PROSEDUR PRAKTEK

PELATIHAN KULTUR JARINGAN TANAMAN PISANG DI DINAS PERTANIAN DAN KEHUTANAN

PEMERINTAH KABUPATEN BELITUNG

TANGGAL 2 – 3 DESEMBER 2010

OLEH

ABD. ROHIM, SP.NIP. 19750902 200801 1 011

KEMENTERIAN PERTANIANBADAN PENYULUHAN DAN PENGEMBANGAN SDM PERTANIAN

BALAI BESAR PELATIHAN PERTANIAN(BBPP) LEMBANG

Jl. Kayuambon No. 82, Telp./ Fax. (022) 2786234-2789783, Lembang- BANDUNG 40391

1

KULTUR JARINGANPengertian Kultur Jaringan:Kultur Jaringan/Kultur In Vitro/Tissue Culture adalah suatu teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman (seperti sel, protoplasma, jaringan, dan organ) dan menumbuhkan bagian tersebut pada nutrisi yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman pada kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman sempurna kembali.

Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik Kultur Jaringan adalah:1. Sterilisasi Ruangan2. Persiapan Alat3. Sterilisasi Alat4. Penimbangan Bahan5. Pembuatan Larutan Stok6. Pembuatan Media 7. Sterilisasi Media8. Persiapan Eksplan9. Sterilisasi Eksplan10. Kegiatan Inokulasi (Penanaman Eksplan) 11. Inkubasi di Ruang Kultur Jaringan12. Kegiatan Sub Kultur/Multiplikasi 13. Pengakaran 14. Aklimatisasi15. Penanaman di Lapangan/Lahan

Beberapa Jenis Media Dasar dalam Kultur Jaringan:1. Media Dasar Murashige&Skoog (Media MS), dapat digunakan hampir untuk semua

jenis tanaman.2. Media Dasar White, sangat cocok untuk tanaman tomat3. Media Dasar Gamborg B5 (Media B5), dapat digunakan untuk sel kedelai, alfalfa,

dan legumen lain.4. Media Dasar Vacin&Went (Media VW) dan Knudson C, biasa untuk kultur anggrek.5. Media Dasar Nitsch, untuk kultur pollen dan tepung sari.6. Media Dasar Schenk&Hildebrant (Media SH), untuk kultur kalus tanaman monokotil

dan dikotil.7. Media Dasar Woody Plant Medium (Media WPM), khusus untuk tanaman berkayu.8. Media Dasar N6, untuk tanaman serealia terutaman padi.

2

A. Pembuatan Larutan Stok

Pembuatan stok bertujuan untuk mempermudah kegiatan dalam pembuatan media. Kegiatan ini untuk menghindari penimbangan berulang-ulang karena jumlah bahan kimia yang harus ditimbang cukup banyak dengan kebutuhan yang cukup kecil. Pembuatan larutan stok ini biasanya rata-rata konsentrasi minimal 1 stok sebanyak 100 ml larutan stok, untuk pembuatan 10 L media. Untuk Kultur Jaringan Tanaman Pisang media dasar yang biasa digunakan adalah MS (Murashige & Skoog). Adapun langkah-langkah pembuatan stok adalah sebagai berikut:

Bahan :

1. Bahan Dasar Media MS, meliputi:

STOK SENYAWA KIMIA KONSENTRASI (mg/L)I NH₄NO₃

KNO₃1.6501.900

II CaCl₂.2H₂O 440III MgSO₄.7H₂O

KH₂PO₄MnSO₄.4H₂OZnSO₄.7H₂OH₃BO₃

37017016,98,66,2

IV KINa₂MoO₄.2H₂OCoCl₂.6H₂OCuSO₄.5H₂O

0,830,25

0,0250,025

V FeSO4.7H2O Na2EDTA

27,837,3

2. Aquades3. NaOH 4. HCl5. Tisue

Alat :

1. Beaker Glass 50 ml2. Gelas Ukur 100 ml3. Timbangan Analitik4. Oven5. Spatula6. Botol stok Steril7. Magnetic Stirer8. Termometer9. Botol kultur10. Tutup botol (dari karet)11. Sendok

3

Cara Pembuatan :

a. Stok I (Sebanyak 100 ml, 10 kali konsentrasi) Timbang bahan NH₄NO₃ 16,5 gr dan KNO₃ 19 gr, Masukkan bahan satu persatu ke dalam 50 ml aquades, Setelah larut, tambahkan aquades menjadi 100 ml, simpan dalam botol steril, Beri label STOK I, tanggal pembuatan dan konsentrasi.

