585 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015

PRODUKSI MONOKLONAL ANTIBODI Vibrio harveyi

Nurhidayah, Nurbaya, dan Ince Ayu Khaerana KadriahBalai Penelitian Dan Pengembangan Budidaya Air Payau (BPPBAP)Jl. Makmur Dg. Sitakka No. 129, Maros 90512, Sulawesi Selatan

E-mail: nurhidayahjabir@gmail.com

ABSTRAK

Upaya pengendalian penyakit vibriosis untuk deteksi dini menggunakan metode imunoasai dapatdikembangkan dengan menggunakan antibodi poliklonal atau monoklonal. Penelitian ini bertujuan untukmemproduksi antibodi V.harveyi untuk deteksi penyakit Vibrio harveyi. Tahapan kegiatan yang dilakukandiawali dengan imunisasi mencit Balb/C berumur 8 minggu dengan antigen V. harveyi secara berkala intervaldua minggu. Teknik fusi sel mieloma dengan sel limposit B dari limpa mencit hiperimun V. harveyi menggunakanPolietilen Glikol (PEG 4000) menghasilkan sel hibridoma yang telah diskrining dan diseleksi untuk kloningsel. Kloning sel melalui metode limiting dilution diperoleh satu klon sel yang terpisah pada dua well. Sekresikultur sel hasil kloning menghasilkan antibodi monoklonal yang mengenali antigen V. harveyi berdasarkandari reaksi yang terbentuk setelah dilakukan uji secara ELISA dengan titer antibodi 0,384 dan 0,391, kontrolpositif 0,767 sedangkan kontrol negatif 0,049, dan kontrol substrat 0,041 pada pembacaan panjanggelombang 405 nm.

KATA KUNCI: Produksi, sel hibridoma, monoklonal, antibodi Vibrio harveyi

PENDAHULUAN

Vibriosis merupakan salah satu jenis penyakit infeksius yang sering menyerang organisme akuatikair laut seperti ikan dan udang. Penyakit ini umumnya disebabkan oleh anggota genus Vibrio (Longyantet al., 2008). Vibrio harveyi merupakan patogen dari genus Vibrio yang berasosisasi pada penyakitudang berpendar (Austin & Zhang, 2006). V. harveyi merupakan bakteri yang membutuhkan sodiumklorida untuk hidupnya, berbentuk curve-rod dan termasuk dalam kelompok bakteri gram negativeyang banyak ditemukan pada lingkungan perairan (Farmer et al., 2005) serta dapat memendarkancahaya sendiri pada kondisi tertentu. Spesies bakteri ini terdistribusi secara luas pada lingkunganakuatik dan diketahui menjadi penyebab utama penyakit kunang-kunang pada organisme laut maupunpayau. Selain sebagai penyebab utama, sering kali juga bertindak sebagai agen oportunistik padainfeksi sekunder (Saulnier et al., 2000b).

Teknik yang umum digunakan untuk mencegah penyakit dan monitoring penyakit Vibriosis adalahdiagnosa secara konvensional yaitu dengan karakteristik biokimia untuk melihat kemampuan fisiologiberbagai spesies bakteri. Namun metode biokimia tidak cukup akurat dan membutuhkan waktuyang cukup lama. Diagnosa PCR sangat sensitif untuk mendeteksi bakteri dan virus, tetapi memilikikelemahan terutama untuk aplikasi di lapangan dengan keterbatasan peralatan, bahan kimia danketerampilan, sehingga diagnosa ini sangat mahal dan sulit untuk aplikasi di lapangan (Rukpratanpornet al., 2005).

Salah satu metode imunoasai yang banyak dikembangkan yaitu enzyme-linked immunoassay (ELISA)dengan menggunakan antibodi poliklonal atau monoklonal. Penggunaan antibodi poliklonal tidakspesifik karena dapat bereaksi positif dengan senyawa yang memiliki struktur mirip sehinggamenyebabkan kesalahan dalam pengukuran dan kurang sensitif, untuk mengatasi permasalahantersebut dikembangkan teknik ELISA dengan menggunakan antibodi monoklonal.

