PENGARUH POLIMORFISME GEN APOLIPOPROTEIN E (APOE) PADA KEJADIAN NEFROPATI DIABETIK PENDERITA DM TIPE 2

PENGARUH POLIMORFISME GEN APOLIPOPROTEIN E (APOE) TERHADAP KEJADIAN NEFROPATI DIABETIK PENYANDANG DM TIPE 2 PADA ETNIK MELAYU DI 3 RS DI PALEMBANG KOMARIATUNNPM : 1006783094KKKomariatunNPM : 1006783094

PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangPrevalensi DM menurut WHO- Tahun 2003: 193 juta- Tahun 2025: 333 juta- DMT2: 90%

Komplikasi mikrovaskular : retinopati, neuropati, nefropati

Definisi ND : DM albuminuria persisten, 5-15 tahun

ND pada DMT1 : 30%, DMT2 : 25%-40%

1. Schalkwijk, Biochem Soc, 2005. 2. Adler, Kidney Int, 2003.3. Ignatius, E Scien Res, 2009. 4. Lindner, Kidney Int, 2003

2

Insiden ND : - USA meningkat dalam 10 tahun (150%) - Indonesia : urutan ketiga (16,10%) setelah GN (30,10%), PNC (18,51%) - Sumatera Selatan : urutan keempat (12,17%), GN (29,28%), nefrosklerosis (22,37%), uropati obstr. (21,40%).

Beberapa faktor yang memengaruhi ND1. Faktor metabolik2. Faktor hemodinamik3. Faktor genetik7. Gross, Diab Care, 2005. 8. Ali, Konas Pernefri, 2002. 9. Rippin, BP & Rest Clin Endoc, 2001.

3

Gb. 2.3. Patogenesis Nefropati Diabetik

33. Brownlee, William textbook of Endoc, 2008

Faktor genetik faktor penting dalam perkembangan dan progresivitas ND.DCCT : 35% DM ND tanpa memperhitungkan tingkat kontrol glukosa darah.

Hiperkolesterolemia pada ND determinan utama penurunan fungsi ginjal peningkatan kadar lipoprotein kaya trigliserida.

Polimorfisme gen APOE memengaruhi metabolisme LP DM.13. Schena, JASN, 2005. 16. P.P. Singh, Diab Res & Clin Pract, 2006. 17. Sung-Kyu, NDT, 1999. 20. Kwon, Diab Res & Clin Pract, 2007

APOE penanda genetik penting dislipidemia CAD mekanisme patofisiologik sama antara glomerulosklerosis dan aterosklerosis.

APOE merupakan protein utama VLDL, kilomikron, sisa kilomikron, IDL dan HDL.

APOE ligand dari reseptor LDL dan LRP.

Polimorfisme gen APOE perubahan struktur dan fungsi protein. 21. Eto, AJKD, 2002. 22. Kimura, AJKD, 1998

Mekanisme timbulnya ND akibat polimorfisme gen APOEbelum jelas, kemungkinan :

1. Kelainan metabolisme lipid yang berhubungan dengan polimorfisme gen APOE

2. Efek langsung protein APOE terhadap sel mesangial ginjal.26. Chowdhury, Diabetes, 1998.

Beberapa penelitian yang mendukung polimorfisme gen APOE kaitannya dengan ND :PenelitiTahunTempatPenelitianSampelHasilLaakso

Ilhan

Werle

Kimura

Feng J

Eto

Leiva-

-

-

-

-

-East Finland

Firat Med

Jerman

Jepang

East Asian

Western Japan

Talca City Studi potong lintang

Studi prospektif

Meta analisa 16 studi kasus-kontrol

-

-DMT2 139, non DM 64

DMT2 nefropati (n=37), tanpa (71), kontrol (46)

DMT1 162DMT2 124

DMT2 178, stabil 97, dialisis 81

158 DMT2

DMT2 ginjal (56), tanpa (29)

Fenotip APOE E4/4 dan E3/4 modulasi risiko CAD pts DMT2

Alel 4 merupakan faktor risiko prognostik perkembangan ND

Polimorfisme APOE memengaruhi kadar lipoprotein serum pada pts DMT1 dan DMT2

Polimorfisme APOE - dengan progresivitas ND

Alel 2 merupakan faktor risiko ND

APOE 2 - faktor positif dan APOE 4 - faktor negatif ND

Alel 4 merupakan faktor protektif ND

PenelitiTahunTempatPenelitianSampelHasilShcherbak

Onuma

1997

1986-1988

Rusia

Kaukasia

Studi kasus-kontrol

Studi kasus-kontrol

-DMT1, 74 dg ND dan 92 tanpa ND

DMT1 proteinuria (n=41), mikro (31), makro (74)