b. Stok II (Sebanyak 100 ml, 10 kali konsentrasi) Timbang CaCl₂.2H₂O sebanyak 4,4 gr, Larutkan dalam 100 ml aquades, Masukkan dalam botol steril, Beri label STOK II, tanggal pembuatan dan konsentrasi.

c. Stok III (Sebanyak 100 ml, 10 kali konsentrasi) Timbang MgSO₄.7H₂O 3,7 gr, KH₂PO₄ 1,7 gr, MnSO₄.4H₂O 0,16 gr, ZnSO₄.7H₂O 0,8 gr,

dan H₃BO₃ 0,062 gr, Larutkan bahan satu persatu kedalam 50 ml aquades, Tambahkan volume menjadi 100 ml, masukkan dalam botol steril, Beri label STOK III, tanggal pembuatan dan konsentrasi.

d. Stok IV (Sebanyak 100 ml, 10 kali konsentrasi) Timbang KI 0,16 gr, Na₂MoO₄.2H₂O 0,05 gr, CoCl₂.6H₂O 0,005 gr, CuSO₄.5H₂O 0,005

gr, Larutkan bahan satu persatu kedalam 50 ml aquades, Tambahkan volume menjadi 100 ml, masukkan dalam botol steril, Beri label STOK IV, tanggal pembuatan dan konsentrasi.

e. Stok V (Sebanyak 100 ml, 10 kali konsentrasi) Timbang FeSO4.7H2O 0,28 gr dan Na2EDTA 0,37 gr, Larutkan bahan Na2EDTA kedalam 25 ml aquades, secara terpisah, Larutkan bahan FeSO4.7H2O ke dalam 25 ml aquades, secara terpisah, Campurkan kedua bahan di atas setelah masing-masing larut, Jika masih susah larut, tambahkan HCl setetes demi setetes sambil dipanaskan

dengan suhu antara 40 – 60 °C, Tambahkan volume menjadi 100 ml, masukkan dalam botol steril. Beri label STOK V, tanggal pembuatan dan konsentrasi.

4

B. Pembuatan Media Inokulasi (Penanaman Awal)

Bahan :

Larutan Stok I, Stok II, Stok III, Stok IV dan Stok V Stok Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) BAP 5 ppm (dibuat terpisah) Gula Pasir 30 gr. Agar 7 gr. Aquades Steril HCL NaOH Karet Alumunium foil/Penutup Botol

Alat :

Sendok Beaker Glass Timbangan Analitik Hot Plate Pipet + Bola Botol kultur Steril Magnetic Stirer Pengukur pH Autoclave + Kompor Gas Penghitung waktu

Cara pembuatan :

a. Pipet larutan stok sebanyak 10 ml kecuali stok IV hanya 2,5 ml (untuk pembuatan 1 liter media),

b. Masukkan ke dalam beaker glass 100 ml yang telah dibilas dengan aquades,c. Siapkan beaker glass 1000 ml, bilas dengan aquades,d. Isi dengan aquades sebanyak 500 ml,e. Masukkan stok I, II, III, IV, dan V, tambahkan aquades sampai mendekati 1000 ml,f. Aduk dengan magnetic stirer atau pengaduk dari kaca,g. Masukkan gula,h. Lakukan pengecekan pH antara 5,6 - 5,8. Jika kurang dari 5,6 – 5,8 tambahkan NaOH

sedikit demi sedikit sampai pH yg dibutuhkan tercapai. Jika melebihi tambahkan HCL sampai tercapai pH yang diinginkan,

i. Letakkan beaker glass di atas hot plate atau kompor gas,j. Masukkan agar, panaskan hingga mendidih,k. Masukkan kedalam botol kultur sebanyak 10 ml/botol (atau sesuai dengan kebutuhan

dan atau sesuai ukuran botol).l. Tutup dengan aluminium foil dan karet.m. Sterilisasi dengan autoclave, selama 15 menit setelah bunyi pertama.n. Simpan media.