Monoklonal antibodi diproduksi dari mencit yang telah diimunisasi dengan antigen khusus kedalam sumsum tulang akan menghasilkan sel limfosit B yang memiliki masa waktu hidup terbatasdalam kultur, hal ini dapat diatasi dengan cara menggabungkan dengan sel limfosit B tumor (myeloma)yang abadi. Hasil campuran heterogen sel hybridoma dipilih hybridoma yang memiliki 2 kemampuan

586Produksi monoklonal antibodi Vibrio harveyi (Nurhidayah)

yaitu dapat menghasilkan antibodi khusus dan dapat tumbuh di dalam kultur. Hybridoma inidiperbanyak sesuai klon individualnya dan setiap klon hanya menghasilkan satu jenis antibodimonoklonal yang permanen dan stabil. Hybridoma yang berasal dari satu limfosit akan menghasilkanantibodi yang akan mengenali satu jenis antigen (Alberts et al., 2002). Satu klon tunggal dan hanyaspesifik untuk satu epitop tunggal disebut antibodi monoklonal (Goldsby et al., 2000)

ELISA sebagai salah satu teknik imunoasai dengan menggunakan enzim yang dikonjugasikanpada antibodi atau antigen sebagai label. Untuk itu dilakukan penelitian yang bertujuan mendapatkanantibodi monoklonal V.harveyi yang dapat digunakan untuk deteksi V. harveyi secara uji ELISA.

METODE PENELITIAN

Antigen

Antigen yang digunakan untuk produksi monoklonal antibodi adalah bakteri Vibrio harveyi diisolasidari air tambak dan telah diuji secara morfologi, fisiologi, diidentifikasi secara molekular dan hasilsekuensing gen 16SRNA dengan tingkat kemiripan 98%. Stok murni bakteri di kultur dalam mediaNutrien Broth selama 4 jam dan diinaktivasi dengan 0,3%, selanjutnya disentrifius dengan kecepatan6000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC dan dicuci sebanyak tiga kali dengan larutan fisiologis(0,85%). Supernatan dibuang, endapan digunakan sebagai antigen.

Imunisasi

Imunisasi dilakukan dengan cara menyuntikkan antigen V.harveyi yang telah ditambahkan IncomplleteFreunds Adjuvan dengan perbandingan 1:1 pada mencit BALB/c secara intraperitoneal sebanyak 100µL/ekor. Penyuntikan diulang setiap 2 minggu dengan dosis yang sama. Pada penyuntikan terakhirimunisasi secara intravena pada ekor separuh dari dosis sebelumnya. Empat hari setelah penyuntikanterakhir, limpa mencit dipanen untuk difusikan dengan sel myeloma.

Persiapan Sel Mieloma

Sel mieloma ditumbuhkan pada medium kultur yang mengandung 10% FBS .Kultur sel mielomadiinkubasi pada kondisi suhu 37o C dan 5%CO2. Untuk fusi sel, dibuat suspensi dengan konsentrasi 1x 106 sel/mL.

Persiapan Sel Limfosit

Sel limfosit dari limpa mencit yang telah diimunisasi antigen V. harveyi mencit diterminasi dengancara dislokasi tulang leher dan disemprot alkohol 70%, selanjutnya dibedah secara aseptik di ruangsteril (Bio Safety Cabinet). Organ limpa diambil secara aseptik dan diletakkan pada cawan petri steril.Limpa dicuci sekali menggunakan medium RPMI. Single sel dikeluarkan menggunakan siring 1 mLdengan cara menyuntikkan medium RPMI pada organ limpa. Suspensi sel disentrifus 3 kali padakecepatan 1000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Medium dibuang dan endapan sel disuspensikankembali dengan 10 mL medium RPMI.

