pada angsa 8,57%, pada itik 6,49%,

dan pada entok 5,48%. Di Kabupaten Sukabumi, prevalensi pada

angsa 4,00%, pada entok 3,33%, dan pada itik 1,40%. Data ini

menunjukkan bahwa unggas air (itik, entok, angsa) ini berpotensi

sebagai sumber penularan VAI H5N1 ke unggas darat dan

manusia. Data ini menunjukkan bahwa unggas air (itik, entok,

angsa) ini berpotensi sebagai sumber penularan VAI H5N1 ke

unggas darat dan manusia.

Salah satu unggas air, yaitu itik, juga dianggap sebagai

sumber VAI H5N1 pada wabah di Cina tahun 2000-2004 (Chen et

al. 2004; Li et al. 2004). Wabah VAI H5N1 di Hongkong tahun

2001 juga berasal dari reservoir itik dan angsa yang mengalami

reasorsi dengan VAI lainnya sehingga muncul virus yang bersifat


patogenik pada unggas darat (Sturm-Ramirez et al. 2004).

Inokulasi 23 isolat VAI H5N1 pada itik jantan menunjukkan bahwa

semua isolat VAI H5N1 dapat bereplikasi secara efisien dan 22

diantaranya ditransmisikan pada hewan peka melalui kontak

(Sturm-Ramirez et al. 2005). Strain patogenik VAI H5N1 hanya

menyebabkan gejala klinis ringan pada itik, tetapi tetap

mengekskresikan virus bersama kotorannya yang berpotensi

untuk menular ke unggas lain dan (bahkan) juga ke manusia

(Kishida et al. 2005; Strurm-Ramirez et al. 2005).

Penelitian yang dilakukan Chen et al. (2004) dan Li et al.

(2005) juga menunjukkan bahwa isolat VAI H5N1 dari itik sehat

secara progresif dapat bereplikasi dan menyebabkan berbagai

penyakit pada mencit. VAI H5N1 yang bersifat patogenik tinggi

pada unggas darat, menjadi patogenik rendah jika diinokulasikan

pada itik. Pada itik tidak menyebabkan gejala klinis tetapi ekskresi

virus dari itik terjadi terus menerus sehingga berpotensi

menyebarkan virus yang bersifat patogenik bagi unggas lain dan

(bahkan) juga pada manusia (Hulse-Post et al. 2005).

Infeksi VAI sangat jarang terjadi bersifat letal pada unggas

air. Wabah VAI H5N1 di Hongkong akhir tahun 2002

menyebabkan kematian pada burung migratori dan unggas air

domestik termasuk itik, merupakan laporan pertama setelah

tahun 1961, dimana infeksi VAI bersifat letal pada unggas air

(Sturm-Ramirez et al. 2004). Virus HPAI H5N1 juga

menyebabkan wabah di Danau Qinghai Cina tahun 2005 yang

mematikan ribuan unggas air migratori (Zhou et al. 2006).


Transmisi VAI dari unggas air ke unggas lain kemungkinan

melalui pasar unggas, dimana kontak antara unggas air dan

unggas lainnya seperti ayam, puyuh, dan burung-burung lainnya

tidak terhindarkan lagi (Weaver 2005; Gilbert et al. 2006). Puyuh

disebutkan merupakan hospes perantara transmisi VAI dari

unggas air ke unggas darat. Puyuh menyediakan lingkungan

untuk adaptasi VAI subtipe H9 dari itik sehingga membentuk

varian baru yang dapat menginfeksi unggas lainnya (Perez et al.

2003).

Hasil penelitian wabah VAI di Hongkong menunjukkan

bahwa VAI H5N1 isolat ayam berbeda dengan isolat unggas air.

VAI H5N1 isolat ayam mengalami delesi 19 asam amino pada

tangkai (stalk) NA dan ada tambahan posisi glikosilasi pada HA.

Delesi asam amino pada NA menyebabkan penurunan

kemampuan pelepasan virus dari sel, sementara penambahan

glikosilasi pada HA menyebabkan penurunan afinitas ikatan HA

pada reseptor sel hospes. Perubahan NA dan HA pada ayam ini

merupakan bentuk adaptasi virus dari unggas air ke unggas darat

dan memperbesar peluang unggas domestik sebagai hospes

intermedier pada transmisi zoonotik (Matrosovich et al. 1999)

Transmisi virus dari unggas air ke unggas darat dapat

terjadi dua arah. VAI H9N2 yang awalnya berasal dari unggas air

ditransmisikan ke unggas darat dan mengalami reasorsi. Virus

dari unggas darat ini ditransmisikan kembali ke unggas air dan

mengalami reasorsi kembali membentuk varian baru yang

berpotensi untuk menginfeksi manusia secara langsung (Li et al.

2003). Hal ini menunjukkan bahwa unggas air juga berpotensi


sebagai “mixing vessel” yang memunculkan varian-varian virus

baru yang berpotensi sebagai penyebab pandemi influenza pada

manusia (Xing et al. 2007).

Cara Perlindungan dan Pencegahan Infeksi Virus Avian

Influenza

Virus Avian Influenza seperti virus influenza lainnya,

secara alami sering mengalami mutasi (Bab III), sehingga ketika

ada wabah virus ini dan menimbulkan banyak kematian unggas

dan bahkan manusia, masyarakat tidak perlu panik dan

ketakutan. Pada kondisi demikian langkah yang peling tepat

dilakukan adalah waspada dan berhati-hati. Jika virus ini

bermutasi sedemikian rupa sehingga dapat menyerang manusia

secara rutin, maka mutasi tersebut akan menghasilkan virus yang

jauh berkurang keganasannya. Fakta membuktikan bahwa

dengan berjalannya waktu, kasus kematian unggas dan manusia

semakin menurun dan menurun bahkan tidak ada lagi laporan

yang masuk. Hal ini menunjukkan bahwa virus ini tidak

menunjukkan keganasannya lagi.

Meskipun demikian, ketika wabah mematikan dari virus ini

terjadi di sekitar kita, ada beberapa langkah yang perlu dilakukan

(Komnas FBPI 2007).

1. Jika menemukan unggas sakit mendadak tanpa gejala sakit,

(a) Segera laporkan ke RT/RW/Kepala Desa. Langkah ini

merupakan upaya peringatan dini sehingga mencegah

terjadinya kasus yang lebih buruk.


(b) Jangan menyentuh unggas sakit/mati tanpa menggunakan

pelindung tangan/kantong plastik, pelindung mulut

(masket/sapu tangan) dan sepatu boot.

(c) Bangkai unggas dibakar dan dikubur sedalam lutut orang

dewasa agar tidak dapat digali hewan lain.

(d) Jangan membuang bangkai ke sungai/selokan, karena

dapat menyebarkan virus melalui air.

(e) Ayam yang sakit atau mati jangan diperjualbelikan dan

dikonsumsi

(f) Pastikan kandang selalu bersih dengan cara mencuci

kandang dengan sabun/detergen secara teratur

(g) Cuci tangan dengan sabun dan air mengalir setelah

menyentuh unggas sakit/mati

(h) Kosongkan kandang selama 3 minggu sebelum

memasukkan unggas baru

(i) kandangkan segera unggas yang masih hidup. Dengan

dikandangkan akan memudahkan petugas melakukan

pemeriksaan dan tindakan lain yang diperlukan

2. Langkah-langkah sebagai upaya pencegahan:

(a) Jika ada gejala flu dan demam setelah berdekatan dengan

unggas, segera laporkan dan periksakan diri ke puskesmas

atau rumah sakit. Dengan demikian, jika terjadi sesutu

dapat segera diatasi.

(b) Kandang ayam dipisahkan dengan kandang itik.

Pemisahan antar jenis unggas dapat mengurangi kontak

dan resiko terjadinya penularan virus ke unggas lain serta

manusia.


(c) Stok ayam/itik baru dipisahkan dari ayam/itik yang lama

selama 2-3 minggu. Hal ini untuk memastikan bahwa

ayam/itik yang baru tidak membawa virus dan tidak

menularkan pada ayam/itik lama

(d) Kandang ayam/itik harus dipisahkan dari pemukiman.

Unggas harus selalu dikandangkan terpisah dengan

pemukiman, untuk mencegah kemungkinan penularan

virus ke manusia

(e) Bagi pekerja kandang, pakaian kerja, sepatu, alat

transportasi dan kandang segera dicuci dan dibersihkan

dengan sabun atau obat suci hama segera setelah

pekerjaan selesai. Mencucui dengan sabun akan

mencegah pencemaran dari bagian yang terinfeksi ke

bagian yang belum terinfeksi.

(f) Bagi ibu-ibu yang memasak daging unggas, disarankan

mencuci tangan dengan sabun dan air mengalir setelah

menyentuh unggas serta sebelum dan setelah memasak.

Mencuci tangan dan peralatan dengan sabun akan

mencegah penularan ke manusia karena pemakaian ulang

alat yang tidak bersih

(g) Virus flu burung akan mati jika daging dan telur dimasak

hingga matang. Jadi tidak perlu takut mengkonsumsi

daging dan telur ayam yang telah dimasak matang.

Meskipun demikian, lebih baik membeli dan memasak

unggas yang sehat, bukan bangkai.

(h) Pekerja kandang/peternak harus mengenali gejala utama

flu burung pada unggas, yaitu mati mendadak tanpa gejala


sakit. Gejala lain yang menyertai adalah jengger bengkak

berwarna biru atau berdarah, kepala tertunduk menyatu

dengan badan, kepala dan kelopak mata bengkak,

perdarahan di bawah kulit yang tidak ditumbuhi bulu

(i) Sebagai pencegahan pada ayam yang masih hidup, perlu

dilakukan vaksinasi. Untuk mendapatkan informasi tentang

vaksin, menghubungi petugas dinas peternakan/pertanian


BAB VIII

PENUTUP

Kasus penyebaran VAI subtipe H5N1 pada unggas di

Indonesia muncul pertama kali pada bulan Agustus 2003 di

beberapa peternakan ayam ras komersial di Jawa Barat dan

Jawa Tengah. Kasus ini kemudian meluas ke berbagai daerah di

Jawa Tengah, Jawa Barat, Jawa Timur, DIY, Lampung, Bali serta

beberapa daerah di Sumatera dan Kalimantan. Infeksi VAI H5N1

pada manusia mulai terjadi pada Juli 2005. Infeksi VAI H5N1

pada manusia terjadi secara sporadis dan menyerang beberapa

klaster famili (Kandun et al. 2006; Sedyaningsih et al. 2007).



unggas ke berbagai spesies mamalia termasuk manusia (Kalthoff

et al. 2010). Sejak awal infeksi sampai bulan Juni 2006, tercatat

54 kasus infeksi dan 21 infeksi diantaranya terjadi pada 7 klaster

famili. Tingkat fatalitas kasus VAI H5N1 mencapai 76%, terutama

menginfeksi manusia usia kurang dari 40 tahun dan 57,4%

menyerang laki-laki (Sedyaningsih et al. 2007). Dari tahun 2003-

2008 dilaporkan WHO 352 kasus penularan, dan 219 diantaranya

meninggal dunia (WHO 2008). Transmisi VAI dari unggas ke

manusia masih dianggap terjadi secara langsung dari unggas

(ayam) atau lingkungan yang terkontaminasi virus AI (Smith et al.

2006). Sampai tanggal 10 Agustus 2012, jumlah kasus dan




orang positif terinfeksi (WHO 2012). Data kejadian dan kematian

di seluruh dunia adalah 359 kematian dari 608 kejadian (WHO

2012).

Virus influenza, bentuk dan ukuran bersifat

pleiomorfik (berubah-ubah), berbentuk filamen atau sferoid

(bola) dengan diameter 80-120 nm (Harris et al. 2006). Virus

influenza adalah virus anggota famili Orthomyxoviridae (ICTV

2006). Di dalam virion influenza tipe A dan B terdapat 8

segmen genom RNA serat tunggal (single-stranded RNA)

berpolaritas negatif yang menyandi 11 protein. Delapan

segmen tersebut adalah PB1 (PB1 dan PB1-F2), PB2, PA, HA,

NP, NA, M (M1 dan M2), serta NS (NS1 dan NS2) (Horimoto dan

Kawaoko, 2001; Whittaker, 2001). Kedelapan segmen RNA

bersama-sama dengan nukleoprotein (NP) membentuk

ribonukleoprotein (RNP) (Bui et al. 2000; Elton et al. 2001; Munch

et al. 2001). RNP dikelilingi oleh protein matriks M1. Pada

permukaan amplop virus terdapat glikoprotein HA dan NA serta

kanal ion (ion channel) M2 (Elton et al. 2001).

Virus influenza tipe A secara natural dapat menginfeksi

unggas dan manusia (Khawaja et al. 2005). Virus ini dibagi ke

dalam berbagai subtipe berdasarkan analisis serologis dan

genetis glikoprotein hemaglutinin (HA) dan neuraminidase (NA)

(Lee et al. 2001). Sampai saat ini ada 16 subtipe HA (H1-H16)

dan 9 subtipe NA (N1-N9) (Russell and Webster 2005). Siklus

replikasi virus influenza A mempunyai keunikan karena semua

sintesis mRNA dan replikasi genom terjadi di dalam nukleus sel


hospes yang terinfeksi. Proses replikasi virus sangat cepat,

sekitar 10 jam/siklus (Coleman 2007).