Hubungan antara gen APOE dengan ND lemah atau sedang

Genotip APOE tidak berhubungan dg perkembangan ND

Beberapa penelitian yang tidak mendukung :

Perbedaan hasil studi dikarenakan :

1. Distribusi frekuensi polimorfisme gen APOE berbeda pada group etnik yang berbeda.

2. Definisi ND yang berbeda antar studi dan perbedaan pada metode untuk mendeteksi albuminuria.

3. Beberapa studi bukan prospektif tetapi potong lintang.4. Variasi genetik memengaruhi perkembangan ND.

1. Gen APOE mempunyai hubungan fungsional langsung dengan patogenesis ND. Sampai saat ini mekanisme timbulnya ND akibat polimorfisme gen APOE belum jelas diketahui, kemungkinan karena kelainan metabolisme lipid yang berhubungan dengan polimorfisme gen APOE atau karena efek langsung APOE terhadap sel mesangial ginjal. Gangguan metabolisme lipid yang dihubungkan dengan APOE 2 menyebabkan kerusakan ginjal karena APOE 2 berkontribusi terhadap peningkatan lipoprotein kaya trigliserida.

1.2 Rumusan Masalah

2. Berbagai hasil penelitian polimorfisme gen APOE terkait hubungannya dengan ND hasilnya tidak konsisten .

3. Penelitian genetik sangat dipengaruhi oleh faktor ras atau etnik. Belum ditemukan publikasi penelitian mengenai polimorfisme gen APOE pada ND penyandang DMT2 terhadap etnik Melayu di Indonesia.

1.3 Pertanyaan Penelitian

1. Apakah terdapat peningkatan frekuensi alel gen APOE 2 pada penyandang DMT2 dengan ND.

2. Bagaimana pengaruh alel gen APOE 2 terhadap terjadinya perubahan profil lipid pada penyandang DMT2.

1.4 Hipotesis Penelitian

1. Terdapat peningkatan frekuensi alel gen APOE 2 pada penyandang DMT2 dengan ND

2. Terdapat pengaruh alel gen APOE 2 terhadap perubahan profil lipid pada penyandang DMT2

1.5 Tujuan Penelitian

1.5.1 Tujuan Umum

Mengetahui pengaruh polimorfisme gen APOE 2 terhadap kejadian ND penyandang DMT2 pada etnik Melayu yang berobat atau dirawat di 3 RS di Palembang.

1.5.2 Tujuan Khusus

1. Mengetahui peningkatan frekuensi alel gen APOE 2 pada penyandang DMT2 dengan ND

2. Menganalisis pengaruh alel gen APOE 2 terhadap terjadinya perubahan profil lipid pada penyandang DMT2.

16

1.6 Manfaat Penelitian

1.6.1Manfaat Ilmiah1. Memberikan informasi landasan ilmiah tentang hubungan antara polimorfisme gen APOE 2 dengan kejadian ND pada penyandang DMT2.

2. Memberikan sumbangan pemahaman peran gen APOE 2 dalam patogenesis ND pada penyandang DMT2 terutama dengan adanya perubahan profil lipid.

1.6.2Manfaat Klinis

Sebagai upaya preventif primer terjadinya komplikasi DM dengan memberikan terapi yang lebih tepat pada penyandang DMT2 dengan polimorfisme gen APOE 2 di masa yang akan datang.

TINJAUAN PUSTAKA

Definisi ND : sindrom klinis pada panyandang DM yang ditandai dengan albuminuria persisten pada 2 dari 3 pemeriksaan selama lebih dari 3 bulan (>300 g/mg kreatinin), dan tidak ditemukan bukti klinis atau laboratorium penyakit ginjal dan saluran urin lain selain glomerulosklerosis diabetik.

