PRAKTIKUM UJI KANDUNGAN PROTEIN DENGAN METODE

BRADFORD

Disusun Oleh :

ARGHYA NARENDRA DIANASTYA (111510501105)

(Mahasiswa Penerima Beasiswa Unggulan S-1 PS. Agroteknologi Fakultas

Pertanian UNEJ)

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGIFAKULTAS PERTANIANUNIVERSITAS JEMBER

2012

1. PENDAHULUAN

Semua sistem kehidupan mengandung sejumlah besar protein yang berbeda.

Perbedaannya terdapat pada asam amino, urutan asam amino, kandungan non-

asam amino, bobot molekul, dan faktor yang menentukan konformasi protein.

Dalam hal tersebut, untuk menentukan struktur protein tertentu kita diharuskan

untuk protein tersebut dari bahan non protein dan dari protein yang lain

(Robinson, 1995).

Protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan

unsur air dari gugus aminop dan gugus karboksil yang dimiliki. Jika protein

tersebut memiliki bobot senyawa yang kurang dari 6.000, biasanya digolongakn

kedalam polipeptida. Secara umum, pada hidrolisis protein tertentu biasanya

ditemukan 16 sampai 20 asam amino yang berlainan. Asam amino dalam sebuah

protein tersusun secara saling berkaitan membentuk rantai polimer lurus dengan

sambung silang antara gugus sulfhidril sisteina membentuk jembatan disulfida

(Robinson, 1995).

Protein memiliki beberapa fungsi, lima diantaranya adalah sebagai:

biokatalisator, protein cadangan, biomol pentrasfer bahan, struktural, dan

protektif.namun demikian, pada umumnya protein dikenal sebagai bagian dari

makanan yang dipergunakan sebagai pengganti jaringan sel (Martoharsono,

1998).

Protein memiliki keragaman dan kerumitan. Adanya keragaman dan

kerumitan tersebut mendorong terciptanya bagan penggolongan. Protein

tumbuhan sebagai contoh telah dikelompokkan berdasarkan sumbernya. Secara

umum didalam tumbuhan terdapat dua portein, yaitu portein biji dan protein daun.

Protein tersebut lebih lanjut dibagi menjadi protein embrio dan protein

endosperma pada protein biji dan protein kloroplas unttuk protein daun

(Robinson, 1995).

Bagan penggolongan lain didasarkan kepada penglompokan menjadi protein

sederhana, yaitu protein yang pada hidrolisisnya hanya menghasilkan asam amino

alfa, dan protein konjugasi. Protein konjugasi adalah protein yang pada proses

hidrolisisnya menghasilkan asam amino dan senyawa lain. Anak golongan utama

protein sederhana dicantumkan dalam “Penggolongan Osborne”. Beberapa contoh

protein tersebut adalah Albumin, Globulin, Glutelin, Prolamin Histon (Robinson,

1995).

Terdapat beberapa golongan protein sederhana yang tidak dapat dimasukkan

ke dalam salah satu golongan pada bagan klasik ini. Satu kelompok protein

penting ialah protein yang bersifat asam yang berkaitan dengan DNA kromosom

atau RNA ribosom (Robinson, 1995).

Pada tanaman, konsentrasi protein tertinggi didapati dalam biji sebesar 40%

dan ditemukan dalam biji dari berat keringnya. Protein dalam biji akan digunakan

sebagai energi dalam perkecambahan biji. Protein dalam tanaman larut dalam air,

namun demikian terdapat protein yang terikat pada membran lipoprotein sehingga

yang akan dihitung adalah total protein terlarut. Hal tersebut dikarenakan sebagai

pelarut atau buffernya merupakan air (Siswoyo dan Handoyo, 2012).