Penelitian yang berhubungan dengan virus avian influenza

dilakukan di laboratorium standart Biosafety Level 2 (BSL-2) plus

atau BSL-3. Namun untuk propagasi virus AI subtipe H5N1 pada

hewan coba (pada tikus, marmut, ayam atau itik, dll) harus

dilakukan di laboratorium BSL-3. Tahap pertama yang harus

dilakukan untuk memperbanyak dan mengisolasi virus adalah

mengambil contoh/sampel yang diduga mengandung virus.

Mengingat VAI berkembang/bermultiplikasi pada sel epitel

saluran pencernaan dan pernafasan, maka sampel dapat diambil

dari usap hidung, usap anus atau usap kloaka. Untuk mengetahui

apakah pada sampel terdapat virus yang dimaksud atau tidak,

sampel harus ditanam pada media yang sesuai. Mengingat virus

adalah organisme yang hanya dapat bereplikasi pada sel hidup,

maka media yang sesuai untuk menumbuhkan virus adalah sel

hidup. Virus influenza A dapat bereplikasi secara in ovo pada

telur ayam berembrio (TAB) maupun secara in vitro pada kultur

sel Madin Darby Canine Kidney (MDCK) (Whittaker 2001; Ito et

al. 1997). TAB merupakan metode terbaik untuk isolasi virus

influenza, karena lebih sensitif dibandingkan sel kultur MDCK

(Clavijo et al. 2002). Meskipun demikian, MDCK merupakan sel

yang paling sensitif untuk isolasi virus influenza A dibanding sel

kultur Vero dan MRC-5 (Reina et al. 1997). Hasil perbanyakan

virus perlu diuji keberadaan virus influenza, dan sebagai skrining

awal dilakukan uji hemaglutinasi (HA). Uji hemaglutinasi

digunakan untuk mendeteksi keberadaan virus yang mempunyai


kemampuan mengaglutinasi sel darah merah. Hemaglutinin (pada

VAI) akan melekat secara spontan pada sel darah merah. Jika

sampel yang diduga mengandung berasal dari unggas, virus yang

berkemampuan mengaglutinasi SDM merupakan virus golongan

Orthomyxoviridae (misal: virus influenza) atau Paramyxoviridae

(misal: New Castle Disease; ND) (OIE 2004). Dengan demikian,

jika hasil uji HA positif, kemungkinan sampel mengandung virus

ND atau virus AI, sehingga perlu diuji lebih lanjut dengan

penanda lain (misal dengan PCR atau uji antigenesitas).

Cairan alantois yang positif bersadarkan uji HA, selanjutnya

diisolasi RNA-nya dan diidentifikasi subtipe virus AI-nya

berdasarkan gen hemaglutinin (HA) dan neuraminidase (NA).

Subtiping (penentuan subtipe) VAI subtipe H5 dan N1 dapat

dilakukan dengan metode reverse transcriptase-polymerase chain

reaction (RT-PCR). Reverse transcription (RT) adalah pembuatan

cDNA yang bersifat komplementer dengan RNA virus,

menggunakan enzim reverse transcriptase. PCR merupakan

metode alternatif untuk mengidentifikasi virus AI, meskipun

material genetik virus hanya terdapat dalam jumlah sedikit (WHO

2002; Payungporn et al. 2004; OIE 2005). Untuk menganalisis

gen-gen virus AI, langkah pertama yang dilakukan adalah

mengamplifikasi gen yang dimaksud dan disekuensing. Pada

analisis gen, biasanya panjang nukleotida yang dianalisis cukup

panjang (partial) atau bahkan komplit (lengkap) menggunakan

primer full length atau primer lain yang didesain sendiri. Pita-pita

DNA spesifik produk PCR pada gel elektroforesis selanjutnya

dipurifikasi, sebelum disekuensing. Sekuensing dilakukan dengan


metode dideoksi menggunakan ABI automatic sequencer sesuai

prosedur standart. Runutan nukleotida gen hasil sekuensing dan

turunan asam aminonya dianalisis dengan software tertentu

seperti MEGA 3.1 (Kumar et al. 2004). Sekuen nukleotida yang

diperoleh dengan metode yang standart dan telah diyakini

kebenarannya, didaftarkan di GenBank sebagai salah satu bentuk

etika moral peneliti terhadap kelengkapan database dan

peningkatan khasanah keilmuan secara universal.

Gen-gen VAI subtipe H5N1 asal manusia dan hewan di

Indonesia yang teregristrasi di GenBank adalah gen HA

(sebanyak 565 isolat), disusul berturut-turut gen NA (262 isolat),

gen NS (173 isolat), gen PB1 (155 isolat), dan gen PB2 (137

isolat) (Susanti 2012a). Data yang diperoleh menunjukkan bahwa

VAI subtipe H5N1 asal manusia dan hewan terus berevolusi

terlihat dari dinamika molekuler gen-gen yang teramati. Dinamika

molekuler kemungkinan berhubungan dengan peningkatan

patogenesitas dan kemampuan virus untuk transmisi ke manusia.

Dari 5 gen yang dianalisa (HA, NA, PB1, PB2, NS1), gen HA

yang paling banyak memiliki variasi akibat substitusi non sinonim,

dan gen PB2 yang paling konserv.

Analisis gen HA virus AI subtipe H5N1 isolat manusia dan

hewan di indonesia, variasi banyak terjadi pada posisi asam

amino antigenik site, residu kantong pengikat reseptor, daerah

pemotongan HA dan posisi glikosilasi. Isolat VAI H5N1 penyebab

wabah kematian unggas di Indonesia tahun 2003-2004

mempunyai pola asam amino daerah pemotongan QRERRRKKR,

kecuali isolat A/Chicken/Kulonprogo/BBVet-XIII yang mengalami


delesi satu asam amino lisin (K) sehingga mempunyai pola

daerah pemotongan QRERRK_R. Mulai tahun 2005, muncul

isolat VAI H5N1 dengan sekuen daerah pemotongan

QRESRRKKR, QIERRRKKR, QRERRREKR, QGERRRKKR,

QRERRRK_R dan QRE_RRKKR (Susanti 2012a). Meskipun

bervariasi, semua VAI H5N1 yang bersirkulasi di Indonesia

menunjukkan karakter molekuler HPAI dengan sekuen daerah

pemotongan bervariasi (Susanti 2012a).

Selain posisi yang menunjukkan banyak

variasi/polimorfisme, posisi-posisi tertentu dari gen HA relatif

stabil, yaitu residu pengikat reseptor dan peptida fusi. Residu

pengikat reseptor pada VAI H5N1 isolat hewan dan manusia di

Indonesia adalah glutamin (Q) dan glisin (G) berturut-turut pada

asam amino nomor 222 dan 224 (Susanti 2012a). Residu

pengikat reseptor seperti itu dianggap spesifik berikatan dengan

reseptor avian α-2,3NeuAcGal (Gambaryan et al. 2006; Smith et

al. 2006; Leung 2007). Sekuen asam amino peptida fusi VAI

H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia ada 3 varian, yaitu

GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG (345 isolat),

GLFGAIAGFIEG GWQGMIDGWYG (4 isolat),

GLFGAIADFIEGGWQGMVDGWYG (1 isolat) (Susanti 2012a).

Sekuen asam amino peptida fusi

GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG adalah khas VAI H5N1

penyebab wabah di Asia (Cross et al. 2001).

Analisis gen NS1 menunjukkan bahwa dari 168 virus AI

subtipe H5N1 isolat manusia dan hewan di Indonesia yang

dianalisis, semuanya mengalami delesi 5 asam amino nomor 80-


84, kecuali isolat A/Chicken/Pessel/BPPVRII/2007 (Susanti

2012a). Namun, asam amino nomor 92 (salah satu marka

patogenesitas) dari semua virus yang dianalisis adalah D

(aspartat), atau dengan kata lain tidak mengalami mutasi D92E

(Susanti 2012a). Hasil analisis gen NS1 juga menunjukkan bahwa

168 isolat VAI H5N1 di Indonesia semuanya mempunyai asam

amino Alanin (A) pada nomor 149 (Susanti 2012a). Asam amino

A149 merupakan salah satu penentu patogenesitas virus, yaitu

bersifat antagonis terhadap induksi interferon (Li et al. 2006).

Analisis gen PB1-F2 pada 148 isolat virus AI subtipe

H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia menunjukkan bahwa

asam amino nomor 66 adalah N (Susanti 2012a). Asam amino

N66 PB1-F2 merupakan indikator letalitas tinggi pada virus AI

tahun 1918 (Schnolke et al. 2011). Asam amino N66 berimplikasi

patogenesitas pada mamalia (Conello et al. 2007; Schnolke et al.

2011).

Hasil analisis gen PB2 pada 158 isolat virus AI di Indonesia

menunjukkan bahwa hanya 5 isolat virus AI asal manusia

(A/Indonesia/CDC759/2006; A/Indonesia/CDC390/ 2006;

A/Indonesia/ CDC370E/2006; A/Indonesia/321H/2006; dan

A/Indonesia/CDC1031/ 2007) yang asam amino posisi 627

adalah K (Susanti 2012a). Hal ini menunjukkan bahwa bukan

hanya mutasi E627K dari PB2 yang berkontribusi pada

mekanisme adaptasi virus dari unggas ke manusia. Asam amino

pada PB2 adalah F363 dan F404 pada 158 VAI H5N1 di

Indonesia yang dianalisis. Hal ini menunjukkan bahwa protein


untuk proses vital virus tidak banyak mengalami mutasi bahkan

bersifat konserv.

Pada analisis gen NA, semua virus H5N1 Indonesia asal

manusia dan hewan tahun 2003-2010, mempunyai delesi 20

asam amino pada regio stalk yaitu pada posisi 48-67 (Susanti

2012b). Tempat glikosilasi pada regio stalk dari protein

neuraminidase berperan dalam menjaga struktur tetramer dari

protein (Luo et al. 1993). Delesi pada daerah glikosilasi ini akan

meningkatkan retensi virion pada membran plasma (Matrosovich

et al. 1999). Virus AI subtipe H5N1 isolat hewan dan manusia

tahun 2003-2010 mempunyai 5 asam amino pembentuk

oseltamivir binding pocket yang dapat diidentifikasi yaitu R224,

H274, E276, R292 dan N294. Asam amino posisi tersebut masih

stabil pada semua virus di Indonesia yang datanya terdaftar di

Genbank, kecuali 1 isolat yang mengalami mutasi H274Y yaitu

isolat A/Indonesia/560H/2007 (Susanti 2012b).

Berdasarkan kajian teori dan hasil-hasil penelitian

diketahui bahwa virus Avian Influenza subtipe H5N1 di Indonesia

selalu berevolusi ditunjukkan oleh dinamika molekuler yang

terjadi pada gen-gen virus ini. Dinamika molekuler terutama

terjadi pada gen-gen penyandi glikoprotein permukaan, dan

glikoprotein inilah yang bertanggung jawab terhadap mekanisme

infeksi pada sel hospes dan pengenalan antibodi. Gen-gen yang

bertanggung jawab terhadap aktivitas vital virus tersebut,

nampaknya tidak banyak menymbangkan terjadinya dinamika

mokuler. Gen-gen virus avian influenza secara natural mudah

mengalami mutasi, dan mutasi inilah penyebab terjadinya


dinamika molekuler. Di sisi lain, mutasi juga terjadi akibat

tingginya tekanan lingkungan hidup virus tersebut. Semakin tinggi

tekanan akibat respon imun hospes, semakin tinggi tingkat

mutasinya. Demikian juga semakin tinggi perubahan lingkungan,

semakin cepat terjadi mutasi akibat adaptasi virus terhadap

lingkungan yang baru. Dinamika molekuler inilah yang

mengakibatkan tidak efisiennya program vaksinasi. Vaksin harus

selalu di up-date sesuai strain virus lokal dan mengikuti dinamika

molekuler (gen-gen) yang terjadi. Dengan terjadinya dinamika

molekuler virus avian influenza, penelitian virus ini akan selalu

berkembang sehingga metode dasar yang dikemukakan dalam

buku ini diharapkan dapat bermanfaat.


DAFTAR PUSTAKA

Ali A, Avalos RT, Ponimaskin E, Nayak DP. 2000. Influenza virus

assembly : effect of influenza virus glycoproteins on the membrane association of M1 protein. J Virol 74: 8709-8719

Auewarakul P, Suptawiwat O, Kongchanagul A, Sangma C,

Suzuki Y, Ungchusak K, Louisirirotchanakul S, Lerdsamran H, Pooruk P, Thitithanyanont A, Pittayawonganon C, Guo C-T, Hiramatsu H, Jampangern W, Chunsutthiwat S, Puthavathana P. 2007. An avian influenza H5N1 virus that binds to a human-type receptor. J Virol 81: 9950-9955

Bae SH, Cheong HK, Lee JH, Cheong C, Kainosho M, Choi BS.

