Praktikum Kimia Produk Alam Jalur Biosintesis Mevalonat(1)

8/17/2019 Praktikum Kimia Produk Alam Jalur Biosintesis Mevalonat(1)

1/14

PERCOBAAN III

JALUR ASETAT-MEVALONAT

I. Tujuan

1. Mahasiswa diharapkan mampu memahami prinsip pemisahan dan identifikasi

senyawa dengan metode Kromatografi Lapis Tipis.

2. Mahasiswa diharapkan mampu memisahkan dan mengidentifikasi golongan

senyawa-senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan dari jalur asetat-

mevalonat dengan teknik Kromatografi Lapis Tipis.

II. Alat dan bahan

1. Alat

a. Lempeng KLT

b. Bejana KLT

c. Sinar UV 254nm dan 366nmd. Kompor listrik

e. Pipa kapiler

f. Alat penyemprot

g. Pinset

2. Bahan

a. Larutan pembanding:

• Stigmasterol

• Campuran timol-menthol

b. Larutan uji:

• Rhizoma pacing (Costus specisous)

• Daun mint (Mentha piperita)

• Minyak kayu putih (Melaleuca leucadendron)

• Oregano

c. Fase gerak:

• Steroid: heksana:etil asetat (4:1)

• Terpenoid: toluene:etil asetat (93:7)

d. Fase diam: silica gel F254

e. Anisaldehid-asam sulfat

f. Vanillin-asam sulfat

III. CARA KERJA

Disiapkan larutan uji dan larutan pembanding (oleh laboran)

Dilakukan penjenuhan bejana/chamber berisi fase gerak (oleh laboran)

Prosedur KLT:


2/14

Ditotolkan sebanyak 4 kali penotolan larutan uji dan larutan pembanding

dengan pipa kapiler pada lempeng KLT (jarak penotolan 1.0 cm dari tepi

bawah lempeng)

Dibiarkan sampai kering

Ditetapkan jarak rambat 5 cm dari titik penotolan dan ditandai dengan pensil

pada tepi atas

Dimasukkan lempeng KLT pada bejana yang sudah dijenuhi fase gerak

dengan hati-hati

Disandarkan lempeng KLT pada dinding bejana hingga bagian bawah

lempeng tercelup fase gerak

Ditutup bejana dengan rapat dan dipastikan bahwa totolan tidak tercelup fase

gerak dan fase gerak bergerak keatas secara bersama-sama (membentuk garis

horizontal lurus)

Dibiarkan fase gerak bergerak keatas pada permukaan lempeng hingga

mencapai batas jarak rambat yang sudah ditetapkan

Dikeluarkan lempeng dan dikeringkan di udara

Diamati bercak pada sinar tampak, sinar UV gelombang pendek (254nm), dansinar UV gelombang panjang (366nm)

Didokumentasikan dan dihitung harga Rf dari bercak-bercak senyawa hasil

pemisahan dan dibandingkan dengan senyawa pembanding

Plat KLT disemprot dengan pereaksi anisaldehid-asam sulfat (untuk sampel

steroid) dan vanillin-asam sulfat (untuk sampel terpenoid)

Dipanaskan sebentar di atas kompor listrik hingg anampak bercak pada plat

KLT

Diamati bercak pada sinar tampak dan sinar UV gelombang panjang (366nm)

Didokumentasikan dan dihitung harga Rf dari bercak-bercak senyawa hasil

pemisahan dan dibandingkan dengan senyawa pembanding.