Produksi dan Kultur Sel Hibridoma

Produksi hibridoma dilakukan melalui fusi sel limfosit mencit yang telah diimunisasi antigen V.harveyi dengan sel mieloma. Sel limfosit B diperoleh dari limpa mencit hiperimun bakteri V. harveyi.Pembentukan sel hibridoma menggunakan teknik fusi sel limfosit dan sel mieloma denganmenggunakan PEG (Polietylen glikol) 4000. Suspensi sel limfosit dari sel spleen mencit secara aseptikdan sel mieloma masing-masing 10 mL dicampurkan, ditambahkan media RPMI hingga 40 mL dandibagi ke dalam 2 tabung. Suspensi disentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1000 rpm. Supernatandibuang dan pelet dilepaskan dari dasar tabung dengan diselentik secara perlahan-lahan dan dicuci3 kali. Fusi limfosit dengan dengan sel mieloma dilakukan dengan mencampurkan koloni sel mielomadan sel limfosit mencit, campuran sel yang difusikan disentrifius dengan kecepatan 1000 rpm selama10 menit dan supernatan dibuang. Ke dalam tabung berisi pelet sel fusan ditambahkan 2 mL larutan50% PEG dalam 15% DMSO-RPMI setetes demi setetes menggunakan pipet ukur sambil digoyang.Penambahan mulai dari tetes pertama hingga tetesan terakhir harus dilakukan dalam rentang waktu

587 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015

satu menit. Pengaruh PEG 4000 dikurangi dengan penambahan 3 mL media RPMI secara perlahanpada 1 menit pertama, 5 mL pada 1 menit kedua, 10 mL pada 1 menit ketiga dan 10–15 mL pada 1menit terakhir dan ditambahkan RPMI hingga 40 mL. Selanjutnya suspensi sel fusan disentrifusdengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit, supernatan dibuang, dan pelet dalam tabung dicuci 2kali dengan RPMI 40 mL. Sel disuspensikan kembali dengan 10 mL medium HT, didistribusikandalam mikroplat steril (96 sumur) 100 µL setiap lubang menggunakan mikro pipet. Kultur seldiinkubasi dalam inkubator pada kondisi suhu 37o C dengan aliran CO2 5%. Pada hari ke- 2 ke dalamtiap sumur ditambahkan 0,1 mL medium HAT. Setelah 6-7, sebagian medium diganti dengan mediumHAT yang segar. Pada hari ke-7 sampai dengan hari ke-21 pertumbuhan sel diamati. Jika terdapatpertumbuhan sel, pH medium akan berubah, sehingga medium yang semula berwarna merah akanberubah menjadi kuning. Setelah 3 minggu, medium HAT diganti secara bertahap dengan mediummengandung 2 % HT dan 20% feeder. Setelah sel telah tumbuh dengan baik, medium HT digantidengan media RPMI yang mengandung 10% FBS.

Skrining Sel Hibridoma

Skrining sel hibridoma yang menghasilkan antibodi berupa sekresi sel ke dalam medium dilakukanpengujian secara ELISA dengan menggunakan anti imunoglobulin yang berlabel enzim.

Kloning Sel

Sel hibridoma hasil skrining pada tes ELISA positif terhadap antigen V. harveyi dikloning dengancara pengenceran secara bertahap menggunakan metode limiting dilution menggunakan plate tissueculture 96 well untuk memperoleh klon sel tunggal yang memiliki kemampuan mensekresi antibodidan mengenal antigen V.harveyi.