5

C. Pembuatan Media Penumbuhan Tunas

Bahan :

Larutan Stok I, Stok II, Stok III, Stok IV dan Stok V Stok Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) BAP 2 ppm. Gula Pasir 20 gr. Agar 7 gr. Aquades Steril HCL NaOH Karet Aluminium foil

Alat :

Sendok Beaker Glass Timbangan Analitik Hot Plate Pipet + Bola Botol kultur Steril Magnetic Stirer Pengukur pH Auroclave + Kompor Gas Penghitung waktu

Cara pembuatan :

a. Pipet larutan stok sebanyak 10 ml kecuali stok IV hanya 2,5 ml (untuk pembuatan 1 liter media),

b. Pipet larutan stok Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) BAP sebanyak 2 ml.c. Masukkan ke dalam beaker glass 100 ml yang telah dibilas dengan aquades,d. Siapkan beaker glass 1000 ml, bilas dengan aquades,e. Isi dengan aquades sebanyak 500 ml,f. Masukkan stok I, II, III, IV, dan V, tambahkan aquades sampai mendekati 1000 ml,g. Aduk dengan magnetic stirer atau pengaduk dari kaca,h. Masukkan gula,i. Lakukan pengecekan pH antara 5,6 - 5,8. Jika kurang dari 5,6 – 5,8 tambahkan NaOH

sedikit demi sedikit sampai pH yg dibutuhkan tercapai. Jika melebihi tambahkan HCL sampai tercapai pH yang diinginkan,

j. Letakkan beaker glass di atas hot plate atau kompor gas,k. Masukkan agar, panaskan hingga mendidih,l. Masukkan kedalam botol kultur sebanyak 10 ml per botol (atau sesuai dengan

kebutuhan dan atau sesuai ukuran botol).m. Tutup dengan aluminium foil dan karet.n. Sterilisasi dengan autoclave, selama 15 menit setelah bunyi pertama.o. Simpan media.

D. Pembuatan Media Penumbuhan Akar

6

(Jika selama penumbuhan tunas belum tumbuh akar, tapi biasanya secara otomatis akar akan tumbuh selama proses penumbuhan tunas)

Bahan :

Larutan Stok I, Stok II, Stok III, Stok IV dan Stok V Stok Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) NAA 2 ppm. Gula Pasir 20 gr. Agar 7 gr. Aquades Steril HCL NaOH Karet Aluminium foil

Alat :

Sendok Beaker Glass Timbangan Analitik Hot Plate Pipet + Bola Botol kultur Steril Magnetic Stirer Pengukur pH Auroclave + Kompor Gas Penghitung waktu

Cara pembuatan :

a. Pipet larutan stok sebanyak 10 ml kecuali stok IV hanya 2,5 ml (untuk pembuatan 1 liter media),

b. Pipet larutan stok Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) NAA sebanyak 2 ml.c. Masukkan ke dalam beaker glass 100 ml yang telah dibilas dengan aquades,d. Siapkan beaker glass 1000 ml, bilas dengan aquades,e. Isi dengan aquades sebanyak 500 ml,f. Masukkan stok I, II, III, IV, dan V, tambahkan aquades sampai mendekati 1000 ml,g. Aduk dengan magnetic stirer atau pengaduk dari kaca,h. Masukkan gula,i. Lakukan pengecekan pH antara 5,6 - 5,8. Jika kurang dari 5,6 – 5,8 tambahkan NaOH

sedikit demi sedikit sampai pH yg dibutuhkan tercapai. Jika melebihi tambahkan HCL sampai tercapai pH yang diinginkan,

j. Letakkan beaker glass di atas hot plate atau kompor gas,k. Masukkan agar, panaskan hingga mendidih,l. Masukkan kedalam botol kultur sebanyak 10 ml per botol (atau sesuai dengan

kebutuhan dan atau sesuai ukuran botol).m. Tutup dengan aluminium foil dan karet.n. Sterilisasi dengan autoclave, selama 15 menit setelah bunyi pertama.o. Simpan media.