IV. HASIL PERCOBAAN

1. Sampel

a. Oregano

b. Daun mint ( Mentha piperita )


3/14

c. Minyak kayu putih ( Melaleuca leucadendron )

Fase diam : Silica gel F 254

Fase gerak : Toluen – Etil asetat ( 93:7 v/v)

Penotolan sampel : 4 kali

Jarak elusi : 5 cmDeteksi : Vanilin – Asam sulfat

a. Sebelum disemprot

1) Sinar tampak 2) UV 254

3) UV 366


4/14

b. Setelah disemprot


c. Tabel Rf

No

Sebelum disemprot

Tampak UV 254 UV 366

P S1 S2 S3 P S1 S2 S3 P S1 S2 S3

a 0,4 0,28 0,88

0,06

0,4 0,46

0,88

0,32

0,46

0,46

b0,4

6

0,2

8

0,4

6

0,2

6

0,2

8

0,3

c 0,3 0,24

0,3 0,06

0,24

0,46

d 0,22

0,3

2

0,2

2

0,4

4

e 0,12

0,1

6

0,1

2

f

g

No

Setelah disemprot

Tampak UV 366P S1 S2 S3 P S1 S2 S3

a 0,4 0,42 0,88

0,6

4

0,4 0,6 0,8

8

0,6

8

b 0,28 0,76

0,48

0,08

0,42

0,76

0,58

c 0.24 0,54

0,32

0,42

0,46

0,56

d 0.12 0,3 0,06

0,2

8

0,5

4

0,3

2

e 0,12

0,24

0,3

f 0,120,12

g


5/14

Analisis:

Untuk menganalisa senyawa pada suatu sampel, perlu diamati harga Rf dan

warna bercak sampel dan pembanding. Sampel dikatakan mengandung senyawapembanding apabila harga Rf dan warna bercaknya sama.

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan didapatkan hasil bahwa ketiga

sampel tidak menunjukkan warna dan Rf yang sama dengan senyawa

pembanding, sehingga dapat dikatakan bahwa ketiga sampel pada plat 1 tidak

mengandung senyawa pembanding thymol-menthol.

2. Sampel : Rhizoma pacing ( Costus specisous )

Fase diam : Silica gel F254

Fase gerak : n-heksana – Etil asetat ( 4:1 v/v)

Penotolan sampel : 4 kali penotolan dengan pipa kapilerJarak elusi : 5 cm

Deteksi : Anisaldehid – Asam sulfat



2) UV 366

Setelah disemprot


6/14



c. Tabel Rf

No

Sebelum disemprot Setelah disemprot

Tampak UV 254 UV 366 Tampak UV 366

P S P S P S P S P S

a 0,94

0,94

0,78

0,94 0,7 0,74 0,7 0,74

b 0,5

6

0,5

6

0,5 0,74 0,66 0,4

2

0,6

6

c 0,4

2

0,4

2

0,4

6

0,56 0,56 0,3 0,5

6

d 0,2 0,2 0,3 0,42 0,4 0,2

4

0,4

2

e 0,2 0,2 0,2

f

g

Analisis:

Untuk menganalisa senyawa pada suatu sampel, perlu diamati harga Rf dan

warna bercak sampel dan pembanding. Sampel dikatakan mengandung senyawa

pembanding apabila harga Rf dan warna bercaknya sama.

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan didapatkan hasil bahwa sampel

mengandung stigmasterol dibuktikan dengan harga Rf yang sama yaitu 0,42 dan

berwarna biru yang terlihat setelah penyemprotan menggunakan anisaldehid-asam

sulfat dan dilihat dibawah sinar UV 366 nm.


7/14

Foto hasil pengamatan:

1. Plat 1 (Terpenoid)


UV 254 nm UV 366 nm



8/14

Sinar tampak UV 366 nm

2. Plat 2 (Steroid)


UV 254 nm UV 366 nm


Sinar tampak UV 366 nm

V. PEMBAHASAN

Percobaan ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa – senyawa yang

dihasilkan dari jalur asetat-mevalonat dari suatu produk alam menggunakan teknik

Kromatografi Lapis Tipis.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah prosedur analisis yang teknik

pengerjaannya cukup sederhana, cepat, dan murah sehingga memberikan ahli kimia

jawaban yang cepat tentang berapa banyak komponen dalam suatu campuran sampel

yang dianalisis. KLT juga dapat digunakan untuk mendukung identitas senyawa

dalam campuran ketika Rf senyawa dibandingkan dengan Rf senyawa yang dikenal.