ELISA Sekresi Antibodi Monoklonal Hasil Kloning

Hibridoma dari hasil kloning positif terhadap antigen V.harveyi dipelihara dan diperbanyak sampaiterbentuk koloni-koloni sel dalam kultur sel. Pengujian sekresi sel antibodi yang terbentuk dari hasilkloning menggunakan plate ELISA yang dilapisi antigen V.harveyi sebanyak 100 µL /lubang denganpengenceran 1:100 ,1:200, 1:400, 1:800, dan 1:1600. Antigen V.harveyi dilarutkan dalam bicarbonatbuffer pH 9,6 dan diinkubasi pada suhu 4oC semalam. Microwell plate 96 dicuci sebanyak 3x denganPhosfat Buffer Saline (PBSTween 20) 0,05% pH 7,2. Selanjutnya ditambahkan sekresi antibodi sebanyak100 µL/lubang tanpa pengenceran, kontrol positif dan negatif sebanyak 50 mL ke dalam sumurandan diinkubasi selama 1 jam. Setiap sampel dilakukan duplikasi. Pencucian dilakukan sebanyak 3xdan ditambahkan 50 mL HRP konjugat goat anti mouse IGg berlabel enzim ke setiap lubang microwelldengan pengenceran 1/1000 dan diinkubasi 1 jam pada suhu ruangan. Setelah dicuci 3 kali setiaplubang microwell ditambhkan 100 mL larutan subtrat 2,2-Azino-di-(3-athyl-benzthiazolinsulfonat 6)(ABTS) dan reaksi ini dibiarkan berlangsung selama 60 menit pada suhu kamar. Pembacaan nilaikerapatan optik menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 405 nm

HASIL DAN BAHASAN

Produksi dan Kultur Sel

Sel hibridoma yang dihasilkan pada penelitian ini merupakan hasil pengembangan dari fusi selmieloma dengan sel limfosit B dari limpa mencit hiperimun bakteri V. harveyi yang membawa sifatgenetik sel induknya. Sel limfosit tidak dapat bertahan hidup lama secara in vitro sedangkan selmieloma adalah sel tumor berasal dari mencit yang dapat hidup terus menerus secara in vitro. Padakondisi biakan jaringan biasa, sel limpa yang akan cepat mati sedangkan sel mieloma dapat dibiakkanuntuk itu dilakukan fusi sel untuk menghasilkan sel hibridoma yang memproduksi antibodi sepertisel limpa serta dapat dibiakkan seperti sel mieloma.

Fusi sel dilakukan dengan membuat membran sel menjadi lebih permeabel sehingga kedua selbisa menyatu. Sel-sel akan tertarik satu sama lain dan melebur dengan adanya penambahan PEG(Polietylen glikol) 4000. PEG merupakan suatu zat yang dapat menggabungkan membran sel, melaluisentrifugasi sel myeloma dan sel limpa dan akhirnya terjadi fusi (melebur). Sel yang dihasilkan dengan

588Produksi monoklonal antibodi Vibrio harveyi (Nurhidayah)

cara peleburan dua tipe sel yang berbeda tersebut menjadi satu kesatuan yang tunggal yang memilikigen dari kedua sel yang digabungkan.

Fusi sel menyebabkan penggabungan antara sel limfosit dan mieloma, namun ada pula sel limfositdan mieloma yang tidak terfusi yang bercampur dalam satu sumur. Untuk itu, dilakukan seleksi seldengan menambahkan medium HAT pada kultur sel. Pada sistem HAT sel mieloma tidak dapat bertahankarena tidak memiliki enzim hipoksantin guanin fosforibosil transferase (HGPRT) untuk bertahanhidup melalui jalur penyelamatan, sedangkan sel limfosit umumnya berumur pendek. Dengandemikian hanya se l limfosit-mieloma yang terfusi saja yang bertahan karena masih membawa sifatgenetik dari sel induknya memiliki enzim HGPRT dan menghasilkan antibodi (Harlow & Lane 1988,Zola 1987).

Hasil peleburan antara sel mieloma dengan sel limposit mencit yang telah diimunisasi denganantigen V.harveyi menghasilkan sel hybrid yang dapat ditumbuhkan pada media kultur denganmenggunakan mikroplate 96 well. Fusi sel menghasilkan fusan sel hibridoma yang ditandai denganadanya pertumbuhan biakan sel pada dasar medium mikroplate dan membawa sifat genetik dari selinduknya untuk menghasilkan antibodi.