29. Powers, Harrisons Pinciples of Int Med, 2008

Gb. 2.1. Perjalanan penyakit nefropati diabetik

37. Fioretto, Semin Nephrol, 2007

Tabel 2.2. Kategori LFG dan Albuminuria - KDIGO 2012

Prosedur diagnostik dan skrining NDDeteksi mikroalbuminuria dilakukan secara kualitatif, semi kuantitatif dan kuantitatif :- Albuminuria mikro kualitatif prinsip protein error of pH indicator - Albuminuria mikro semikuantitatif - Micral test- Albuminuria mikro kuantitatif - ELISA, RIA dan imunoturbidimetrik

Skrining : - DMT1 : 5 tahun setelah diagnosis - DMT2 : saat diagnosis 34. Pedoman Pemeriksaan Lab untuk Penyakit DM, 2005

Gb. 2.4 Struktur Lipoprotein

23

Tabel 2.7 Karakteristik lipoprotein plasma

Gb. 2.5 Jalur Endogen Metabolisme Lipoprotein

43. Durrington, Hyperlipidemia, 2005.

Gb. 2.6 Jalur Eksogen Metabolisme Lipoprotein 43. Durrington, Hyperlipidemia, 2005.

Gen Apolipoprotein E

ID gen APOE 348, primary source HGNC:HGNC:613Nama lain : AD2, LPG, LDLCQ5Lokasi gen : 19q13.2, melekat pada kromosom 19-NC_000019.10Panjang gen 3590pb, mRNA 1154 pbTerdiri dari 4 ekson dan 3 intron. Ekson 1, 2 dan 3 kecil ekson 4 besar : 17680867Ekson 1 terdiri 35 pb, ekson 2 : 61 pb , ekson 3: 193 pb dan ekson 4: 860 pb.

23. MCY Ng, Clin Genet, 2006. 46. Kolovou, Angiology, 2004.

Peran APOE pada Metabolisme Lipoprotein Mentranspor dan mengantar lipid dari jaringan atau sel ke jaringan atau sel lainnya.

Mengatur metabolisme baik trigliserida endogen maupun kolesterol VLDL dengan cara mengirim mereka baik ke sel-sel ekstrahepatik (via VLDL) maupun ke sel-sel hepar (melalui sisa kilomikron) .50. Scherbak, BMC Med Gen, 2001.

Polimorfisme gen APOEPolimorfisme gen APOE dihubungkan dengan predisposisi genetik untuk timbulnya ND.

Pengaruh polimorfisme gen APOE pada metabolisme sisa kilomikron dipengaruhi oleh level kontrol glikemik.

Kontrol glikemik jelek abnormalitas LP plasma akumulasi sisa kilomikron.

48. Mahley, Annual Review, 2000.

Gb. 2.9 Ekson APOE dan APOC1 dan sisi polimorfik 48. Mahley, Annual Review, 2000.

48. Mahley, Annual Review, 2000.

Peran APOE dalam patogenesis NDPolimorfisme gen APOE - gangguan metabolisme lipid.

Frekuensi alel 2 - DMT2 dengan nefropati (7,2%) ,gagal ginjal (9,7%), tanpa nefropati (2,6%).

Isoprotein E3 pada posisi cys112 dan arg158, menjadi cys pada kedua sisi isoprotein E2 dan arg pada kedua sisi E4 - sehingga menyebabkan perubahan fungsi dari APOE.

Perbedaan utama antara asam amino terletak pada gugus rantai sampingnya.21. Eto, AJKD, 2002. 22. Kimura, AJKD, 1998.

Polimorfisme gen APOE 2 : arg158 (asam amino polar dengan muatan positif) menjadi cys158 (non polar hidrofobik) - perubahan pada ikatan reseptor APOE 2 afinitas lebih rendah terhadap reseptor LP akumulasi LP sisa yang berasal dari katabolisme parsial LP kaya TG peningkatan LP kaya TG dan VLDL.

APOE 4 - cys112 menjadi arg112 afinitas lebih tinggi terhadap reseptor LP penurunan level TG, meningkatkan kolesterol total dan LDL.22. Kimura, AJKD, 1998.

EXPERIMENTAL STRATEGIESFOR DNA AMPLIFICATIONBlood Samples

DNA extraction

PCR amplification

Analysis

Results (PCR Product)ElectrophoresisVisualization

34

ANNEALING 65C 1 minEXTENSION 72C 1 min

35 CYCLES

DENATURATION 95C 1 minDENATURATION 95C 5 minPrimer-5-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3Reverse- 5-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3

35

RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISMIncubation with HhaI 37oC for 3 hours VisualizationElectophoresisAnalysiswt/wtwt/mtmt/mt

PCR Product of promotor region

36

Ukuran dari fragmen HhaI divisualisasi menggunakan DNA ladder.