Sebuah plat KLT biasanya dibuat dari lembaran kaca, logam, atau plastic dengan


9/14

ukuran tertentu dan permukaan yang rata yang dilapisi dengan fase diam berupa

lapisan tipis adsorben padat (biasanya silica atau alumina).

Pada Kromatografi Lapis Tipis, sampel yang akan dianalisis dilarutkan pada

pelarut yang sesuai kemudian sampel dan pembanding ditotolkan dalam bentuk titik

atau pita pada permukaan fase diam. Setelah penotolan, sebaiknya plat diamati dibawah sinar UV untuk mengetahui apakah sampel dan pembanding yang ditotolkan

sudah dapat diampati. Plat KLT kemudian dicelupkan pada fase gerak di dalam

chamber tertutup. Perlu diperhatikan agar totolan sampel tidak ikut tercelup dalam

fase gerak karena hal ini akan menyebabkan sampel dan pembanding dapat terlarut

pada fase gerak dan tidak terjadi pemisahan. Fase gerak atau eluen perlahan-lahan

akan bergerak ke atas plat KLT mengikuti gaya kapiler hingga batas elusi yang telah

ditentukan. Prinsip pemisahan komponen pada teknik KLT didasarkan atas perbedaan

kekuatan interaksi masing-masing komponen dengan fase gerak dan fase diam. Suatu

komponen yang kepolarannya lebih sama dengan fase diam akan berinteraksi lebih

kuat dengan fase diam sehingga memiliki kecepatan migrasi yang lebih lambat.

Akibatnya, jarak migrasi senyawa tersebut lebih pendek. Jika kepolaran komponen

lebih sama dengan fase gerak, komponen tersebut akan lebih kuat interaksinya dengan

fase gerak sehingga lebih mudah terbawa dan menghasilkan kecepatan migrasi yang

lebih cepat serta jarak migrasi yang lebih panjang. Ketika fase gerak telah mencapai

batas yang ditentukan, plat diangkat dari ruang elusidasi kemudian diangin-anginkan

sebentar di udara. Senyawa hasil identifikasi divisualisasikan dengan detector yang

sesuai (UV, sinar tampak, pereaksi kimia). Jika senyawa merupakan senyawa yang

berwarna, visualisasi cukup dilakukan dengan sinar tampak. Namun kebanyakan

senyawa organik yang diidentifikasi merupakan senyawa tidak berwarna, sehinggaperlu dilakukan visualisasi lebih lanjut dengan menggunakan lampu UV baik pada

gelombang pendek maupun gelombang panjang.

Pengamatan di bawah sinar UV gelombang pendek (254 nm) dan gelombang

panjang (366 nm) dimaksudkan agar dapat menampakan senyawa sebagai bercak

yang berwarna gelap (UV 254 nm) dan untuk menampakkan bercak yang

berfluorosensi sehingga pada pengamatan terlihat bercak berpendar (UV 366 nm).

Keuntungan menggunakan sinar UV untuk memvisualisasikan bercak adalah sinar

UV tidak merusak senyawa yang dideteksi. Cara pemvisualisasian dengan

penyemprotan menggunakan asam sulfat dan pemanasan dilakukan untuk

mengoksidasi senyawa-senyawa organik yang tampak sebagai bercak hitam

kecoklatan. Adanya warna hitam kecoklatan menunjukkan adanya senyawa organik

pada sampel.

Dalam teknik KLT, perbandingan jarak rambat bercak senyawa sampel

terhadap jarak rambat fase gerak diukur dari titik penotolan dinyatakan sebagai Rf.

Identifikasi senyawa diamati dengan menghitung dan membandingkan harga Rf

antara senyawa pembanding dan senyawa sampel. Jika harga Rf senyawa sampel

sama dengan harga Rf senyawa pembanding, artinya senyawa sampel dan

pembanding memiliki kepolaran yang mirip, namun bukan berarti bahwa sampel

mengandung senyawa pembanding. Sampel dikatakan mengandung senyawa


10/14

pembanding apabila baik harga Rf maupun warna bercaknya sama. Harga Rf bukan

merupakan konstanta fisik karena akan berubah sesuai dengan kondisi percobaan.