2001. Structural features of an influenza virus promoter and their implications for viral RNA synthesis. Proc Natl Acad Sci USA 98: 10602-10607

Beato MS, Toffan A, Nardi R De, Cristalli A, Terregino C, Cattoli

G, Capua I. 2007. A conventional, inactivated oil emulsion vaccine suppresses shedding and prevents viral meat colonisation in commercial (Pekin) ducks challenged with HPAI H5N1. Vaccine 25: 4054-4072

Belshe RB. 2005. The origins of pandemic influenza-lesson from

the 1918 virus. N Engl J Med 353: 2209-2211 Bender C, Hall H, Huang J, Klimov A, Cox N, Hay A, Gregory V,

Cameron K, Lim W & Subbarao K. 1999. Characterization of the Surface Proteins of Influenza A (H5N1) Viruses Isolated from Humans in 1997–1998. Virology 254 (1): 115-123

Berkoff EGM, Wit E de, Geelhoed-Mieras MM, Boon ACM,

Symons J, Faouchier RAM, Osterhaus ADME, Rimmelzwaan GF. 2005. Functional constraints of influenza A virus epitopes limit escape from cytotoxic T lymphocytes. J Virol 79: 11239-11246

Brown EG, Liu H, Kit LC, Baird S, Nesrallah M. 2001. Pattern of

mutation in the genome of influenza A virus on adaptation to

http://www.sciencedirect.com/science/journal/00426822


increased virulence in the mouse lung: identification of functional themes. Proc Natl Acad Sci USA 98: 6883-6888

Bui M, Wills EG, Helenius A, and Whittaker GR. 2000. Role of the

influenza virus M1 Protein in nuclear export of viral ribonucleoproteins. J Virol 74: 1781-1786

Bui M, Whittaker G, Helenius A.1996. Effect of M1 protein and low

pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. J Virol 70:8391-401

Bush RM, Bender CA, Subbarao K, Cox NJ, Fitch WM. 1999.

Predicting the evolution of human influenza A. Science 286: 1921-1925

Buxton BC, Katz JM, Seto WH, Chan PK, Tsanq D, Ho W, Mak

KH, Lim W, Tam JS, Clarke M, Williams SG, Mounts AW, Bresee JS, Conn LA, Rowe T, Hu-Primmer J, Abernathy RA, Lu X, Cox NJ, Fukuda K. 2000. Risk of influenza A (H5N1) infection among healt care workers exposed to patients with influenza A (H5N1) HongKong. J Infect Dis 181: 344-348

Campitelli L, Ciccozzi M, Salemi M, Taglia F, Boros S, Donatelli I,

Rezza G. 2006. H5N1 influenza virus evolution: a comparison of different epidemics in birds and humans (1997-2004). J Gen Virol 87: 955-960

Capua I, Marangon S. 2006. Control of avian influenza in poultry.

Emerg Infec Dis 12: 1-2 Cauthen AN, Swayne DE, Schultz-Cherry S, Perdue ML, Suarez

DL. 2000. Continued circulation in China of highly pathogenic avian influenza viruses encoding the hemagglutinin gene associated with the 1997 H5N1 outbreak in poultry and humans. J Virol 74: 6592-6599

CDC Control Diseases Center. 2007. Avian influenza infection in

humans. http://www.cdc.gov/ 30 Mei 2007

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Bui+M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Whittaker+G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Helenius+A%22%5BAuthor%5D

javascript:AL_get(this,%20'jour',%20'J%20Virol.');

http://www.cdc.gov/


Chan PK. 2002. Outbreak of Avian Influenza A (H5N1) Virus Infection in Hong Kong in 1997. Clin Infect Dis 34:S58-64

Chazal N, Gerlier D. 2003. Virus entry, assembly, budding, and

membrane rafts. Microbiol Mol Biol Rev 67: 226-237 Chen H, Smith GJD, Li KS, Wang J, Fan XH, Rayner JM,

Vijaykrishna D, Zhang JX, Zhang LJ, Guo CT, Cheung CL, Xu KM, Duan L, Huang K, Qin K, Leung YHC, Wu WL, Lu HR, Chen Y, Xia NS, Naipospos TSP, Yuen KY, Hassan SS, Bahri S, Nguyen TD, Webster RG, Peiris JSM, Guan Y. 2006. Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control. Proc Natl Acad Sci USA 103: 2845-2850

Chen H, Deng G, Li Z, Tian G, Li Y, Jiao P, Zhang L, Liu Z,

Webster RG, Yu K. 2004. The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China. Proc Natl Acad Sci USA 101: 10452-10457

Clavijo A, Tresnan DB, Jolie R. Zhou EM. 2002. Comparison of

embrionated chicken eggs with MDCK cell culture for the isolation of swine influenza virus. Can J Vet Res 66: 117-121

Coleman JR. 2007. The PB1-F2 protein of influenza A virus:

increasing pathogenecity by disrupting alveolar macrophages. Virology 4: 1-5

Conenello GM, Zamarin D, Perrone LA, Tumpey T, Palese P.

2007. A single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence. PLoS Pathog 3(10): e141.

Creelan JL, Graham DA, McCullough SJ. 2002. Detection and

differentiation of pathogenecity of avian paramixovirus serotype 1 from field cases using one-step reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Avian Pathol 31: 493-499


Cros JF, Garcia-sastre A, Palese P. 2005. An unconventional

NLS is critical for the nuclear import of the influenza A virus nucleoprotein and ribonucleoprotein. Traffic 6: 205-213

Cross KJ, Wharton SA, Shekel JJ, Wiley DC, Steinhauer DA.

2001. Studies on influenza hemagglutinin fusion peptide mutants generated by reverse genetics. EMBO J 20: 4432-4442

Crow M, Deng T, Addley M, Brownlee GG. 2004. Mutation

analysis of the influenza virus cRNA promoter and identification of nucleotides critical for replication. J Virol 78: 6263-6270

Cullen BR. 2000. Nuclear RNA export pathways. Mol Cell Biol 20:

4181-4187 [Depkes] Departemen Kesehatan. 2008. Data kasus flu brung di

Indonesia sampai dengan tanggal 24 Januari 2008. http://www.ppmplp.depkes.go.id/. [24 Januari 2008]

Direktorat Jenderal Peternakan dan Kesehatan Hewan. 2012.

Update Perkembangan Kasus Avian Influenza (AI) pada Unggas Kondisi s/d 30 September 2012. http://ditjennak.deptan.go.id. Diakses 21 November 2012.

Elton D, Simpson-Holley M, Archer K, Medcalf L, Hallam R,

McCauley J, Digard P. 2001. Interaction of the influenza virus nucleoprotein with the cellular CRM1-mediated nuclear export pathway. J Virol 75: 408-419

[FKH IPB] Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.

2006. Kajian karakter virus avian influenza pada unggas air sebagai dasar pengendalian penyakit Avian Influenza (AI). Laporan Akhir Penelitian Kerjasama Departemen Pertanian dan FKH IPB. Bogor: FKH IPB; 2006

http://www.ppmplp.depkes.go.id/

http://ditjennak.deptan.go.id/


Feare CJ, Yasue M. 2006. Asymptomatic infection with highly pathogenic avian influenza H5N1 in wild birds: how sound is the evidence? Virology 3: 96-100

Fechter P, Mingay L, Sharps J, Chambers A, Fodor E, Brownlee

GG. 2003. Two aromatic residues in the PB2 subunit of influenza A RNA polymerase are crucial for cap binding. J Biol Chem 278 (22): 20381–20388

Fernandez-Sesma A, Marukian S, Ebersole BJ, Kaminski D, Park MS, yuen T, Sealfon SC, Garcia-Sastre A, Moran TM. 2006. Influenza virus evades innate and adaptive immunity via the NS1 protein. J Virol 80: 6295-6304

Flory E, Kunz M, Scheller C, Jassoy C, Stauber R, Rapp UR,

Ludwig S. 2000. Influenza virus-induced NF-кB-dependent gene expression is mediated by overexpression of viral proteins and involves oxidative radicals and activation of IкB kinase. J Biol Chem 275: 8307-8314

Fouchier RAM, Munster VJ, Keawcharoen J, Osterhaus ADME,

Kuiken T. 2007. Virology of avian influenza in relation to wild birds. Journal of Wildlife Disease 43: S7-S14

Fouchier RAM, Munster V, Wallensten A, Bestebroer TM, Herfst

S, Smith D, Rimmelzwaan Olesen B, Osterhaus ADME. 2005. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol 79: 2814-2822

Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, Bovin N, Balish A, Klimov

A. 2006. Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses. Virology 344: 432-438

Garcia-Sastre A. 2006. Antiviral response in pandemic influenza

viruses. Emerg Infect Dis 12: 44-47 Garmory HS, Brown KA, Titball RW. 2003. DNA vaccines:

improving expression of antigens. Genetic Vaccines and Therapy. 1(2): 1479-86

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mingay%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12646557

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sharps%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12646557

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chambers%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12646557

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fodor%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12646557

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brownlee%20GG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12646557

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brownlee%20GG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12646557


Garoff H, Hewson R, Opstelten DE. 1998. Virus maturation by budding. Microbiol Mol Biol Rev 62: 1171-1190

Gibbs JS, Malide D, Hornung F, Bennink JR, Yewdell JW. 2003.

The Influenza A Virus PB1-F2 Protein Targets the Inner Mitochondrial Membrane via a Predicted Basic Amphipathic Helix That Disrupts Mitochondrial Function . J. Virol. 77(13): 7214-7224

Gilbert M, Chaitaweesub P, Parakamawongsa T, Premashthira S,

Tiensin T, Kalpravidh W, Wagner H, Slingenbergh J. 2006. Free-grazing ducks and highly pathogenic avian influenza, Thailand. Emerg Infect Dis 12: 56-62

Glaser L, Stevens J, Zamarin D, Wilson IA, Garcia-Sastre A,

Tumpey TM, Basler CF, Taubenberger JK, Palese P. 2005. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol 79: 11533-11536

Gomez-Puertas P, Albo C, Perez-Pastrana E, vivo A, Portela A.

2000. Influenza virus matrix protein is the major driving force in virus budding. J Virol 74: 11538-11547

Gonzales S, Ortin J. 1999. Distinct regions of influenza virus PB1

polymerase subunit recognize vRNA and cRNA templates. EMBO J 18: 3767-3775

Guan Y, Peiris M, Kong KF, Dyrting KC, Ellis TM, Sit T, Zhank LJ,

Shortridge KF. 2002. H5N1 influenza viruses isolated from geese in southeastern Cina: evidence for genetic reassortment and interspecies transmission to duck. Virology 292: 16-23

Guan Y, Poon LLM, Cheung CY, Ellis TM, Lim W, Lipatov AS,

Chan KH, Sturm-Ramirez KM, Cheung CL, Leung YHC, Yuen KY, Webster RG, Peiris JSM. 2004. H5N1 influenza: A protean pandemic threat. Proc Natl Acad Sci USA 101: 8156-8161

http://jvi.asm.org/search?author1=James+S.+Gibbs&sortspec=date&submit=Submit

http://jvi.asm.org/search?author1=Daniela+Malide&sortspec=date&submit=Submit

http://jvi.asm.org/search?author1=Felicita+Hornung&sortspec=date&submit=Submit

http://jvi.asm.org/search?author1=Jack+R.+Bennink&sortspec=date&submit=Submit

http://jvi.asm.org/search?author1=Jonathan+W.+Yewdell&sortspec=date&submit=Submit


Guan Y, Shortridge KF, Krauss S, Webster RG.1999. Molecular characterization of H9N2 influenza viruses: Were they the donors of the "internal" genes of H5N1 viruses in Hong Kong? J Virol 96: 9363-9367

Guo CT, Takahashi N, Yagi H, Kato K, Takahashi T, Yi SQ, Chen

Y, Ito T, Otsuki K, Kida H, Kawaoka Y, Hidari KIPJ, Miyamoto D, Suzuki T, Suzuki Y. 2007. The quail and chicken intestine have sialyl-galactose sugar chains responsible for the binding of influenza A viruses to human type receptors. Glycobiology 17: 713-724

Hale BG, Jackson D, Chen YH, Lamb RA, Randall RE. 2006. Influenza A virus NS1 protein binds p85β and activates phosphatiylinositol-3-kinase signaling. Proc Natl Acad Sci USA 103: 14194-14199

Hanson BA, Stallknecht DE, Swayne DE, Lewis LA, Senne DA.

2003. Avian influenza in Minnesota ducks during 1998-2000. Avian Dis 47: 867-871

Hara K, Schmidt FI, Crow M, Brownlee GG. 2006. Amino acid

residues in the N-terminal region of the PA subunit of influenza A virus RNA polymerase play a critical role in protein stability, endonuclease activity, cap binding and virion RNA promoter binding. J Virol 80: 7789-7798

Harris A, Cardone G, Winkler DC, Heymann JB, Brecher M, White

JM, Steven A. 2006. Influenza virus pleiomorphy characterizad by cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci USA 103: 19123-19127

Harvey R, Martin ACR, Zambon M, Barclay WS. 2004. Restriction

to the adaptation of influenza A virus H5 hemagglutinin to the human host. J Virol 78: 502-507

Hatta M, Gao P, Halfmann P & Kawaoka Y. 2001. Molecular basis

for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses. Science 293: 1840–1842.


Hayden FG. 2006. Antiviral resistance in influenza viruses-implications for management and pandemic response. N Engl J Med 354: 785-788

Hoffmann E, Lipatov AS, Webby RJ, Govorkova AE, Webster RG.