E. STERILISASI EKSPLAN PISANG

Bahan:

7

Air bersih (mengalir)

Twin 20

Bakterisida (Agrept)

Fungisida (Benstar)

Bayclin 30%

Alkohol 70%

Betadine

Alat:

Beaker Glass

Pinset

Pisau

Scalpel+Blade

Cara Kerja:

1. Cuci eksplan dengan air mengalir sambil dipotong dan dikelupas sampai ukuran menjadi

kecil (sekitar 3 - 5 cm tergantung ukuran awal eskplan),

2. Rendam dengan detergent 1-2 sendok makan dalam 1000 ml air biasa, kocok selama 10

menit, bilas 3 kali dengan air biasa,

3. Rendam eksplan dengan Twin 20 sebanyak 3 ml dalam 100 ml akuades selama 20 menit,

bilas 3 kali dengan akuades,

4. Rendam eksplan dengan bakterisida 2 gr/L selama 1 jam, bilas 3 kali dengan akuades,

5. Rendam eksplan dengan fungisida 2 gr/L selama 1 jam, bilas 3 kali dengan akuades,

6. Rendam eksplan dengan bayclin 30% selama 30 menit, bilas 3 kali dengan akuades,

7. Rendam eksplan dengan bayclin 20% selama 20 menit, bilas 3 kali dengan akuades,

8. Rendam eksplan dengan alkohol 70% selama 1 menit, bilas 3 kali dengan akuades,

(Sterilisasi bagian ini dilakukan di dalam LAFC)

9. Kelupas kembali eksplan sampai kecil (sekitar 1 – 2 cm tergantung ukuran awal eksplan),

(Sterilisasi bagian ini dilakukan di dalam LAFC)

10. Pindahkan eksplan ke beaker glass baru,

11. Rendam eksplan dengan betadin secukupnya tanpa air selama 15 menit, bilas 3 - 5 kali

dengan akuades,

12. Eksplan siap ditanam dalam media kultur.

F. PENANAMAN AWAL (INOKULASI PISANG)

Bahan: Media MS

8

Alkohol Aquades Spitus Eksplan Pisang

Alat: LAFC Handsprayer Scalpel + Blade Bunsen Petridish Pinset Lap Tissue

Cara Kerja :1. Sebelum dilakukan penanaman, LAFC harus sudah disterilkan minimal selama 1 jam

dengan cara menghidupkan lampu UV dan blower,2. Semprot LAFC dengan alcohol 70% sebelum semua bahan dan alat tanam dimasukkan,3. Semprot bahan dan alat dengan alcohol 70% sebelum dimasukkan ke dalam LAFC,4. Susun bahan dan alat secara benar dan rapi (lihat gambar),

a d f

g h

b

c

Keterangan:a. Media Tanamb. Akuadesc. Ekspland. Lampu Bunsene. Alat Tanamf. Cawan Petri (Petridish)g. Bahan sterilisasi

5. Hidupkan lampu bunsen,6. Semprot petridish dengan alcohol 70% dan bakar di atas lampu Bunsen,7. Bakar scalpel+blade dan pinset,8. Ambil eksplan pisang dari dalam beaker glass dengan pinset,9. Letakkan ke dalam petridish,10. Kelupas eksplan dengan scalpel+blade dan pinset sampai ukuran ½ cm – 1 cm,11. Letakkan kembali scalpel+blade dan pinset ke dalam gelas berisi alcohol,12. Ambil botol kultur berisi media tumbuh, buka alumunium foil di atas lampu Bunsen,13. Bakar pinset di atas lampu bunsen,14. Ambil eksplan dari petridish dan masukkan eksplan ke dalam botol kultur berisi media

tumbuh,15. Tuangkan ZPT BAP 5 ppm secukupnya (sekitar 10 ml) ke dalam botol kultur yang telah

ditanami eksplan, 16. Tutup botol dengan aluminium foil yang sudah dibakar sebelumnya.17. Ikat dengan karet dan simpan di ruang inkubasi.

G. AKLIMATISASI PLANTLET PISANG

Bahan

9

Plantlet, pasir, media eceng gondok, bakterisida, fungisida, hormon penumbuh akar (Rapid Root).

Alat

Bak plastik, drum bekas, kompor gas, gunting, plastik bening, karet pengikat, sprayer.