Terdapat beberapa cara untuk menentukan konsentrasi protein, salah

satunya menggunakan pengujian bradford. Pengujuian Bradford merupakan

metode yang sering digunakan, khususnya dalam penentuan kandungan protein

dari fraksi sel atau dari gel electrophoresis. Metode ini merupakan prosedur

standar dengan sensivitas antara 20 – 200 ug protein. Lebih lanjut, pengujian ini

ddidasarkan pada observasi bahwa absorban maksimum untuk larutan asam dari

CBB G-250 antara 165 nm sampai 595 nm ketika protein terikat (Siswoyo dan

Handoyo, 2012). Untuk mengetahui langkah pengukuran kandungan protein

dengan meode Branford, dilaksanakan praktikum yang mengukur kandungan

protein dalam biji dan daun tanaman kakao.

1. TUJUAN

1. Untuk mengetahui cara pengukuran kandungan protein dengan meode

Bradford menggunakan bahan biji dan daun tamaman kopi dan kakao;

2. Untuk mengetahui seberapa besar kandungan protein pada biji dan daun

tanaman kopi dan kakao;

3. Untuk membandingkan kadar protein antara biji dan daun kopi serta kakao.

3. BAHAN DAN METODE

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat :

1. Tabung Reaksi

2. Mikropipet (20, 200 dan 1000 ul)

3. Inkubator

4. Spekrofotometer

5. Rak tabung reaksi

3.1.2 Bahan :

1. Coomassie Brilliant Blue G-250

2. 95 % Ethanol

3. 85% Phosphoric Acid

4. BSA (Bovine Serum Albumine) sebagai standar

5. Bradford reagent : 100 mg Coomasie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml ethanol

95% dan ditambahkan 100 ml (w/v) Phosphoric acid dan tambahkan aquades

sampai volume 1 liter. Saring larutan dengan kertas whatman sebelum

digunakan.

3.2 Cara kerja :

1. 2 gr sampel digerus dengan mortar pestle setelah diberi nitrogen cair.

2. Tambahkan 3 kali volume buffer ekstraksi yang mengandung (100 mM MOPS-

NaOH (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM beta-2 mercaptoenol

dan 10 % PVP.

3. Homogenat dimasukkan dalam 4 ependorf dan disentrifugasi pada kecepatan

10.000 rpm 4oC selama 10 menit, kemudian ambil supernatan dan digunakan

sebagai sumber enzim (satu epedorf untuk pengukuran protein ).

Pembuatan grafik standar BSA

1. Siapkan 5 tabung mikro sentrifuse (beri nomor 1-5), kemudian isi masing

masing dengan bahan seperti table dibawah ini :

Nomor

Tabung

Volume BSA

(uL)

Larutan Buffer

(uL)

Bradford Reagent (uL)

1. 5 45 950

2. 10 40 950

3. 20 30 950

4. 25 25 950

Catatan : - Konsentrasi larutan stok BSA = 1 UG UL-1

Setelah didiamkan selama 15 menit ukur OD 595 nm dengan spektrofotometer.

Cari persamaan regresinya sebagai X adalah OD 596 dan sebagai Y adalah jumlah

BSA.

Pengukuran sampel

1. Masukkan sampel protein sebanyak 25 uL ke dalam tabung mikrosentrifugasi

dilakukan 4 kali pengenceran dan ditambah larutan buffer sebanyak 30 uL dan

divortex.

2. Tambahkan 950 ul reagent Bradford dan divortex.

3. 15 menit kemudian ukur OD pada panjang gelombang 595 nm

4. Hitung kandungan protein sampel menggunakan grafik standar BSA

4. HASIL PERCOBAAN

4.1 Pembuatan Kurva Standar Analisis Protein Metode Bradford

Kurva Standar

Absorban Konsentrasi BSA (mg/ml)