Pada percobaan ini, senyawa yang digunakan sebagai sampel adalah

golongan senyawa jalur metabolit asam mevalonat yaitu Oregano, Daun mint ( Mentha

piperita), Minyak kayu putih ( Melaleuca leucadendron) dan Rhizoma pacing (Costusspecisous). Untuk senyawa pembanding digunakan campuran thymol-menthol dan

stigmasterol. Pembanding thymol-menthol digunakan untuk sampel Oregano, Daun

mint ( Mentha piperita), dan Minyak kayu putih ( Melaleuca leucadendron) sedangkan

stigmasterol adalah pembanding untuk Rhizoma pacing (Costus specisous).

Metode pemisahan yang dapat digunakan pada teknik KLT diantaranya adalah

metode pemisahan secara adsorpsi dan secara partisi. Pada metode pemisahan secara

partisi digunakan campuran fase gerak yang salah satunya adalah air. Air akan

melapisi permukaan fase diam, sehingga senyawa pada sampel akan terpartisi pada

fase gerak maupun fase diam. Namun metode yang digunakan pada percobaan ini

adalah metode pemisahan secara adsorpsi di mana senyawa pada sampel akan

teradsorpsi oleh fase diam yaitu silica gel F 254.

Praktikan diberi dua buah plat KLT yang dilapisi silica gel F 254 sebagai fase

diam. Kedua plat telah diberi tanda 1 cm dari dasar plat sebagai titik awal penotolan.

Sebelum dilakukan penotolan larutan pembanding dan sampel, diberi tanda pada titik

yang berjarak 5 cm dari titik awal penotolan sebagai titik batas elusi. Setelah itu

dilakukan penotolan senyawa sampel dan pembanding pada plat KLT menggunakan

pipa kapiler. Penotolan dilakukan sebanyak 4 kali dan tiap kali penotolan harus

ditunggu kering sebelum dilakukan penotolan selanjutnya. Penotolan yang dilakukan

harus menghasilkan titik yang sekecil mungkin agar bercak yang terjadi tidak melebarsehingga tidak mengurangi derajat pemisahan. Setelah penotolan, plat dimasukkan ke

dalam wadah tertutup berisi fase gerak. Pada plat dengan sampel Oregano, Daun mint

( Mentha piperita), dan Minyak kayu putih ( Melaleuca leucadendron), fase gerak

yang digunakan adalah Toluen – Etil asetat ( 93:7 v/v). Sedangkan untuk plat berisi

sampel Rhizoma pacing (Costus specisous), fase gerak yang digunakan adalah n-

heksana – Etil asetat (4:1 v/v). Memasukkan plat KLT ke dalam fase gerak harus

dilakukan dengan segera dan hati-hati agar fase gerak tidak menguap. Setelah itu

dibiarkan agar fase gerak bergerak ke atas plat hingga batas yang ditentukan.

Setelah fase gerak mencapai batas elusi, plat KLT segera diambil dan

dikeringkan di udara. Plat KLT kemudian diamati dengan sinar tampak, sinar UV 254

nm dan UV 366 nm. Setelah dilakukan pengamatan dengan sinar tampak, didapatkan

hasil bahwa kedua plat KLT tidak terlalu menunjukkan bercak yang jelas, bahkan

bercak senyawa pembanding tidak terlihat. Sedangkan di bawah sinar UV 254 nm

pada plat 1 (Oregano, Daun mint ( Mentha piperita), Minyak kayu putih ( Melaleuca

leucadendron), dan thymol-menthol), bercak senyawapembanding mulai terlihat dan

bercak senyawa sampel terlihat lebih banyak dan jelas. Sedangkan pada plat 2

(Rhizoma pacing (Costus specisous) dan stigmasterol) masih belum terlihat bercak

senyawa pembanding. Pada pengamatan di bawah sinar UV 366 nm, plat 1 hanya

terlihat bercak pada sampel 1 dan 2, sampel 4 sedangkan bercak senyawa pembanding


11/14

tidak terlihat. Sedangkan untuk plat 2, terlihat bercak yang cukup banyak pada

senyawa sampel dan pembanding.