Prosedur:

A. Cara persiapan media aklimatisasi1. Campurkan pasir dan media eceng gondok dengan perbandingan 3 : 4, dan aduk secara

merata.2. Media campuran tersebut disterilisasi dengan cara dikukus dalam drum bekas berisi air

dan dipanaskan dengan menggunakan kompor gas selama 6 jam.3. Setelah dingin media ditempatkan pada bak plastik, banyaknya media adalah sepertiga

tinggi bak plastik.4. Semprot media dalam bak plastik tersebut dengan bakterisida, kemudian diamkan

selama sehari sebelum dipakai.B. Cara aklimatisasi.1. Siapkan plantlet dalam botol kultur yang akan diaklimatisasi. Botol kultur yang

tekontaminasi jamur atau bakteri dipisahkan dari yang steril atau tidak terkontaminasi.2. Aklimatisasi dilakukan pada plantlet yang tidak terkontaminasi terlebih dahulu, setelah

selesai baru aklimatisasi plantlet yang kontaminasi.3. Siapkan bak aklim yang sudah berisi media. Aduk media sambil disemprot dengan air

hingga media lembab basah merata.4. Plantlet yang akan diaklimatisasi dikeluarkan dari botol kultur, kemudian cuci di bawah

air mengalir untuk membuang agar media yang menempel.5. Plantlet yang bergerombol dipisahkan dengan menggunakan gunting, kemudian

direndam dalam larutan fungisida selama 1 menit.6. Plantlet kemudian ditanam di media aklim yang telah disiapkan, dengan terlebih dahulu

mencelupkan bagian akar pada larutan hormon penumbuh akar.7. Penanaman dikelompokkan berdasarkan tinggi plantlet, plantlet yang tinggi ditanam

dalam bak yang terpisah dengan plantlet yang kecil.8. Bak plastik yang sudah penuh ditanami plantlet, disemprot dengan air hingga menjadi

lembab basah, setelah itu bak ditutup dengan plastik bening yang diikat dengan karet.9. Pada bak aklim diberi label jenis tanaman dan tanggal aklimatisasi.10. Bak plastik disimpan dalam sungkup plastik besar yang dinaungi paranet 55% - 75%

selama 3 - 4 minggu.

H. PROSEDUR PEMBESARAN BENIH PISANG

10

Bahan

Plantlet pisang pasca aklimatisasi, polibag, media tanah, arang sekam, fungisida Orthocide dan bakterisida Agrept, pupuk daun, Decis, dan pupuk urea.

Alat

Sprayer, sungkup plastik, selang air plastik, gembor, sprinkle,

Prosedur:

A. Pembuatan media polibag

1.Komposisi media polibag adalah tanah dan arang sekam 3 : 1.2.Ukuran polibag 15 x 15 cm.3.Setelah campuran media dimasukkan ke dalam polibag, minimal sehari sebelum

digunakan media disemprot dengan campuran larutan fungisida Orthocide 2 gr/l dan bakterisida Agrept 2 gr /l.

B. Cara penanaman ke polibag

1. Plantlet dicabut dari media aklim secara perlahan-lahan tanpa mematahkan akarnya.2. Lubangi media di polibag, dan masukkan plantlet kedalam lubang, diusahakan supaya

akar tidak terlipat, padatkan media di sekitar tunas.3. Simpan bibit di polibag tersebut di bawah sungkup, kemudian siram dengan

menggunakan gembor, jangan menggunakan nozzel semprot.4. Bibit di polibag tersebut disimpan di bawah sungkup selama 1-2 minggu, disiram hanya

pada pagi hari saja, sungkup diberi label tanggal penanaman.5. Plantlet yang belum berakar ditanam ulang di bak aklim.6. Selama dalam sungkup, bibit disemprot dengan pupuk daun sebanyak 2 kali seminggu.

C. Cara pembesaran bibit di polibag hingga menjadi siap salur1. Bibit di polibag yang sudah disungkup selama 2 minggu, dibiarkan di bawah paranet

55% selama 1-2 minggu.2. Bibit yang sudah tumbuh daun baru, dipindahkan ke guludan (bedengan) di lahan

terbuka tanpa paranet. 3. Setiap 2 minggu sekali bibit di beri pupuk Urea setengah sendok teh per polibag bibit

pisang.4. Apabila terserang Hama Ulat atau serangga, bibit disemprot dengan Decis 2 ml/ltr.

CATATAN PENTING:PERBANYAKAN TANAMAN MELALUI KULTUR JARINGAN PADA PRINSIPNYA HARUS SERING MENCOBA, TIDAK PERLU TAKUT UNTUK TERUS MENCOBA WALAUPUN HARUS SERING MENGALAMI KEGAGALAN. KOMODITAS PISANG HANYALAH SALAH SATU CONTOH, SILAHKAN DICOBA UNTUK BEBERAPA KOMODITAS TANAMAN YANG LAIN. SEMOGA SUKSES.....!!!!!

11