0,000 0,000

0,427 5,000

0,516 10,000

0,655 20,000

0,665 25,000

4.2 Pengukuran Absorban Sampel Kopi-Kakao

SampelA595

Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3

Biji Kopi 0,601 0,610 0,587

Daun Kopi 0,583 0,571 0,595

Biji Kakao 0,401 0,434 0,431

Daun Kakao 0,409 0,438 0,418

4.3 Penentuan Persamaan Regresi

Persamaan Regresinya adalah y = 33,36x - 3,102

4.4 Penentuan Persamaan Regresi

Sampel

Kadar Protein (mg/ml) Kandungan Protein

Sampel dan

Toleransi

Kesalahannya

Ulangan

ke- 1

Ulangan

ke- 2

Ulangan

ke- 3Rata-rata Stdev

Biji Kopi 3,389 3,450 3,296 3,378 0,077 3,378 ± 0,077

Daun

Kopi 3,269 3,189 3,349 3,269 0,080 3,269 ± 0,080

Biji

Kakao 2,055 2,275 2,255 2,195 0,122 2,193 ± 0,099

Daun

Kakao 2,108 2,302 2,168 2,193 0,099 2,195 ± 0,123

5. PEMBAHASAN

Metode Bradford adalah salah satu metode yang digunakan untuk mengukur

kandungan protein. Metode tersebut dilakukan pertama kali oleh Bradford

(Bradford et al., 1976). Pada saat ini, metode Bradford telah banyak dilakukan

untuk mengukur kandungan protein karena metode tersebut dinilai mudah, cepat,

dan hasilnya cukup akurat. Selain itu, pengukuran kandungan protei dengan

metode Bradford lebih tahan terhadap interferensi senyawaan nonprotein yang

sering kali mengganggu jalannya pengujian kuantitatif protein.

Pengujian kandungan protein dengan metode Bradford didasarkan pada

pengikatan zat warna Coomassie Briliant Blue G-250 terhadap protein. Coomassie

Briliant Blue G-250 memiliki formasi ion berbeda dengan nilai pKa 1.15, 1.82

dan 12.4. Bentuk kationik zat warna tersebut berwarna merah dan hijau dengan

panjang gelombang serapan maksimum pada 470 dan 650 nm. Sedangkan bentuk

anioniknya berwarna biru dengan absorbansi (panjang gelombang serapan)

maksimum 590 nm. Namun, untuk pengukuran protein dilakukan dengan

menentukan jumlah zat warna dalam bentuk anionik (biru) serta dilakukan dengan

mengukur absorbansi larutan pada 595 nm. Zat warna Coomassie Blue G-250

bereaksi cepat dengan residu arginil dan lysil dari protein, sehingga menyebabkan

adanya variasi hasil pengukuran untuk jenis protein yang berbeda. Protein dengan

residu arginil dan lysil lebih banyak, akan menghasilkan warna biru yang lebih

intens. Sedangkan, protein yang memiliki residu arginil dan lysil lebih sedikit,

warna biru tidak lebih intens, walaupun jumlah proteinnya sama.

Metode Bradford merupakan metode yang paling sesuai dan umum

digunakan. Metode Bradford memiliki dua jenis assay protein, yaitu Standar

Assay dan Microassay. Standar Assay digunakan untuk pengukuran kadar protein

antara 10 sampai 100 µg, sedangkan Microassay digunakan untuk pengukuran

kadar protein antara 1 sampai 10 µg. Namun, pengukuran dengan Microassay

umumnya lebih rentan terhadap interferensi senyawaan nonprotein.

Prinsip kerja analisis protein dengan metode Bradford adalah

spektrofometri. Spektrofotometri adalah sebuah alat yang dapat memberikan nilai

absorban pada sampel. Spektrofotometri akan mengirimkan cahaya berupa cahaya

tampak yang akan diserap oleh sampel. Semakin besar cahaya yang diserap, maka

semakin besar nilai absorbannya. Namun, kandungan protein tidak dapat langsung

diketahui. Kandungan protein setiap sampel harus dihitung lagi menggunakan

nilai absorban setiap sampel.