2005. Role of Specific hemagglutinin amino acids in the immunogenicity and protection of H5N1 Influenza virus vaccines. Proc Natl Acad Sci USA 102: 12915-12920

Hoffmann E, Stech J, Guan Y, Webster RG, Perez DR. 2001.

Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. Arch Virol 146: 2275-2289

Honda A, Mizumoto K, Ishihama A. 2002. Minimum molecular

architectures for transcription and replication of the influenza virus. Proc Natl Acad Sci USA 99: 13166-13171

Honda A, Mizumoto K, Ishihama A. 1999. Two separate

sequences of PB2 subunit constitute the RNA cap-binding site of influenza virus RNA polymerase. Genes Cells. 4: 475-485.

Horimoto T, Kawaoka Y. 2005. Influenza: Lessons from past

pandemics, warnings from current incidents. Nature Rev 3: 591-598

Horimoto T, Kawaoka Y. 2001. Pandemic threat posed by avian

influenza A viruses. Clin Microbiol Rev 14: 129-149 Horimoto T, Nakayana K, Smeekens SP, Kawaoka Y. 1994.

Proprotein-processing endoproteases PC6 and furin both activate hemagglutinin of virulent avian influenza viruses. J Virol 68: 6074-6078

Hulse DJ, Webster RG, Russell RJ, Perez DR. 2004. Molecular

determinants within the surface proteins involved in the pathogenicity of H5N1 influenza viruses in chickens. J Virol 78: 9954-9964


Hulse-Post DJ, Sturm-Ramirez KM, Humberd J, Seiler P, Govorkova EA, Krauss S, Scholtissek C, Puthavathana P, Buranathai C, Nguyen TD, Long HT, Naipospos TSP, Chen H, Ellis TM, Guan Y, Peiris JSM, Webster RG.. 2005. Role of domestic ducks in the propagation and biological evolution of highly pathogenic H5N1 influenza viruses in Asia. Proc Natl Acad Sci USA 102: 10682-10687

Ibrecevich A, Pekosz A, Walter MJ, Newby C, Battaile JT, Brown

EG, Holtzman MJ, Brody SL. 2006. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol 80: 7469-7480

[ICTV] International Commite on Taxonomy of Viruses. 2006.

http://www.ncbi.nlm.nih. /ICTVdb/ . [14 April 2006].

Ilyushina NA, Bovin NV & Webster RG. 2012. Decreased

neuraminidase activity is important for the adaptation of H5N1 influenza virus to human airway epithelium. J Virol 86(9):4724-33

Ilyushina NA, Seiler JP, Rehg JE, Webster RG, Govorkova EA.

2010. Effect of Neuraminidase Inhibitor–Resistant Mutations on Pathogenicity of Clade 2.2 A/Turkey/15/06 (H5N1) Influenza Virus in Ferrets. PLoS Pathog 6(5): e1000933

Ito T, Couceiro JNSS, Kelm S, Baum LG, Krauss S, Castrucci

MR, Donatelli I, Kida H, Paulson JC, Webster RG, Kawaoka Y. 1998. Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential. J Virol 72: 7367-7373

Ito T, Suzuki Y, Takada A, Kawamoto A, Otsuki K, Masuda H,

Yamada M, Suzuki T, Kida H, Kawaoka Y. 1997. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chiken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol 71: 3357-3362

http://jvi.asm.org/search?author1=Natalia+A.+Ilyushina&sortspec=date&submit=Submit

http://jvi.asm.org/search?author1=Nicolai+V.+Bovin&sortspec=date&submit=Submit

http://jvi.asm.org/search?author1=Robert+G.+Webster&sortspec=date&submit=Submit


Jia D, Rahbar R, Chan RWY, Lee SMY, Chan MCW, Wang BX,

Baker DP, Sun B, Peiris JSM, Nicholls JM, Fish EN. 2010.

Influenza Virus Non-Structural Protein 1 (NS1) Disrupts

Interferon Signaling. Plos.One 5(11): e13927

Jin H, Lesser GP, Lamb RA. 1994. The influenza virus

hemagglutinin cytoplasmic tail is not essential for virus assembly or infectivity. EMBO J 13: 5504-5515

Jin H, Lesser G, Lamb RA. 1997. Influenza virus hemagglutinin

and neuraminidase cytoplasmic tails control particle shape. EMBO J 16: 1236-1247

Jong de JC, Beyer WE, Palache AM, Rimmelzwaan GF,

Osterhaus AD. 2000. Mismatch between the 1997/1998 influenza vaccine and the major epidemic A (H3N2) virus strain as the cause of an inadequate vaccine-induced antibody response to this strain in the elderly. J Med Virol 61: 94-99

Jong de MD, Tran TT, Truong HK, Vo MH, Smith GJ, Nguyen VC,

Bach VC, Phan TQ, Do QH, Guan Y, Peiris JS, Tran TH, Farrar J. 2005. Oseltamivir resistance during treatment of influenza A (H5N1) infection. N Eng J Med 353 (25): 2667-72

Jung TE, George G. Brownlee GG. 2006. A new promoter-binding

site in the PB1 subunit of the influenza A virus polymerase. J Gen Virol 87(3): 679-688

Kalthoff D, Globig A, Beer M. 2010. (Highly pathogenic) avian

influenza as a zoonotic agent. Veterinary Microbiology 140 : 237–245

Kandun I N, Wibisono H, Sedyaningsih ER, Yusharmen,

Hadisoedarsuno W, Purba W, Santoso H, Septiawati C, Tresnaningsih E, Heriyanto B, Yuwono D, Harun S, Soeroso S, Giriputra S, Blair PJ, Jeremijenko A, Kosasih H, Putnam

http://vir.sgmjournals.org/search?author1=Tanis+E.+Jung&sortspec=date&submit=Submit

http://vir.sgmjournals.org/search?author1=George+G.+Brownlee&sortspec=date&submit=Submit

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378113509003940



http://www.sciencedirect.com/science/journal/03781135


SD, Samaan G, Silitonga M, Chan KH, Poon LLM, Lim W, Klimov A, Lindstrom S, Guan Y, Donis R, Katz J, Cox N, Peiris M, Uyeki TM. 2006. Three Indonesian clusters of H5N1 virus infection in 2005. N Engl J Med 355: 2186-2194

Kanegae Y, Sugita S, Endo A, Ishida M, Senya S, Osaka K,

Nerome K. & Oya A. 1990. Evolutionary pattern of the haemagglutinin gene of in¯uenza B viruses isolated in Japan : cocirculating lineages in the same epidemic season. J Virol 64: 2860-2865

Keawcharoen J, Amonsin A, Oraveerakul K, Wattanodorn S,

Papravasit T, Karnda S, Lekakul K, Pattanarangsan R, Noppornpanth S, Fouchier RA, Osterhaus AD, Payungporn S, Theamboonlers A, Poovorawan Y. 2005. Characterization of the hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand. Acta Virol. 49(4):277-80

Khawaja JZ, Naeem K, Ahmed Z, Ahmad S. 2005. Surveillance of

avian influenza Viruses in wild birds in areas adjacent to epicenter of an out break in Federal Capital Territory of Pakistan. Int J Poultry Sci 4: 39-43

Kim JA, Ryu SY, Seo SH. 2005. Cells in the respiratory and intestinal tracts of chicken have different proportions of both human and avian influenza virus receptors. J Microbiol 43: 366-369

Kilpatrick AM, Chmura AA, Gibbons DW, Fleischer RC, Marra PP,

Daszak P. 2006. Predicting the global spread of H5N1 avian influenza. Proc Natl Acad Sci USA 103: 19368-19373

Kishida N, Sakoda Y, Isoda N, Matsuda K, Eto M, Sunaga Y,

Umemura T, Kida H. 2005. Pathogenicity of H5 influenza viruses for ducks. Arch Virol. 150:1383-1392.

Klumpp K, Ruigrok RW, Baudin F. 1997. Roles of the influenza

virus polymerase and nucleoprotein in forming a functinal RNP structure. EMBO J 16: 1246-1257

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Keawcharoen%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Amonsin%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Oraveerakul%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wattanodorn%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Papravasit%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Karnda%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lekakul%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pattanarangsan%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Noppornpanth%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fouchier%20RA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Osterhaus%20AD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Payungporn%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Payungporn%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Theamboonlers%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Poovorawan%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16402685

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Kishida+N%22%5BAuthor%5D

javascript:AL_get(this,%20'jour',%20'Arch%20Virol.');


Kobasa D, Wells K, Kawaoka Y. 2001. Amino acids responsible for the absolute sialidase activity of the influenza A virus neuraminidase: relationship to growth in the duck intestine. J Virol 75: 11773-11780

Kuiken T, Holmes EC, McCauley J, Rimmelzwaan GF. Williams

CS, Grenfell BT. 2006. Host species barriers to influenza virus infections. Science 312: 394-397

Kumar S, Tamura K, Nei M. 2004. MEGA 3: Integrated software

for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics 5: 150-163

Lamb R. 1989. Genes and Protein of The Influenza Viruses. In :

The Influenza Viruses. Krug RM New York. Plenum Press 1-67.

Lamb RA & RM Krug. 2001. Orthomyxoviridae: the viruses and

their replication. In: Fields Virology. Knipe DM & PM Howley (Eds). Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins

Lavner Y, Kotlar D. 2005. Codon bias is a factor in regulating

expression via translation efficiency in the human genome. Tel-Hai Academic College. http://www.iscb.org/ismb/ [27 Mei 2006]

Lee MS, Chang PC, Shien JH, Cheng MC, Shieh HK. 2001.

Identification and subtyping of avian influenza viruses by reverse trascription-PCR. J Virol Methods 97: 13-27

Lee DCW, Cheung CY, Law AHY, Mok CKP, Peiris M, Lau ASY.

2005. p38 mitogen-activated protein kinase-dependent hyperinduction of TNFα expression inresponse to avian influenza virus H5N1. J Virol 79: 10147-10154

Leung FC. 2007. Avian H5N1 is still an animal virus. Di dalam:

Zhou J & Yan H, editor. The 15th World Veterinary Poultry Congress Abstract Book. Beijing 11-14 September 2007: 42-52

http://www.iscb.org/ismb/


Li J, Li Y, Hu Y, Chang G, Sun W, Yang Y. 2011. PB1-mediated virulence attenuation of H5N1 influenza virus in mice is associated with PB2. J Gen Virol 92: 1435–1444

Li KS, Y. Guan, J.Wang, GJ. Smith, KM. Xu, L. Duan, AP.

Rahardjo, P. Puthavathana, C. Buranathai, TD. Nguyen, AT. Estoepangestie, A. Chaisingh, P. Auewarakul, HT.Long, NT.Hanh, RJ. Webby, LL. Poon, H. Chen, KF.Shortridge, KY.Yuen, RG.Webster, JS. Peiris. 2004. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature 430:209-213

Li KS, Xu KM, Peiris JSM, Poon LLM, Yu KZ, Yuen KY,

Shortridge KF, Webster RG, Guan Y. 2003. Characterization of H9 subtype influenza viruses from the ducks of Southern China: a candidat for the next influenza pandemic in humans? J Virol 77: 6988-6994

Li Z, H. Chen, P. Jiao, G. Deng, G. Tian, Y. Li, R. Hoffmann, RG.

Webster, Y. Matsuoka, dan K. Yu. 2005. Molecular basis of replication of duck H5N1 influenza viruses in a mammalian mouse model. J Virol 79: 12058-12064

Li Z, Jiang Y, Jiao P, Wang A, Zhao F, Tian G, Wang X, Yu K, Bu

Z, Chen H. 2006. The NS1 Gene Contributes to the Virulence of H5N1 Avian Influenza Viruses. J. Virol 22 : 11115 – 11123

Li ML, Rao P, and Krug RM. 2001. The active sites of the

influenza cap-dependent endonuclease are on different polymerase subunits. EMBO J. 20(8): 2078–2086

Lindstrom SE, Hiromoto Y, Nishimura H, Saito T, Nerome R &

Nerome K. 1999. Comparative analysis of evolutionary mechanisms of the hemagglutinin and three internal protein genes of in¯uenza B virus : multiple cocirculating lineages and frequent reassortment of the NP, M and NS genes. J Virology 73: 4413-4426.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Li+KS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Guan+Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Wang+J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Smith+GJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Xu+KM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Duan+L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Rahardjo+AP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Puthavathana+P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Buranathai+C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Nguyen+TD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Estoepangestie+AT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Chaisingh+A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Auewarakul+P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Long+HT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Hanh+NT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Webby+RJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Poon+LL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Chen+H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Shortridge+KF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Yuen+KY%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Webster+RG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Peiris+JS%22%5BAuthor%5D

javascript:AL_get(this,%20'jour',%20'Nature.');

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=search&db=PubMed&term=%20Li%20ML%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=search&db=PubMed&term=%20Rao%20P%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=search&db=PubMed&term=%20Krug%20RM%5Bauth%5D


Lipatov AS, Andreansky S, Webby RJ, Hulse DJ, Rehg JE, Krauss S, Perez DR, Doherty PC, Webster RG, Sangster MY. 2005. Pathogenesis of Hongkong H5N1 Influenza Virus NS Gene Reassortants in Mice: The Role of Cytokines and B- and T- Cell Responses. J Gen Virol 86 : 1121-1130

Liu JP. 2005. Avian Influenza-A Pandemic Waiting to Happen?. J

Microbiol Immunol Infect. 39:4-10. Liu M, Guan Y, Peiris M, He S, Webby RJ, Perez D, Webster RG.