Karena belum semua sampel dan pembanding terlihat bercaknya, dilakukan

visualisasi dengan jalan penyemprotan plat menggunakan pereaksi vanilin–asam

sulfat untuk plat 1 dan pereaksi anisaldehid–asam sulfat untuk plat 2. Setelahpenyemprotan dilakukan pemanasan yang merata pada kedua plat. Pada plat 1,

setelah penyemprotan dan pemanasan, lebih banyak bercak yang teramati dengan

sinar tampak maupun sinar UV 366 nm. Pada plat 2, setelah penyemprotan dan

pemanasan, lebih banyak bercak senyawa sampel yang teramati dengan sinar tampak

maupun sinar UV 366 nm dan mulai terlihat bercak senyawa pembanding.

Setelah pemvisualisasian bercak selesai, dilakukan penghitungan Rf agar

identifikasi dapat dilakukan. Untuk menganalisa senyawa pada suatu sampel, perlu

diamati harga Rf dan warna bercak sampel dan pembanding. Sampel dikatakan

mengandung senyawa pembanding apabila harga Rf dan warna bercaknya sama.

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan didapatkan hasil bahwa pada plat

1 ketiga sampel tidak menunjukkan harga Rf dan warna bercak yang sama dengan

senyawa pembanding, sehingga dapat dikatakan bahwa ketiga sampel tidak

mengandung senyawa pembanding thymol-menthol. Sedangkan pada plat 2

didapatkan hasil bahwa sampel mengandung stigmasterol dibuktikan dengan harga Rf

yang sama yaitu 0,42 dan bercak berwarna biru yang terlihat setelah penyemprotan

menggunakan anisaldehid-asam sulfat dan dilihat dibawah sinar UV 366 nm.

Hasil tersebut merupakan analisa awal sesuai pengamatan. Setelah dicocokkan

dengan literatur, seharusnya pada plat 1 sampel oregano (sampel 1) dan daun mint

(sampel 2) mengandung senyawa pembanding yaitu campuran thymol–mentholkarena kandungan utama dari Oregano adalah Thymol dan Carvacrol sedangkan

kandungan dari daun mint adalah menthol, menthone, 1,8-cineole, methyl acetate,

methofuran, isomenthone, limonene, b-pinene, a-pinene, germacrene-d, trans-

sabinene hydrate dan pulegone. Hal ini menunjukkan bahwa hasil percobaan tidak

sesuai teori. Sedangkan sampel minyak kayu putih berdasarkan literature memiliki

kandungan berupa a-pinene, b-pinene, myrcene, a-terpinene, limonene, 1,8-cineole, y-

terpinene, p-cymene, terpinolene, linalool, terpinen-4-ol dan a-terpineol. Hal ini

menunjukkan bahwa hasil percobaan sampel minyak kayu putih sesuai teori.

Ketidaksesuaian hasil percobaan pada sampel oregano dan daun mint dapat

disebabkan karena pengamatan yang kurang teliti, penotolan sampel yang kurang

tepat ataupun karena penyemprotan dan pemanasan yang kurang sempurna.

Sampel rhizoma pacing pada plat 2 berdasarkan hasil percobaan tmengandung

senyawa pembanding yaitu stigmasterol karena teramati harga Rf dan warna

bercaknya sama. Rf yang sama yaitu 0,42 dan berwarna biru yang terlihat setelah

penyemprotan menggunakan anisaldehid-asam sulfat dan dilihat dibawah sinar UV

366 nm. Hal ini tidak sesuai teori. Rhizoma Pacing (Costus speciosus) berdasarkan

literatur memiliki kandungan berupa beta-sitosterol, diosgenin, diosgenon,

sikloartanol, asam oktacosanoat, asam tetracosanoat, asam suksinat, serta daucosterin.