Secara umum, protein terdapat pada hampir setiap susunan sel mahluk

hidup. Pada tanaman yang menghasilkan biji, kandungan protein lebih dominan

terdapat pada bagian biji. Sebagai contoh pada tanaman kopi dan kakao. Hasil

percobaan yang kami lakukan dengan membandingkan kandungan protein pada

biji dan daun menunjukkan bahwa kandungan protein pada biji lebih banyak

dibandingkan pada bagian daun. Hasil rata-rata perhitungan kandungan protein

pada biji kopi 3,378 sedangkan pada daun kopi 3,269, sehingga kita dapat

mengetahui bahwa kandungan protein pada biji jauh lebih tinggi 0,109

dibandingkan pada bagian daun kopi. Sedangkan, hasil perhitungan rata-rata

kandungan protein dalam biji kakao sebesar 2,881 dan pada daun kakao 2,193.

Selisih yang didapatkan dari perbedaan kandungan protein biji kakao dan daun

kakao adalah 0,688.

Dari hasil analisa protein yang dilakukan, dapat diketahui pula bahwa

kandungan protein pada biji dan daun kopi lebih besar terhadap biji dan daun

kakao. Hal tersebut dikarenakan pada tanaman kopi, sebagian hasil fotosintat

diubah menjadi protein, sedangkan pada tanaman kakao, hasil fotosintat secara

umum diubah menjadi bentuk lemak. Namun demikian, kandungan dari hasil

fotosintat yang tersimpan masih tergantung pada usia tanaman. Seperti hasil

penelitian Wealth of India (1990), kandungan protein dari 100 gram biji kopi

adalah sebesar 11,23 gram. Menurut Belitz et al., kandungan protein biji kakao

adalah 11,5. Perbedaan kandungan protein dengan metode Bradford pada

penelitian kami tidak sesuai dengan pernyatan tersebut, karena terdapat faktor-

faktor kesalahan terjadi ketika penelitian. Sehingga, hal itu memengaruhi hasil

dari kandungan protein.

Didalam praktikum terdapat faktor-faktor kesalahan yang mempengaruhi

hasil pengukuran kandungan protein, hal tersebut diantaranya meliputi

penggerusan biji dan daun pada kopi dan kakao. Penggerusan akan mempengaruhi

halus tidaknya bahan yang digerus. Semakin halus, maka analisis protein yang

dilakukan akan semakin mudah. Hal tersebut dikarenakan, semakin halus substrat

yang ditumbuk, maka akan memudahkan dalam hal reaksi terhadap Bradford

reagen. Selain itu, faktor keseterilan alat sangat berpengaruh. Semakin steril alat

praktikum yang digunakan, maka semakin baik hasil yang diperoleh. Faktor

manusia, juga mmempengaruhi dalam analisa protein. Hal tersebut dikarenakan

sering terjadinya human eror dalam pencatatan hasil dan pengelolahan data.

Kandungan protein semua bahan, protein2 itu berada dimana?

Perbandingan protein pada biji dan daun kopi dan kakao, kenapa kok beda

Perbandingan protein pada kopi dan kakao, kenapa kok beda

6. KESIMPULAN DAN REKOMENDASI

6.1 Kesimpulan

Uji kandungan protein dengan metode Bradford sangat mudah dan cukup

akurat. Kandungan protein pada tanaman yang menghasilkan biji umumnya

banyak terdapat pada bijinya dibandingkan pada daunnya, seperti pada kakao dan

kopi. Hal itu karena hasil fotosintat lebih banyak disimpan pada biji kakao

maupun kopi.

6.2 Rekomendasi

Sebaiknya dalam melaksanakan praktikum penentuan kandungan protein

dengan metode Bradford harus benar-benar teliti. Tingkat ketelitian akan

memengaruhi keakuratan hasil. Selain itu, alat-alat yang digunakan harus steril

serta sampel yang digerus benar-benar halus agar hasilnya juga akurat.

DAFTAR PUSTAKA

Bradford, MM. 1976. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254.

Martoharsono, S. 1998. Biokimia Jilid I. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung: Penerbit ITB.

Siswoyo, T.A. dan Handoyo, T. 2012. Petunjuk Praktikum Biokimia Tanaman (Tidak Diterbitkan). Jember: Universitas Negeri Jember