2003. The quest of influenza A virus for new host. Avian Dis 47: 849-856

Lu B, Zhou H, Ye D, Kemble G, Jin H. 2005. Improvement of

influenza A/Fujian/411/02 (H3N2) virus growth in embrionated chicken eggs by balancing the hemagglutinin and neuraminidase activities, using reverse genetics. J Virol 79: 6763-6771

Luo G, Chung J & Palese P. 1993. Alterations of the stalk of the

influenza virus neuraminidase: deletions and insertions. Virus Res. 29: 141-153

Maines TR, Lu XH, Erb SM, Edwards L, Guarner J, Greer PW,

Nguyen DC, Szretter KJ, Chen LM, Thawatsupha P, Chittaganpitch M, Waicharoen S, Nguyen DT, Nguyen T, Nguyen HHT, Kim JH, Hoang LT, Kang C, Phuong LS, Lim W, Zaki S, Donis RO, Cox NJ, Katz JM, Tumpey TM. 2005. Avian influenza (H5N1) viruses isolated from human in Asia 2004 exhibit increased virulence in mammals. J Virol 79: 11788-11800

Matrosovich M, Zhou N, kawaoka Y & Webster R. 1999. The

surface glycoprotein of H5 influenza viruses isolated from human, chickens and wild aquatic birds have distinguishable properties. J. Virol. 73: 1146-115

Matrosovich MN, Tuzikov A, Bovin N, Gambaryan A, Klimov A,

Castrucci MR, Donatelli I, Kawaoka Y. 2000. Early alteration of the receptor-binding properties of H1, H2 and H3 avian


influenza virus hemagglutinins after their introduction into mammals. J Virol 74: 8502-8512

Min JY, Krug RM. 2006. The primary function of RNA binding by

the influenza A virus NS1 protein in infected cells: inhibiting the 2‟-5‟ oligo (A) synthetase/RNase L pathway. Proc Natl Acad Sci USA 103: 7100-7105

Mishin VP, Novikov D, Hayden FG, Gubareva LV. 2005. Effect of

hemagglutinin glycosylation on influenza virus susceptibility to neuraminidase inhibitors. J Virol 79: 12416-12424

Moscona A. 2005a. Neuraminidase inhibitors for Influenza. N Eng

J Med 353: 1363-1373 Moscona A. 2005b. Oseltamifir Resistance-Disabling Our

Influenza Defense. N Eng J Med 353: 25 Munch M, Nielsen LP, Handberg KJ, Jorgensen PH. 2001.

Detection and subtyping (H5 and H7) of avian type A influenza virus by reverse transcription-PCR and PCR-ELISA. Arch Virol 146: 87-97

Murakami M, Takae T, Masanoku O, Mayumi S, Miyoko A, Yuushi

O, Parry MAA, Kido H. 2001. Mini-plasmin found in the epithelial cells of bronchioles triggers infection by broad-spectrum influenza A viruses and Sendai virus. Eur J Biochem 268: 2847-2855

Murphy BR & Webster R. 1996. Orthomyxoviruses. In

FieldsVirology. 3rd ed. Edited by BN Fields, DM Knipe & PM Howley. Philadelphia : Lippincott-Raven.

Nakajima K, Nobusawa E, Tonegawa K, Nakajima S. 2003. Restriction of amino acid change in influenza A virus H3HA: comparison of amino acid changes observed in nature and in vitro. J Virol 77: 10088-10098

Nerome R, Hiromoto Y, Sugita S, Tanabe N, Ishida M, Matsumoto

M, Lindstrom SE, Takahashi T & Nerome K. 1998. Evolutionary characteristics of influenza B virus since its first


isolation in 1940: dynamic circulation of deletion and insertion mechanism. Arch Virol 143: 1569-1583.

Neumann G, Hughes MT, Kawaoka Y. 2000. Influenza A virus

NS2 protein mediates vRNP nuclear export through NES-independent interaction with hCRM1. EMBO J 19: 6751-6758

Nga NTB, Van LTH & Hoa LT. 2011. Characterization of the

neuraminidase (NA) polypeptide of the avian influenza virus A/H5N1 strains in poultry collected during 2004 - 2009 in Vietnam. J Biotechnol 9(1): 47-54

OIE Office international des Epizooties. 2004. Manual of diagnostic test and vaccines for terrestrial animal. Avian

Influenza. 5th Edition. http://www.oie.int/ 21 Oktober 2006

OIE Office international des Epizooties. 2005. Update on avian influenza viruses, including highly pathogenic H5N1 from poultry in live bird market in Hanoi, Vietnam in 2001. J Virol 79: 4201-4212

Olsen B, Munster VJ, Wallensten A, Waldenstrom J, Osterhaus

ADME, Fouchier RAM. 2006. Global patterns of influenza A virus in wild birds. Science 312: 384-388

Ozawa M, Fujii K, Muramoto Y, Yamada S, Yamayoshi S, Takada

A, Goto H, Horimoto T, Kawaoka Y. 2007. Contributions of two nuclear localization signals of influenza A virus nucleoprotein to viral replication. J Virol 81:30-41

Payungporn S, Phakdeewirot P, Chutinimitkul S, Theamboonlers

A, Keawcharoen J, Oraveerakul K, Amonsin A, Poovororawan Y. 2004. Single-step multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for influenza A virus subtype H5N1 detection. Viral Immunol 17: 588-593

Peiris JS, Yu WC, Leung CW, Cheung CY, Ng NF, Nicholls JM,

Ng TK, Chan KH, Lai ST, Lim WL, Yuen YY, Guan Y. 2004.

http://www.oie.int/


Re-Emergence of Fatal Human Influenza A Subtype H5N1 Disease. Lancet 363:617-619.

Pena L, Vincent AL, Loving CL, Henningson JN, Lager KM, Li W,

Perez DR. 2012. Strain-dependent Effects of PB1-F2 of Triple Reassortant H3N2 Influenza Viruses in Swine. J Gen Virol

Perez DR, lim W, Seiler JP, Yi G, Peiris M, Shortridge KF,

Webster RG. 2003. Role of quail in the interspecies transmission of H9 influenza A viruses: molecular changes on HA that correspond to adaptation from ducks to chickens. J. Virol. 77: 3148-3156

Pinto LH, Holsinger LJ, Lamb RA. 1992. Influenza virus M2

protein has ion channel activity. Cell 69:517-28. Plotkin JB, Dushoff J. 2003. Codon bias and frequency-

dependent selection on the hemagglutinin epitopes of influenza A virus. Proc Natl Acad Sci USA 100: 7152-7157

Plotkin JB, Dushoff J, Levin SA. 2002. Hemagglutinin sequence

clusters and the antigenic evolution of influenza A virus. Proc Natl Adac Sci USA 99: 6263-6268

Portela A, Digard P. 2002. The influenza virus nucleoprotein: a

multifunctional RNA-binding protein pivotal to virus replication. J Gen Virol 83: 723-734

Quinlivan M, Zamarin D, Garcia-Sastre A, Cullinane A, Chambers

T & Palese P. 2005. Attenuation of Equinine Influenza Viruses through Truncations of the NS1 Protein. J. Virol. 79 : 8431 – 8439.

Rajakumar A, Swierkosz EM, Schulze IT. 1990. Sequence of an

influenza virus hemagglutinin determined directly from a clinical sample. Proc Natl Acad Sci USA 87: 4154-4158

http://vir.sgmjournals.org/search?author1=Lindomar+Pena&sortspec=date&submit=Submit

http://vir.sgmjournals.org/search?author1=Amy+L.+Vincent&sortspec=date&submit=Submit

http://vir.sgmjournals.org/search?author1=Crystal+L.+Loving&sortspec=date&submit=Submit

http://vir.sgmjournals.org/search?author1=Jamie+N.+Henningson&sortspec=date&submit=Submit

http://vir.sgmjournals.org/search?author1=Kelly+M.+Lager&sortspec=date&submit=Submit

http://vir.sgmjournals.org/search?author1=Weizhong+Li&sortspec=date&submit=Submit

http://vir.sgmjournals.org/search?author1=Daniel+R.+Perez&sortspec=date&submit=Submit

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Pinto+LH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Holsinger+LJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Lamb+RA%22%5BAuthor%5D

javascript:AL_get(this,%20'jour',%20'Cell.');


Rao P, Yuan W, Krug RM. 2003. Crucial role of CA cleavage sites

in the cap-snatching mechanism for initiating viral mRNA synthesis. EMBO J 22: 1188-1198

Reina J, Fernandez-Baca V, Blanco I, Munar M. 1997.

Comparison of Madin-Darby Kidney Cells (MDCK) with a Green Monkey Continuous Cell Line (Vero) and Human Lung Embryonated Cells (MRC-5) in isolation of influenza A virus fron nasopharyngeal aspirates by shell vial culture. J Clin Microbiol 35: 1900-1901

Roberts PC, Compans RW. 1998. Host cell dependence of viral

morphology. Proc Natl Acad Sci USA 95: 5746-5751 Rota PA, Wallis TR, Harmon MW, Rota JS, Kendal AP & Nerome

K. 1990. Cocirculation of two distinct evolutionary lineages of in¯uenza type B virus since 1983. Virology 175: 59-68.

Rota PA, Hemphill ML, Whistler T, Regnery HL. & Kendal A P.

1992. Antigenic and genetic characterization of the haemagglutinins of recent cocirculating strains of in¯uenza B virus. J Gen Virol 73: 2737-2742.

Rowe T, Cho DS, Bright RA, Zitzow LA, Katz JM. 2003.

Neurological manifestations of avian influenza viruses in mammals. Avian Dis 47:1122-1126.

Ruigrok RWH, Barge A, Durrer P, Brunner J, Ma K, Whittaker GR.

2000. Membrane interaction of influenza virus M1 protein. Virology 267: 289-298

Russell CJ & Webster RG. 2005. The genesis of a pandemic

influenza virus. Cell 123:368-371 Sandri-Goldin RM. 2004. Viral regulation of mRNA export. J Virol

78: 4389-4396 Satterly N, Tsai PL, van Deursen J, Nussenzveig DR, Wang Y,

Faria PA, Levay A, Levy DE, Fontoura BMA. 2007.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Rowe+T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Cho+DS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Bright+RA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Zitzow+LA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Katz+JM%22%5BAuthor%5D

javascript:AL_get(this,%20'jour',%20'Avian%20Dis.');

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=IssueURL&_tockey=%23TOC%237051%232005%23998769996%23609814%23FLA%23&_auth=y&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=5cb07fe68d45baf7a210f970e88f83ea


Influenza virus targets the mRNA export machinery and the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA 104: 1853-1858

Scannon PJ. 2006. Pharmaceutical preparedness for a pandemic:

H5N1 may be the first real test of rapid pharmaceutical response to a pandemic. Bridge 36: 10-16

Schmolke M, Manicassamy B, Pena L, Sutton T, Hai R, Varga ZT,

Hale BG, Steel J, Pérez DR, García-Sastre A. 2011.

Differential Contribution of PB1-F2 to the Virulence of Highly

Pathogenic H5N1 Influenza A Virus in Mammalian and

Avian Species. PLoS Pathog 7(8): e1002186.

Sedyaningsih ER, Isfandari S, Setiawaty V, Rifati L, Harun S,

Purba W, Imari S, Giriputra S, Blair PJ, Putnam SD, Uyoki TM, Soendoro T. 2007. Epidemiology of cases of H5N1 virus infection in Indonesia, July 2005-June 2006. J Infect Dis 196: 522-527

Seo SH, Hoffmann E, Webster RG. 2002. Lethal H5N1 influenza

viruses escape host anti-viral cytokine responses. Nat Med 8: 950–954

Seo SH, Hoffmann E, Webster RG. 2004. The NS1 Gene of

H5N1Influenza Viruses Circumvents the Host Anti-Viral Cytokines Responses. Virus Res 103 : 107 – 113

Shih ACC, Hsiau TC, Ho MS, Li WH. 2007. Simultaneous amino

acid substitutions at antigenic site drive influenza A hemagglutinin evolution. Proc Natl Acad Sci USA 104: 6283-6288

Shortridge KF. 1997. Poultry ang the influenza H5N1 outbreak in

Hong Kong, 1997: abridged chronology and virus isolation. Vaccine 17: 826-829

Shinya K, S.Hamm, M. Hatta, H. Ito, T.Ito, Y. Kawaoka. 2004.

PB2 amino acid at position 627 affects replicative efficiency,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Shinya+K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Hamm+S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Hatta+M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Ito+H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Ito+T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&itool=PubMed_Abstract&term=%22Kawaoka+Y%22%5BAuthor%5D


but not cell tropism, of Hong Kong H5N1 influenza A viruses in mice. Virology 320:258-266

Salomon R, Franks J, Govorkova EA, Ilyushina NA, Yen HL, Hulse-Post D J, Humberd J, Trichet M, Rehg JE & other authors. 2006. The polymerase complex genes contribute to the high virulence of the human H5N1 influenza virus isolate A/Vietnam/1203/04. J Exp Med 203: 689–697.