Produksi Antibodi Monoklonal

Antibodi monoklonal yang diperoleh pada penelitian ini merupakan hasil kloning sel hibridomapenghasil antibodi Vibrio harveyi. Kloning dilakukan pada sel hibridoma yang berasal dari 3 sumuranplate yang mengenali dan memberikan reaksi yang positif terhadap antigen V.harveyi setelah dilakukanuji secara ELISA. Hal ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh Rahmadani dkk (2002)bahwa sel yang mengenali antigen yang diimunisasikan adalah sel yang positif, segera diseleksikemudian dikloning sel. Kloning sel dilakukan pada wadah mikroplate 96 well dengan cara limitingdilution. Untuk mendapatkan klon yang berasal dari satu sel hibridoma dilakukan pengenceranterbatas hingga diperoleh satu sel pada setiap sumur (Zola, 1987dalam Maryam 2007).

Hasil seleksi dari ke 3 sumur biakan dikloning dengan cara limiting dilution, dari seleksi klontersebuti diperoleh 1 koloni sel tunggal pada wadah mikroplate pada 2 lubang yang berbeda. Kolonisel dikultur dan dipelihara pada inkubator CO2 pada suhu 37oC. Sel yang dihasilkan pada sumurbiakan menghasilkan sekresi sel yang mengenali antigen yang disuntikkan yakni mengandung antibodiV.harveyi. Kloning dilakukan untuk memastikan bahwa sel penghasil antibodi merupakan suatu koloniyang berasal dari satu sel. Hal ini berdasarkan dari adanya reaksi positif yang terbentuk dari sekresi2 mikro well yang tumbuh sel mengandung antibodi monoklonal dan mengenali antigen V. harveyberdasarkan uji secara ELISA seperti dipaparkan pada Gambar 1.

Hasil pengujian titer antibodi monoklonal V. harveyi kloning sel menggunakan metode ELISAkerapatan optik yang terbentuk dari hasil sekresi sel antibodi 1 dan 2 tampak pada Gambar 1 bahwanilai optikal density pada setiap pengenceran antigen berbeda antara sekresi sel antibodi, kontrolpositif dan kontrol negatif.

Gambar 1. Uji ELISA sekresi sel penghasil monoklonal antibodi

Mob 1 Mob 2

K (+)K (-)K sbt

1 2

589 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015

Nilai kerapatan optik padaTabel 1, tertinggi ditunjukkan oleh penggunaan antigen Vibrio harveyisebagai pelapis pertama pada plate dengan pengenceran 1:100 baik pada pengujian antibodimonoklonal 1 maupun antibodi monoklonal 2. Well yang menggunakan antigen dengan pengenceranterendah (1:100) pada pelapisan pertama pada mikroplate mempunyai warna hijau yang lebih terangbila dibandingkan well yang menggunakan pengenceran yang lebih tinggi. Kontrol positif memberikanwarna hijau yang lebih terang dibandingkan dengan antibodi 1 dan 2, sedangkan pada kontrolnegatif dan kontrol substrat tidak memberikan warna hijau. Adanya perbedaan warna tersebut karenainteraksi yang terbentuk antara ikatan kompleks antigen dengan sekresi antibodi monoklonal V.harveyi yang bereaksi dengan enzim HRP dan H2O2 yang berasal dari substrat (Barna-Vetro, 2002).Pada pengenceran antigen yang lebih rendah ikatan antara antigen antibodi lebih kuat dibandingpenggunaan pengenceran yang lebih tinggi. Reaksi pembentukan warna tersebut terlihat pada Gambar1 demikian juga nilai kerapatan optik yang dihasilkan berbeda pada setiap pengenceran dengannilai tertinggi pada pengenceran 1:100 dan terendah pada 1 : 3200.