Meskipun Rhizoma Pacing tidak mengandung stigma sterol tetapi mengandung

sitosterol, diosgenin, dan kandungan – kandungan senyawa lain yang termasuk dalam


12/14

golongan steroid. Dengan kata lain Rhizoma Pacing termasuk ke dalam golongan

steroid. (Zhongguo Z&Yao Za Zhi, 2002)

Kayu putih (Melaleuca leucadendron) merupakan anggota famili Myrtaceae

yang memiliki kandungan utama berupa eukaliptol atau kayuputol. Kayu putih dalam

bidang farmasi digunakan sebagai parasitisida, karminatif, stimulant, serta diaforetika.Struktur eukaliptol adalah sebagai berikut:

Pepermint (Mentha piperita) dan Oregano merupakan anggota family

Lamiaceae. Keduanya memiliki kandungan utama berupa menthol. Dalam bidang

farmasi, pepermin banyak digunakan untuk meredakan sakit perut dan merupakan

obat ideal untuk mengatasi sakit kepala. Sedangkan oregano digunakan untuk

mengobati kuku atau kaki yang terkena jamur, membunuh parasit, menghilangkan

infeksi dan mengurangi infeksi sinus serta pilek. Struktur menthol:

Pacing (Costus specious) merupakan anggota famili costaceae yang memiliki

banyak kandungan senyawa kimia salah satunya yaitu beta-sitosterol. Beta-sitosterolmerupakan salah satu jenis senyawa steroid yaitu fitosterol. Selain beta-sitosterol,

jenis fitosterol yang lain adalah stigmasterol. Namun, stigmasterol tidak terdapat

dalam rhizoma pacing. Dalam bidang kesehatan, rhizoma pacing dapat digunakan

sebagai diuretic, antipiretik, serta antipruritik. Struktur beta-sitosterol:

VI. KESIMPULAN

1. Minyak kayu putih tidak mengandung thymol–menthol karena tidak

menunjukkan warna bercak dan harga Rf yang sama dengan pembanding. Hal ini

sesuai teori.

2. Oregano dan daun mint pada percobaan tidak menunjukkan harga Rf dan warna

bercak yang sama dengan senyawa pembanding. Hal ini tidak sesuai teori.


13/14

3. Rhizoma pacing menunjukkan harga Rf dan warna bercak yang sama dengan

senyawa pembanding. Hal ini tidak sesuai teori.

4. Metode pemisahan yang digunakan pada percobaan ini adalah metode

pemisahan secara adsorpsi.

VII. DAFTAR PUSTAKAAnonim, 2015, Cajuput Essential Oil (Cajeput) Information,

http://www.essentialoils.co.za/essential-oils/cajuput.htm, diakses 14

Maret 2015.

Anonim, 2015, Oregano Oil: Extraordinary Oregano Oil,

http://articles.mercola.com/herbal-oils/oregano-oil.aspx, diakses 14

Maret 2015.

Anonim, 2015, Peppermint Essential Oil Information,

http://www.essentialoils.co.za/essential-oils/peppermint.htm, diakses 14

Maret 2015.Anonim, 2015, Thin Layer Chromatography Information,

http://orgchem.colorado.edu/Technique/Procedures/TLC/TLC.html,

diakses 13 Maret 2015.

M. P Shafi, M. Thambi, 2015, Rhizome Essential Oil Composition of Costus

Speciosus and its Antimicrobial Properties,

http://ijpras.com/admin/uploads/Rhizome%20Essential%20Oil%20Co

mposition%20of%20Costus%20Speciosus.pdf, diakses 15 Maret 2015.

Zhongguo Z, Yao Za Zhi, 2002, Studies on hemical onstituents of wo lants

from Costus

Yogyakarta, 15 Maret 2015

Praktikan,

Fera Maharani (FA/09636)Sausanzahra A. (FA/09637)

Shella Syafira W. (FA/09638)


14/14

Praktikum Kimia Produk Alam Jalur Biosintesis Mevalonat(1)

Documents

Transcript of Praktikum Kimia Produk Alam Jalur Biosintesis Mevalonat(1)