Solorzano A, Webby RJ, Lager KM, Janke BH, Garcia-Sastre A,

Richt JA. 2005. Mutation in the NS1 protein of swine influenza virus impair anti-interferon activity and confer attenuation in pigs. J Virol 79: 7535-7543

Songserm T, Jam-on R, Sae-Heng N, Meemak N, Hulse-Post DJ,

Sturm-Ramirez KM, Webster RG. 2006. Domestic ducks and H5N1 influenza epidemic, Thailand. Emerg Infec Dis 12: 575-581

Smith GDJ, Lapedes AS, Jong JC de, Bastebroer TM,

Rimmelzwaan GF, Osterhaus ADME, Fouchier RAM. 2004. Mapping the antigenic and genetic evolution of influenza virus. Science 305: 371-375

Smith GDJ, Naipospos TSP, Nguyen TD, Jong MD je, Vijaikrishna

D, Usman TB, Hassan SS, Nguyen TV, Dao TV, Bui NA, Leung YILC, Cheung CL, Rayner JM, Zhang JX, Zhang LJ, Poon LLM, Li KS, Nguyen VC, Hien TT, Farrar J, Webster RG, Chen H, Peiris JSM, Guan Y. 2006. Evolution and adaptation of H5N1 influenza virus in avian and human hosts in Indonesia and Vietnam. Virology 350: 258-268

Steel J, Lowen AC, Mubareka S & Palese P. 2009. Transmission

of Influenza Virus in a Mammalian Host Is Increased by PB2

Amino Acids 627K or 627E/701N. PLoS Pathog 5(1):

e1000252

Steinhaueur DA. 1999. Role of hemagglutinin cleavage for the

pathogenicity of influenza virus. Virology 258: 1-20

javascript:AL_get(this,%20'jour',%20'Virology.');

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=search&db=PubMed&term=%20Steel%20J%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=search&db=PubMed&term=%20Lowen%20AC%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=search&db=PubMed&term=%20Mubareka%20S%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=search&db=PubMed&term=%20Palese%20P%5Bauth%5D


Stevens J, Blixt O, Tumpey TM, Taubenberger JK, Paulson JC,

Wilson IA. 2006. Structure and receptor specificity of the hemagglutinin from an H5N1 influenza virus. Science 312: 404-410

Sturm-Ramirez KM, Ellis T, Bousfield B, Bissett L, Dyrting K,

Rehg JE, Poon L, Guan Y, Peiris M, Webster RG. 2004. Reemerging H5N1 influenza viruses in Hong Kong in 2002 are highly pathogenic to ducks. J Virol 78: 4892-4901

Sturm-Ramirez KM, Hulse-Post DJ, Govorkova EA, Humberd J,

Seiler P, Puthuvanthana P, Burunathai C, Nguyen TD, Chaisingh A, Long HT, Naipospos TSP, Chen H, Ellis TM, Guan Y, Peiris JSM, Webster RG. 2005. Are ducks contributing to the endemicity of highly pathogenic H5N1 influenza virus in Asia? J Virol 79: 11269-11279

Stray SJ, Cummings RD, Air GM. 2000. Influenza virus infection

of desialylated cells. Glycobiology 10: 649-658 Susanti R. 2009. Pertumbuhan dan distribusi virus AI subtipe

H5N1 isolat unggas air pada Telur ayam berembrio. Laporan penelitian. Universitas Negeri Semarang

Susanti R. 2012a. Karakterisasi molekuler virus avian influenza

subtipe H5N1 asal manusia dan hewan di Indonesia. Laporan Penelitian. Semarang: Universitas Negeri Semarang

Susanti R. 2012b. Karakterisasi molekuler gen NA virus avian

influenza subtipe H5N1 di Indonesia. Prosiding Seminar Nasional MIPA. Semarang: 15 Desember 2012

Susanti R, Soejoedono RD, Mahardika IGNK, Wibawan IWT &

Suhartono MT. 2008a. Analisis molekuler gen penyandi hemaglutinin virus highly pathogenic avian influenza subtipe H5N1 isolat unggas air. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner 13(3): 229-239



Suhartono MT. 2008b. Isolasi dan identifikasi virus avian influenza subtipe H5N1 pada unggas air sehat di peternakan skala rumah tangga di Jawa Barat. Media Kedokteran Hewan 24(3): 139-146


Suhartono MT. 2008c. Identification of pathogenecity of avian influenza virus subtype H5N1 from waterfowls base on amino acid sequence of cleavage site. Indonesian J Biotech 13 (2): 1069-1077

Susanti R, Soejoedono RD, Mahardika IGNK, Wibawan IWT & Suhartono MT. 2008d. Filogenetik dan struktur antigenik virus avian influenza subtipe H5N1 isolat unggas air. Jurnal Veteriner 9 (3): 99-106

Suzuki Y, Ito T, Suzuki T, Holland RE, Chambers TM, Kiso M,

Ishida H, Kawaoka Y. 2000. Sialic acid species as a determinant of the host range of influenza A viruses. J Virol 74: 11825-11831

Suzuki Y, Nei M. 2002. Origin and evolution of influenza virus

hemagglutinin genes. Mol Biol Evol 19: 501-509 Swayne DE. 2007. Changing face of avian influenza acology and

its control: from wild birds to poultry and back again. Di dalam: Zhou J & Yan H, editor. The 15th World Veterinary Poultry Congress Abstract Book. Beijing 11-14 September 2007: 98-104

Swayne De, Suarez DL. 2003. Biology of avian influenza

especially the change of low pathogenicity virus to high pathogenicity. Proc Latin Amarican Poultry congress. 7 Oktober 2003. http://www.ars.usda.gov/research/publications/publications.html/ [23 Maret 2006]

Szecsi J, Boson B, Johnsson P, Dupeyrot-Lucas P, Matrosovich

M, Klenk H-D, Klatzmann D, Volchkov V, Cosset F-L. 2006.

http://www.ars.usda.gov/research/publications/publications.html/

http://www.ars.usda.gov/research/publications/publications.html/


Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface protein from highy pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology 3: 1-7

Talon J, Horvath CM, Polley R, Basler CF, Muster T, Palese P,

Garcia-Sastre A. 2000. Activation of interferon regulatory factor 3 is inhibited by the influenza A Virus NS1 protein. J Virol 74: 7989-7996

Taubenberger JK, Reid AH, Lourens RM, Wang R, Jin G, Fanning

TG. 2005. Characterization of the 1918 influenza virus polymerase genes. Nature 437: 889-893

Terregino C, Toffan A, Beato MS, De Nardi R, Drago A, Capua I.

2007. Conventional H5N9 vaccine supresses shedding in specific-pathogen-free birds challenged with HPAI H5N1 A/Chicken/Yamaguchi/7/2004. Avian Dis 51: 495-497

The Writing Committee of the World Health Organization (WHO)

Consultation of Human Inflenza A/H5. 2005. Avian influenza A (H5N1) infection in humans. N Engl J Med 353: 1374-1384

Thomas PG, Keating R, Hulse-Post DJ, Doherty PC. 2006. Cell-

mediated protection in influenza infection. Emerg Infect Dis 12: 48-53

Thompson CI, Barclay WS, Zambon MC, Pickles RJ. 2006.

Infection of human airway epithelium by human and avian strains of influenza A virus. J Virol 80: 8060-8068

Triyana SY, Asmara W, Wibawa T. 2010. Analisis Molekuler Gen

NS1 Virus Avian Influenza H5N1 yang Diisolasi dari Unggas Asal Purworejo Jawa Tengah dan Bantul Daerah Istimewa Yogyakarta. Biomedika 2(2): 81-91

Tumpey TM, Suarez DL, Perkins LEL, Senne DA, Lee J, Lee YJ,

Mo IP, Sung HW, Swayne DE. 2002. Characterization of a highly pathogenic H5N1 avian influenza A virus isolated from duck meat. J Virol 76: 6344-6355


Vines A, Wells K, Matrosovich M, Castrucci MR, Ito T, Kawaoka

Y. 1998. The role of influenza A virus hemagglutinin residues 226 and 228 in receptor specificity and host range restriction. J Virol 72: 7626-7631

Viseshakul N, Thanawongnuwech R, Amonsin A, Suradhat S,

Payungporn S, Keawchareon J, Oraveerakul K, Wongyanin P, Plitkul S, Theamboonlers A, Poovorawan Y. 2004. The Genome Sequence Analysis of H5N1 Avian Influenza A Virus Isolated from the Outbreak Amog Poultry Populations in Thailand. Virology 328 : 169-176

Voeten JT, Bestebroer TM, Nieuwkoop NJ, Fouchier AD,

Osterhaus AD, Rimmelzwaan GF. 2000. Antigenic drift in the influenza A virus (H3N2) nucleoprotein and escape from recognition by cytotoxic T lymphocytes. J Virol 74: 6800-6807

Vreede FT, Jung TE, Brownlee GG. 2004. Model suggesting that

replication of influenza virus is regulated by stabilization of replicative intermediates. J Virol 78: 9568-9572

Wagner R, Herwig A, Azzouz N, Klenk HD. 2005. Acylation-

mediated membrane anchoring of avian influenza virus hemagglutinin is essential for fusion pore formation and virus infectivity. J Virol 79: 6449-6458

Walker JA, Molloy SS, Thomas G, Sakaguchi T, Yoshida T,

Chambers TM, Kawaoka Y. 1994. Sequence specificity of furin, a proprotein-processing endoprotease for the hemagglutinin of a virulent avian influenza virus. J Virol 68: 1213-1218

Ward P, Small I, Smith J, Suter P, Dutkowski R. 2005. Oseltamivir

(Tamiflu) and its potential for use in the event of an influenza pandemic. J Antimicrob Chemother: 55

Weaver T. 2005. Avian influenza surveys in waterfowl part I: The

role of wild and domestic waterfowl in avian influenza


outbreaks in domestic poultry. NAHSS Outlook. February 2005. www.aphis.usda.gov/ [14 Juni 2005]

Webster RG. 2001. Science‟s compass: enhanced perspectives a

molecular whodunit. Science 293: 1773-1775 Webster RG, Bean WJ, Gorman OT, Chambers TM, Kawaoka Y.

1992. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol Rev 56: 152-179

Webster RG, Govorkova EA. 2006. H5N1-continuing evolution

and spread. N Engl J Med 355: 2174-2177 Webster RG, Krauss S, Hulse-Post D, Sturm-Ramirez K. 2007.

Evolution of influenza A viruses in wild birds. Journal of Wildlife Disease 43: S1-S6

Wherry EJ, Ahmed R. 2004. Memory CD8 T Cell differentiation

during viral infection. J Virol 78: 5535-5545 Whittaker GR. 2001. Intracellular trafficking of influenza virus:

Clinical implication for molecular medicine. Expert Reviews in Molecular Medicine. http://www.expertreviews. org/ [6 Desember 2006].

[WHO] World Health Organization. 2002. WHO manual on animal

influenza. Diagnosis and surveillance. http://www.who.int/. [12November 2004]

[WHO] World Health Organization. 2004. Avian influenza A

(H5N1): situation (poultry) in asia need for a long-term response, comparison with previous outbreaks. http://www.who.int/. [31 Oktober 2005]

[WHO] World Health Organization. 2005. Avian Influenza A

(H5N1) Infection in Humans. N Engl J Med. 353:1374-1385 [WHO] World Health Organization. 2005a. Recommended

laboratory tests to identify avian influenza A virus in specimens from humans. http://www.who.int/ [Juni 2005]

http://www.expertreviews/

http://www.who.int/


[WHO] World Health Organization Global Influenza Program

Surveilance Network. 2005b. Evolution of H5N1 avian influenza viruses in Asia. Emerg Infect Dis. 11:1515-1521

[WHO] World Health Organization. 2007. WHO interim protocol :

rapid operations to contain the initial emergence of pandemic influenza. http://www.who.int/ [October 2007]

[WHO] World Health Organization. 2008. Writing committee of

the second WHO consultation on clinical aspects of human infection with avian influenza A (H5N1) virus. Update on avian influenza A (H5N1) virus infection in Humans. N Eng J Med 358: 261-273

[WHO] World Health Organization. 2012. Cumulative number of

confirmed human cases of avian influenza A/(H5N1). http://www. who.int/. [24 Januari 2012]

[WHO] World Health Organization, OIE, FAO. 2005. Measures to

stop the spread of highly pathogenic bird flu as its source. http://www.ibdoc.who.int/ (12 September 2007)

Wu G, Freeland S. 2005. Quantifying unequal patterns of

synonymous codon usage. The CAI calculator. http://www.evolvingcode.net/codon/faq/CAI/ [ 10 Februari 2007]

Wu WWH, Sun YHB, Pante N. 2007. Nuclear import of influenza

A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virology 4: 49-50

Xing Z, Cardona CJ, Adams S, Sundaram NS. 2007.