Dari Gambar 2 terlihat Mab 1 dan 2 memiliki spesifitas yang hampir sama untuk berikatan denganantigen kecuali pada pengenceran 1:800 (kemungkinan terjadi kesalahan pada proses pengenceranantigen). Kedua MAb tersebut dapat digunakan dalam pengujian immunoassay untuk mendeteksi V.harveyi.

Sekresi sel yang dikultur dari hasil kloning sel menghasilkan antibodi monoklonal yang mengenaliantigen V. harveyi berdasarkan dari reaksi yang terbentuk setelah dilakukan uji secara ELISA dengankerapatan optik tertinggi pada pengenceran antigen 1:100. Nilai kerapatan optik Monoklonal antibodi1 adalah 0,384 dan Mab2 0,391, kontrol negatif 0,049, kontrol positif 0,767 dan kontrol substrat0,041 pada panjang gelombang 405 nm. Berdasarkan dari reaksi yang terbentuk antara antigen V.harveyi dengan monoklonal antibodi sekresi sel hasil kultur secara in vitro maka produksi antibodi

Pengenceran antigen

MAb 1 MAb 2Kontrol positif

Kontrol substrat

Kontrol negatif

1 : 100 0,391 0,384 0,767 0,041 0,0491 : 200 0,279 0,280 0,602 0,034 0,0491 : 400 0,151 0,150 0,418 0,038 0,0511 : 800 0,005 0,046 0,310 0,041 0,050

1 : 1600 0,047 0,049 0,279 0,036 0,0521 : 3200 0,052 0,055 0,203 0,038 0,054

Tabel 1. Uji ELISA sekresi sel monoklonal antibodi

Gambar 2. Hasil Kerapatan Optik (OD) sekresi sel Antibodi monoklonal

590Produksi monoklonal antibodi Vibrio harveyi (Nurhidayah)

monoklonal yang dihasilkan dapat berfungsi sebagai antibodi primer atau sekunder dalam uji secaraELISA.

KESIMPULAN

Penelitian pengembangan teknik hibridoma menghasilkan antibodi monoklonal yang positifmengenali Vibrio harveyi dengan menggunakan teknik ELISA. Antibodi monoklonal yang dihasilkandapat dikembangkan untuk perangkat kit diagnostik untuk mendeteksi Vibrio harveyi.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian ini dibiayai oleh APBN 2014 Balai Penelitian dan Pengembangan Kelautan dan Perikanan,Kemeterian Kelautan dan Perikanan. Ucapan terima kasih disampaikan kepada para peneliti dan teknisiLitkayasa Kesehatan Ikan dan Lingkungan BPPBAP yang telah membantu dalam pelaksanaan kegiatanpenelitian ini.

DAFTAR ACUAN

Alberts, B, Johnson, A, Lewis, J, Raff, M, Robert, K, & Walter, P. (2002). Manipulating proteins, DNA, andRNA. In: Anderson MS, Dilernia B, editors. Molecular biology of the cell. (4th ed). New York: GarlandScience.

Abbas, A.K, & Lichtman, AH. (2005). Antibodies and antigens. In: Schmitt WR, Krehling H, editors.Cellular and molecular immunology. 5th ed. Philadelphia: Elsevier Saunders.

Austin, B., & Zhang, X.H. (2006). Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates andinvertebrates. Lett. Appl. Microbiol, 43:119–124.

Burgess, G.W. (1988). ELISA Technology in Diagnosis and Research Graduate School of Tropical VeterinaryScience. James Cook University of North Queensland Townsville, Australia.

Baticados, M.C.L., Lavilla-Pitogo, C.R., Cruz-Lacierda, E.R., De la Pena, L.D., & Sunaz, N.A. (1990).Studies on the chemical control of luminous bacteria Vibrio harveyi and V. splendidus isolated from diseasedPenaeus monodon larvae and rearing water. Diseases of Aquatic Organis. 9: 133-139

Barna-Vetro I. (2002). Development of sensitive immuno diagnostics for determination of toxic residues(mycotoxins, drugs) in biological fluids and animal feeds. PhD Thesis. Facultas Scienciarum Veterinarium-Budapest

Ben Haim, Y., Thompson, F.L., Thompson, C.C., Cnockaert, M.C., Hoste, B., Swings, J., & Rosenberg, E.(2003). Vibrio coralliilyticus sp. nov., a temperature-dependent pathogen of the coral Pocilloporadamicornis. Int J Syst Evol Microbiol, 53: 309–315.