Susceptibility and cytokine profiling of duck peripheral blood monocytic cells to low pathogenicity avian influenza virus H9N2. Di dalam: Zhou J & Yan H, editor. The 15th World Veterinary Poultry Congress Abstract Book. Beijing 11-14 September 2007: 132

http://www.who.int/

http://www.ibdoc.who.int/

http://www.evolvingcode.net/codon/faq/CAI/


Xu C, Hu WB, Xu K, He YX, Wang TY, Chen Z, Li TX, Liu JH,

Buchy P, Sun B. 2012. Amino acids 473V and 598P of PB1

from an avian-origin influenza A virus contribute to

polymerase activity, especially in mammalian cells. J Gen

Virol. 93:531-40

Yang Z, Nielsen R, Goldman N, Pedersen AMK. 2000. Codon-

substitution models for heterogeneous selection pressure at amino acid sites. Genetics 155: 431-449

Yuen KY, Chan PKS, Peiris JSM, Tsang DN, Que TL, Shortridge

KF, Cheung PT, To WK, Ho ET, Sung R, Cheng AF. 1998. Clinical Features and Rapid Viral Diagnosis of Human Disease Associated with Avian Influenza A H5N1 Virus. Lancet. 351:467-471.

Zamarin D, Ortigoza MB, Palese P. 2006. Influenza A virus PB1-

F2 protein contributes to viral pathogenesis in mice. J Virol 80: 7976-7983

Zhang J, Pekosz A, Lamb RA. 2000. Influenza virus assembly

and lipid raft microdomains: a role for the cytoplasmic tails of the spike glycoproteins. J Virol 71: 4634-4644

Zhang C, Yang Y, Zhou X, Liu X, Song H, He Y, Huang P. 2010.

Highly pathogenic avian influenza A virus H5N1NS1 protein induces caspase-dependent apoptosis in human alveolar basal epithelial cells. Virology J 7: 51-56

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Xu%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22090209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hu%20WB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22090209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Xu%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22090209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=He%20YX%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22090209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wang%20TY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22090209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chen%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22090209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Li%20TX%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22090209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Liu%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22090209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Buchy%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22090209

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sun%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22090209


Zhirnov OP, Ikizler MR, Wright PF. 2002. Cleavage of influenza A virus hemagglutinin in human respiratory epithelium is cell associated and sensitive to exogenous antiproteases. J Virol 76: 8682-8689

Zhou JY, Shen HG, Chen HX, Tong GZ, Liao M, Yang HC, Liu

JX. 2006. Characterization of a highly pathogenic H5N1 influenza virus derived from bar-headed geese in China. J Gen Virol 87: 1823-1833

Zhou NN, Shortridge KF, Claas ECJ, Krauss SL, and Webster

RG. 1999. Rapid evolution of H5N1 influenza viruses in chickens in Hong Kong. J Virol 73: 3366-3374


GLOSARIUM

Aglutinasi : Peristiwa penggumpalan suatu sel/protein. Aglutinin adalah senyawa yang menyebabkan penggumpalan sel/protein. Contohnya adalah penggumpalan sel darah merah oleh hemaglitinin dari glikoprotein virus influenza

Alignment : pensejajaran atau penjejeran sekuens DNA, RNA, atau protein berdasarkan homologi sekuens tersebut dengan tujuan untuk mengidentifikasi sekuens yang memiliki kesamaan serta menganalisis persamaan sekuens tersebut yang nantinya dikaitkan dengan analisis fenetik, evlousi dan lain sebagainya.

Antibodi : glikoprotein yang tersusun dari protein dan dibentuk tubuh sebagai respon terhadap benda asing (antigen)

Antigenik : suatu molekul yangmampu merangsang respon imun, terutama dalam menghasilkan antibodi

Asam amino basa

: asam amino yang bersifat basa berdasarkan rantai samping yang dimiliki. Termasuk asam amino basa adalah arginin, histidin dan lisin

Avian influenza : penyakit flu pada unggas yang disebabkan oleh virus influenza

BSL (Biosafety lavel)

: tingkatan keamanan laboratorium. Setiap laboratorium memiliki tingkat keamanan pada pekerja lab sesuai tingkat penularan organisme yang ditangani di lab tersebut,

Budding : keluarnya virion-virion hasil repliklasi virus, keluar sel hospes Cairan alantois : cairan yang terdapat pada ruang alantois. Ruang alantois

adalah salah satu ruang pada perkembangan embrio ayam (dalam telur)

Clade ; Suatu kelompok taksonomi biologi atau spesies yang memiliki fitur yang berasal dari nenek moyangnya

Cleavage site : daerah pemotongan pada protein hemaglutinin. Pemotongan dilakukan pada saat virus akn masuk sel hospes, sehingga protein HA terpotong oleh enzim protease menjadi HA1 dan HA2

Dinamika molekuler

: perubahan dari waktu ke waktu dari suatu komponen terkecil/molekuler (gen, protein) suatu organisme

Endemis/endemik

: suatu keadaan dimana penyakit secara menetap berada dalam masyarakat pada suatu tempat / populasi tertentu.

Endositosis : transpor makromolekul dan materi yang sangat kecil ke dalam sel dengan cara membentuk vesikula baru dari membran plasmaproses masuknya suatu molekul/antigen ke dalam sel

Epidemik : mewabahnya penyakit dalam komunitas/daerah tertentu dalam jumlah biasa atau melebihi jumlah normal

Epidemiologi : ilmu yang mempelajari pola kesehatan dan penyakit serta fakor yang terkait di tingkat populasi


Fatalitas : tingkat kematian Fecal-oral : jalur masuknya agen penyakit melalui oral/mulut, dan sumber

penularan ke individu lain melalui feses/kotoran hewan yang terinfeksi agen penyakit

Filogenetik : studi yang membahas tentang hubungan kekerabatan antar berbagai macam organisme melalui analisis molekuler dan morfologi.

Fenotip suatu karakteristik (baik struktural, biokimiawi, fisiologis, dan perilaku) yang dapat diamati dari suatu organisme yang diatur oleh genotipe dan lingkungan serta interaksi keduanya.

Flu burung : penyakit flu pada unggas yang disebabkan oleh virus influenza.

Fragmen gen : potongan/penggalan gen. Gejala klinis : gejala yang teramati secara klinis Genom : keseluruhan material genetik pada suatu individu Genotipe : tipe gen yaitu istilah yang dipakai untuk menyatakan keadaan

genetik dari suatu individu atau sekumpulan individu (populasi.) Keadaan genetik dapat ditinjau dari suatu lokus maupun genom.

Glikoprotein : molekul yang tersusun dari protein dan karbohidrat. Komponen protein lebih dominan dibanding karbohidrat. Kalau proteoglikan, komponen karbohidrat lebih dominan dibanding protein)

Global : secara umum dan keseluruhan; secara bulat; secara garis besar, mendunia

Hemaglutinin (HA)

: Suatu glikoprotein yang bersifat mampu mengaglutinasi sel darah merah. Dimiliki oleh beberapa virus yaitu virus influenza, New Castle, rabies

Hanyutan antigenik

: Perubahan/mutasi gen dan atau protein secara alami sehingga tidak dikenal lagi oleh sistem imun/antibodi hospes

Hospes : organisme yang menunjang (tempat hidup) parasit/agen penyakit dan berakibat merugikan/tidak bagi hospes tersebut

Inokulasi : memasukkan/menumbuhkan suatu inokulum (biasanya virus/bakteri) ke medium/hospes

Introduksi : Masuknya suatu jenis hewan/ tumbuhan ke dalam satu habitat yang baru. Dalam hubungannya dengan penyakit, intruduksi berarti masuknya agen penyakit (virus/bakteri/prasit) (jenis baru) ke suatu wilayah yang sebelumnya tidak ada virus tersebut melalui transportasi manusia atau alamiah

In ovo : pertumbuhan suatu makhluk hidup dalam telur In vitro : pertumbuhan suatu makhluk hidup diluar tubuh makhluk hidup Isolasi : mengambil dan memisahkan sesuatu dari komponen lainnya.

Misalnya isolasi DNA, berarti mengambil DNA dengan cara

http://id.wikipedia.org/wiki/Organisme

http://id.wikipedia.org/wiki/Genotipe

http://id.wikipedia.org/wiki/Individu

http://id.wikipedia.org/wiki/Populasi

http://id.wikipedia.org/wiki/Lokus

http://id.wikipedia.org/wiki/Genom


memisahkannya dari komponen-komponen lain Isolat : suatu agen penyakit yang diisolasi dari daerah tertentu/hospes

tertentu dan diidentifikasi di laboratorium dengan diberi nama sesuai database di lab tersebut

Karakter fenotip : sifat yang terlihat berdasarkan fenotipnya Karakter genotip : sifat yang terlihat berdasarkan genotipnya Klaster : kumpulan, kelompok, himpunan, atau gabungan obyek

tertentu yang memiliki keserupaan atau atas dasar karakteristik tertentu.

Kloaka : lubang posterior yang berfungsi sebagai satu-satunya lubang untuk saluran pencernaan, urin, dan (umumnya) genital pada spesies hewan tertentu (burung, reptilia, dan amfibi)

Kodon : deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas kombinasi tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatuasam amino tertentu

sehingga sering disebut sebagai kodon triplet.

Konserv : stabil, tidak berubah, dipertahankan untuk tidak berubah Lompatan antigenk (antigenic shift)

: Suatu proses dimana 2 atau lebih strain/subtipe berkombinasi membentuk subtipe/strain baru

Microplate : suatu tempat untuk reaksi kimiawi berkapasitas mikro/ kecil (1 set biasanya berisi 96 sumuran)

Mixing vesel : kompartemen sel tempat bercampurnya genom-genom dari berbagai subtipe virus influenza, sehingga memungkinkan terjadinya pertukaran segmen-segmen genom

Mutasi : Suatu kondisi yang berubah dari kondisi normalnya. Biasanya selalu dihubungkan dengan bahan genetik (DNA maupun RNA), baik pada taraf urutan gen (disebut mutasi titik) maupun pada taraf kromosom.

Nukleotida : monomer penyusun RNA, DNA, dan beberapa kofaktor, seperti CoA, FAD, FMN, NAD, dan NADP. Nukleotida tersusun dari gugus basa nitrogen (purin atau pirimidin), gula ribosa/deoksiribosa, dan satu atau lebih gugus fosfat..

Neuraminidase (NA)

: Suatu glikoprotein permukaan membran virus influenza, yang struktur dan komponennya bervariasi, sehingga NA dijadikan sebagai salah satu faktor penentu subtipe virus ini.

Pandemi : wabah yang terjadi secara global di seluruh dunia, akibat kemampuan suatu agen penyakit menular dari manusia ke manusia lain

Pandemik Epidemik yang terjadi dalam daerah yang sangat luas dan mencakup populasi yang banyak di berbagai daerah/negara di dunia

Patogen atau "penyebab penderitaan", adalah agen biologisyang

http://id.wikipedia.org/wiki/Saluran_pencernaan

http://id.wikipedia.org/wiki/Saluran_urin

http://id.wikipedia.org/wiki/Saluran_genital

http://id.wikipedia.org/wiki/Spesies

http://id.wikipedia.org/wiki/Burung

http://id.wikipedia.org/wiki/Reptilia

http://id.wikipedia.org/wiki/Amfibi

http://id.wikipedia.org/wiki/Nukleotida

http://id.wikipedia.org/wiki/MRNA

http://id.wikipedia.org/wiki/Asam_amino

http://id.wikipedia.org/wiki/Asam_amino

http://id.wikipedia.org/wiki/Bahan_genetik

http://id.wikipedia.org/wiki/Bahan_genetik

http://id.wikipedia.org/wiki/DNA

http://id.wikipedia.org/wiki/RNA

http://id.wikipedia.org/wiki/Gen

http://id.wikipedia.org/wiki/Kromosom

http://id.wikipedia.org/wiki/Polimer

http://id.wikipedia.org/wiki/RNA

http://id.wikipedia.org/wiki/DNA

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kofaktor&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/wiki/Koenzim_A

http://id.wikipedia.org/wiki/Flavin_adenina_dinukleotida

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=FMN&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/wiki/Nikotinamida_adenina_dinukleotida

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Nikotinamida_adenina_dinukleotida_fosfat&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/wiki/Gugus_fungsional

http://id.wikipedia.org/wiki/Basa

http://id.wikipedia.org/wiki/Senyawa_organik

http://id.wikipedia.org/wiki/Gula

http://id.wikipedia.org/wiki/Gugus_fungsional

http://id.wikipedia.org/wiki/Fosfat

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Agen_biologis&action=edit&redlink=1


menyebabkan penyakit pada inang/hospes Patogenik : suatu sifat dari suatu agen penyakit (bakteri, virus, parasit)

yang menimbulkan kerusakan (patogen) Patogenesitas : daya /kemampuan suatu agent penyakit untuk menghasilkan

penyakit dengan gejala klinik yang jelas. merusak atau menimbulkan penyakit pada hospes

Patogen intraseluler

: Patogen yang hidupnya di dalam sel hospes

Prevalensi : jumlah keseluruhan kasus penyakit yg terjadi pd suatu waktu tertentu di suatu wilayah atau tingkat kejadian penyakit di wilayah tertentu dan pada waktu tertentu

Reasorsi : pertukaran segmen gen virus influenza subtipe tertentu dengan segmen gen subtipe virus lainnya

Replikasi : perbanyakan, penggandaan, pembelahan Reseptor : suatu molekul (biasanya) protein yang menerima sinyal kimia

dari luar sel yang mengarahkan kegiatan sel sepertimembelah atau mengizinkan molekul tertentu untuk masuk atau keluar sel. Molekul pemberi sinyal yang melekat pada suatu reseptor disebut ligan, yang dapat berupa suatu peptida atau molekul kecil lain seperti neurotransmiter, hormon, obat, atau toksin.