Chu, F.S. (1996). Imunoassays for mycotoxins. In Modern Methods in the Analysis and Structural Elucidationof Mycotoxins. R.J. Cole (Ed.). Academic Press, Orlando,

Farmer, J.J. & Hickman-Brenner, F.W. (1992). The genera Vibrio and Photobacterium. P:2952–3011. InBalows, A. (Ed). The Prokaryotes – a Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiology, Isolation,Identification, Applications. New York: Springer.

Ikematsu W., Kobarg J., Ikematsu, H., Ichiyoshi, Y., & Casali, P. Clonal analysis of Human antibody respon.III. Nucleotide sequences of monoclonal IgM, IgGand IgA to rabies virus reveal restricted gene utilization.Junctional diversity and somatic hypermutation. J. Immunology161: 2895-2905

Goldsby, R.A., Kind, T.J., & Osborne, B.A. (2000). Immunology. (4th ed). WH. F reeman and Company.New York.

Karunasagar, I., Pai, R., Malathi, G.R., & Karunasagar, I. (1994). Mass mortality of Penaeus monodonlarvae due to antibiotic-resistant Vibrio harveyi infection. Aquaculture, 128: 203–209.

Moriarty, D.J.W. (1998). Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds. Aquaculture, 168:351-358.

Machmud, M., Harjosudarmo,J., Manzila,I., & Surya,Y. (2004). Pengembangan teknik produksi dan aplikasiantibodi monoklonal Ralstonia Solamacearum (RS). Kumpulan Makalah Seminar Hasil Penelitian BB-Biogen Tahun 2004. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya GenetikPertanian (BB-Biogen), Bogor

591 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015

Newell, D.G., Mc Bride, B.W., & Clark, S.A. (1988). Making Monoclonal: A practical Beginners. Guide to theProduction and Characterization of Monoclonal Antibodies Agains Bacteria and Viruses. Public HealthLaboratory Service. London

Nelson, P.N., Reynolds, G.M., Waldron, E.E., Ward, E., Giannopoulos, K., & Murray, P.G. (2000).Demystified monoclonal antibodies. J Clin Pathol: Mol Pathol; 53: 111

Rahmahani, J.( 2002). Karakterisasi Gli koprotein Virus Rabies Strain Alam Pada Pembuatan AntibodiMonoklonal Rabies. Laporan penelitian Universitas Airlangga Surabaya.

Rukprataporn, S., Sukhumsiricart, W., Chaivisuthangkura, P., Longyant, S., Sithigorngul, W., Menasveta,P., & Sithigorngul, P. (2005). Generation of monoclonal antibodies specific to hepatopancreatic parvovirus(HPV) form Penaeus monodon. Dis Aquat Org. Vol. 65: 85-89

Saulnier, D., Haffner, P., Goarant, C., Levy, P., & Ansquer, D. (2000). Experimental infection models forshrimp vibriosis studies: a review. Aquaculture 191:133–144.

Warno. (2003). Produksi Antibodi Monoklonal Dengan Antigen Spesifik untuk Tujuan Imuno - diagnostikdan Imunoterapi. Prosiding Seminar Nasional. Aplikasi Biologi Molekuler di BidangVeteriner dalamMenunjang Pembangunan Nasional.

Zhang, X.H., & Austin, B. (2000). Pathogenicity of Vibrio harveyi to salmonids. J. Fish Dis, 23: 93–10Zola, H. (1987). Monoclonal Antibodies: A manual of techniques. CRP Press, Inc. Boca Raton, Florida, 23-

87.