Reservoir : Sesuatu (orang, hewan, tanaman atau substansi) dimana agen infeksius/penyebab penyakit dapat hidup secara normal dan berkembang biak

Resistensi : (1) sistem dalam organisme yang memberikan ketahanan terhadap penyakit/hama atau (2) daya tahan suatu mikroorganisme/organisme terhadap obat/antibiotik

Respon imun : respons tubuh berupa suatu urutan kejadian yang kompleks terhadap antigen, untuk mengeliminasi antigen tersebut

Respon imun bawaan

: Respon yang dilakukan oleh sistem kekebalan tubuh bawaan/alami (sudah ada sejak mahkluk hidup tersebut lahir), seperti neutrofil, sel NK, interferon, makrofag, dll

Respon imun adaptif

: Respon yang dilakukan oleh sistem kekebalan adaptif (hanya dibentuk jika terpapar), seperti antibodi dan sel T

Sekuen : urutan Seroprevalensi : prevalensi (tingkat kejadian) berdasarkan data serologis Sporadis : penyebaran penyakit di suatu daerah yg tidak merata (hanya

di di beberapa tempat ) tidak secara bersamaan waktunya Strain : Variasi spesifik suatu hewan/organisme/tumbuhan dalam satu

spesies Subklinis : (1) secara klinis tidak menunjukkan gejala penyakit (2) tanpa

tanda-tanda atau gejala klinis, kadang-kadang digunakan untuk menggambarkan tahap awal dari suatu penyakit atau kondisi, sebelum gejala terdeteksi oleh pemeriksaan klinis

http://id.wikipedia.org/wiki/Penyakit

http://id.wikipedia.org/wiki/Molekul

http://id.wikipedia.org/wiki/Protein

http://id.wikipedia.org/wiki/Sel_(biologi)

http://id.wikipedia.org/wiki/Pembelahan_sel

http://id.wikipedia.org/wiki/Ligan_(biokimia)

http://id.wikipedia.org/wiki/Peptida

http://id.wikipedia.org/wiki/Neurotransmiter

http://id.wikipedia.org/wiki/Hormon

http://id.wikipedia.org/wiki/Obat

http://id.wikipedia.org/wiki/Toksin

http://kamuskesehatan.com/arti/gejala/


atau tes laboratorium. Substitusi sinonim

: substitusi berarti penggantian. Substitusi sinonim adalah substitusi/penggantian/perubahan pada nukleotida yang tidak menyebabkan perubahan asam amino.

Substitusi non sinonim

: substitusi pada nukleotida yang diikuti perubahan asam amino yang disandinya

TAB : telur ayam berembrio. Adalah telur ayam yang mengandung embrio (karena dibuat oleh induk ayam betina yang dibuahi oleh ayam pejantan)

Transmisi : perantara penularan suatu agen penyakit Unggas air : unggas yang habitat hidupnya di air (itik, angsa, entok, dll) Vaksin : antigen yang mengandung agen penyebab penyakit yang

dimatikan atau dilemahkan yang dimasukkan ke dalam tubuh untuk merangsang pembentukan kekebalan terhadap agen penyakit tersebut

Vaksinasi : Pemberian vaksin ke dalam tubuh seseorang untuk memberikan kekebalan terhadap penyakit tersebut

Virulensi : derajat /tingkat patogenitas suatu agen penyakit, diukur dari banyaknya organisme yang diperlukan untuk menimbulkan penyakit pada jangka waktu tertentu

Wabah : kejadian tersebarnya penyakit pada daerah yang luas dan pada banyak orang, maupun untuk menyebut penyakit yang menyebar tersebut

Zoonotik : Suatu sifat penyakit yang dapat ditularkan antara hewan dan manusia, seperti rabies, avian influenza, mad cow disease (bovine spongiform encephalopathyatau BSE).

http://id.wikipedia.org/wiki/Vaksin

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kekebalan&action=edit&redlink=1





INDEKS

AGPT ..... 51, 54, 55, 56, 57, 58, BSL ........................ 41, 42, 148, Budding ............................... 32, Daerah antigenik .... 91, 92, 94, DNA . 19, 33, 59, 60, 61, 62, 63,

66, 68, 69, 70, 74, 76, 150, Elektroforesis ................ 66, 68, Gen ... vii, 23, 32, 37, 65, 73, 87,

110, 116, 122, 126, 150, 153, GenBank ..... 65, 75, 76, 86, 89,

150, Hemaglutinin (HA) ....... 21, 87, HPAI.. iii, 14, 15, 16, 39, 40, 45,

47, 48, 50, 89, 97, 132, 133, 138, 141, 146, 151,

Kantong pengikat reseptor98, LPAI ..................................... 45, MDCK .................... 44, 45, 148, MEGA 3.1 ....... vii, 75, 76, 150, Mutasi vii, 13, 32, 33, 111, 112,

113, 118, 126, 128, 129, Neuraminidase (NA) ....... 126, Nukleoprotein ..................... 24, Pandemi .............................. 38,

PB1-F2 ... vii, ix, 21, 24, 35, 116, 117, 119, 147, 152,

PBS .................... 43, 47, 53, 57, PCR .vi, vii, ix, xi, 52, 59, 60, 61,

62, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 73, 74, 149, ,

Peptida fusi . 91, 101, 102, 103, Pertumbuhan ................ 44, 48, Primer .... vii, 29, 65, 66, 72, 73, RdRp ...... 24, 28, 29, 30, 33, 36,

116, Replikasi ........................ 24, 30, Residu pengikat reseptor ..95,

96, 151, RNA . 12, 19, 20, 21, 22, 24, 28,

30, 39, 58, 59, 60, 66, 73, 116, 122, 147, 149,

Sekuensing ................ 75, 150, Substitusi sinonim ..............33, TAB 43, 44, 45, 46, 47, 48, 148, Transmisi ...... 39, 40, 137, 141,

146, Unggas air ................. 133, 137, Wabah ......................... 14, 140,


BIOGRAFI

Penulis dilahirkan di Sragen, 23 Maret 1969 dari ayah Sukardi Indriatmoko, BA (Alm) dan ibu Sumi. Penulis merupakan putri kedua dari tiga bersaudara. Penulis menempuh pendidikan dasar sampai menengah atas di kota Sragen, berturut-tururt di SDN Bener II (Desa Bener, Kecamatan Ngrampal, Kabupaten Sragen) lulus tahun 1982, SMPN 2 Sragen lulus tahun 1985, SMAN 1 Sragen lulus tahun 1988. Selepas SMA, tahun 1988 melanjutkan studi S1 (sarjana) di Fakultas Kedokteran Hewan (FKH) UGM dan mendapatkan gelar Sarjana Kedokteran Hewan (SKH) tahun 1992. Setelah mendapatkan gelar SKH langsung melanjutkan pendidikan profesi Dokter Hewan di FKH UGM juga, lulus tahun 1994 mendapatkan gelar Dokter Hewan (Drh). Pada tahun 1998 melanjutkan stusi S2 di program studi Sains Veteriner Program Pasca Sarjana UGM, lulus tahun 2000 dan mendapatkan gelar Magister Pertanian (MP). Tahun 2004 melanjutkan studi S3 di program studi Sains Veteriner Sekolah Pasca Sarjana IPB, lulus tahun 2008 dan mendapatkan gelar Doktor (Dr). Selama pendidikan S1 sampai S3 bidang penelitian yang ditekuni adalah bidang biokimia dan biologi molekuler. Sejak tahun 1997 sampai sekarang, sebagai dosen di Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Semarang, mengampu mata kuliah Biokimia, Imunologi, Enzimologi, Parasitologi, dan Kimia Organik.

Sejak tahun 1997 sampai sekarang telah melakukan penelitian 37 judul, diantaranya adalah (1) Aktivitas fagositosis dan aktivitas bakterisidal neutrofil terhadap Staphylococcus aureus isolat sapi di Jawa Tengah dengan teknik acridine orange fluorescence (2002), (2) Aspek intoksikasi 2,3,7,8 tetracholorodibenzo-p-dioxin(TCDD) terhadap aktivitas bakterisidal intrasel leukosit polimorfonuklear tikus putih (Rattus norvegicus)(2003), (3) Analisis gen ND3 dari DNA mitokondria dalam studi keragaman genetik burung gelatik Jawa (Padda oryzivora) di Pulau Jawa (2005-2006), (4) Keragaman sekuen gen ND3 dari DNA mitokondria burung famili Ploceidae endemik Pulau Jawa (2006), (5) Stimuli pematangan dini ovarium burung puyuh dengan interaksi fotoperiode dan gonadotrophin releasing hormon (GnRH) (2007), (6) Potensi kucing sebagai reservoir virus avian influenza H5N1 dan bahaya penularannya ke manusia: kajian molekuler dan dinamika virus (2007-2008), (7) Potensi


unggas air sebagai reservoir virus highly pathogenic avian influenza (HPAI) subtipe H5N1 dan peluang penularannya pada manusia (2008-2009), (8) pengembangan model sentra peternakan rakyat terpadu anti flu burung (2009), (9) Potensi Zat gizimikro seng terhadap respon imun seluler pada demam tifoid (2009), (10) Studi Aktivitas Imunostimulan Gel Lidah Buaya (Aloe vera) pada Infeksi Salmonella typhimurium (2010), (11) Indeks Patogenesita Virus Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) Subtipe H5N1 Isolat Unggas Air (2011), (12) Penurunan Kadar Glukosa Darah Tikus Putih Hiperglikemik Akibat Pemberian Ekstrak Etanol Biji Mahoni (2012), (13) Karakterisasi molekuler virus avian influenza subtipe H5N1 asal manusia dan hewan di Indonesia (2012).

Artikel yang telah dipublikasi dalam jurnal ada 33 judul, antara lain (1) Intoksikasi 2,3,7,8 tetracholodibenzo-p-dioxin (TCDD): I. Efek terhadap gambaran darah tikus putih (Rattus norvegicus) (2001), (2) Efek 2,3,7,8 tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) terhadap respon imun neutrofil dan limfosit tikus putih (Rattus norvegicus) (2001), (3) Intoksikasi 2,3,7,8 tatrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD): II. Efek terhadap histopatologis Hati, Ginjal dan Paru tikus putih (Rattus norvegicus) (2002), (4) Efek 2,3,7,8 tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) terhadap aktivitas metabolik neutrofil tikus putih (Rattus norvegicus) (2003), (5) Aktivitas fagositosis neutrofil terhadap Staphylococcus aureus isolat sapi di Jawa tengah dengan teknik acridine orange fluorescence (2003), (6) Peranan air buah mengkudu (Morinda citrifolia L) menurunkan kadar enzim AST dan ALT serum mencit (Mus musculus) yang di-treatment CCL4 (2004), (7) Respon imun seluler terhadap intoksikasi 2,3,7,8 tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) (2004), (8) Pengujian sifat resistensi Staphylococcus aureus terhadap aktivitas bakterisidal intrasel leukosit polimorfonuklear (2004), (9) Gen hormon pertumbuhan dan gen ornitin dekarboksilase sebagai kandidat dalam marker Assisted Selection (MAS) (2004), (10) Kegagalan sistem imun mengatasi infeksi human immunodeficiency virus (HIV) (2006), (11) Potensi unggas air sebagai reservoir virus high pathogenic avian influenza subtipe H5N1(2007), (12) Stimuli pematangan dini overium burung puyuh dengan interaksi fotoperiode dan gonadotropin releasing hormon (2008), (13) Filogenetik dan struktur antigenik virus avian influenza subtipe


H5N1 isolat Unggas Air (2008),(14) Analisis molekuler gen penyandi hemaglutinin Virus Highly Pathogenic Avian Influenza Subtipe H5N1 Isolat Unggas Air (2008), (15) Analisis Molekuler Gen Penyandi Enzim NADH Dehidrogenase Subunit 3 (ND3) Burung Gelatik Jawa (Padda oryzivora)(2008), (16) Hubungan Kekerabatan Burung Gelatik Jawa (Padda oryzivora) di Pulau Jawa Berdasarkan Karakter Morfologi (2008), (17) Isolasi dan identifikasi virus avian influenza subtipe H5N1 pada unggas air di Peternakan Skala rumah tangga di Jawa Barat (2008), (18) Identification of pathogenecity of avian influenza virus subtype H5N1 from waterfowls base on amino acid sequence of cleavage site haemagglutinin protein (2008), (19) Variasi Panjang Fragmen Gen ND3 Burung Famili Ploceidae Endemik Pulau Jawa (2009),(20) Polymorphic sequence in the ND3 region of Java endemic Ploceidae birds mitochondrial DNA (2011) (21) Aktivitas reactive oxygen species makrofag akibat stimulasi gel lidah buaya pada infeksi Salmonella typhimurium (2012).

R. Susanti VIRUS A VIAN INFLUENZ MONOGRAF · DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1 Segmen genom virus...

Documents

Transcript of R. Susanti VIRUS A VIAN INFLUENZ MONOGRAF · DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1 Segmen genom virus...