Genotip 2/2 - 91, 83 dan 35 pb fragmen. Genotip 3/3 - 91, 48 dan 38 pb fragmen, Genotip 4/4 - 72, 48, 35 dan 33 pb fragmen. Genotip 2/3 91, 81, 48 dan 38 pb fragmen.Genotip 2/4 91, 83, 72, 48 dan 35 pb fragmen.Genotip 3/4 91, 72, 48 dan 38 pb fragmen.

37

Gb. 2.16 Deteksi genotip apoE dengan PCR-RFLP

58. Hixson, J of Lipid Res, 1990.

Gb. 2.14 Proses Sanger Method dye dideoxy terminator

Gb. 2.12 Struktur Molekul dNTP dan ddNTP

Gb. 2.13 Proses Cycle Sequencing

Gb. 2.15 DNA dan sekuens protein yang menyandi isoprotein apoE dan lokasi sisi pemecahan HhaI58. Hixson, J of Lipid Res, 1990.

Gb. 2.18 Kode Genetik Universal

Etnik MelayuEtnik di dunia 5 kelompok : Kaukasia, Mongolia, Negroid, Indian dan Melayu-Polinesia.

T. S. Raffles : Melayu tidak hanya sekadar kelompok etnis Melayu, tetapi merupakan etnik yang tinggal di kepulauan Asia Tenggara. Terbentang antara Indocina dan Australia, tdr 20.000 pulau.

Etnik Melayu Indonesia di Sumatera Selatan: orang yang berasal dari suku Palembang, OKI, MUBA, Komering, Linggau, Lahat dan Sekayu. Tidak melakukan kawin silang 3 generasi keatas. 60. Wan Teh, Dunia Melayu, 2000.

Akumulasi MES >>>DIABETES MELITUS TIPE 2GEN terkait ND : HLA,ACE, AGT,ATIR,ALR2,HSPG2,APOE dllMETABOLIKHEMODINAMIKMatriks ekstraselulerDegradasi matriks Permeabilitas vaskuler >>>ProteinuriaLipoprotein remnant dan TrigliseridaAkumulasi lipid di sel mesangialPerubahan pada matriks mesangial

HIPERGLIKEMIAGEN APOEAliran / Tekanan >>AGEsPolimorfisme GEN APOEGangguan Profil LipidEfek langsung sel mesangialAktivasi PKCSintesis DAGStres OksidatifGlomerulosklerosis danFibrosis InterstisialNefropati Diabetik

METODE PENELITIANJenis Penelitian : kasus kontrol

Tempat dan Waktu Penelitian :Di 3 RS di Palembang8 bulan : Januari 2014-Agustus 2014

Populasi dan Sampel- Populasi terjangkau : semua penyandang DMT2 yang berobat atau dirawat di 3 RS di Palembang yang memenuhi kriteria penyertaan- Kasus : penyandang DMT2 dengan ND- Kontrol : penyandang DMT2 tanpa ND

Besar SampelN = Z/2 + Z V PQ 2 (P 1/2) P = R Q = 1-P (1 + R) Bila OR untuk 2 = 4,0 ; Z = 1,96 ; Z = 1,282; N = 24,76 4 = 3,0 ; Z = 1,96 ; Z = 1,282; N = 37,70

Kasus : 42 orang, kontrol : 42 orang

61. Zhang, Zhejiang J Clin Med, 2007.

Kriteria Pemilihan Sampela. Kelompok kasus :- Laki-laki atau wanita berumur 40-65 tahun- Etnik Melayu yang berobat di 3 RS di Palembang - Penyandang DMT2 dengan ND - Bersedia mengikuti penelitian - informed consent.

b. Kelompok kontrol :- Laki-laki atau wanita berumur 40-65 tahun- Penyandang DMT2 tanpa ND- Menderita DM 5 tahun - Bersedia mengikuti penelitian - informed consent.

Kriteria penolakan :

Penyandang DMT2 tanpa makroalbuminuria.Terdapat kemungkinan penyebab gangguan fungsi ginjal lain seperti riwayat glomerulonefritis, infeksi kronis dan batu saluran kemih.Penyandang dengan familial hyperlipidaemia, liver disease dan thyroid disease.

Teknik Pengambilan Sampel Sampel diambil dengan teknik consecutive sampling.

NoVariabelDefinisiCara & Alat UkurSkala1Nefropati DiabetikSind. Klinis dg makroalbumiuria, urin sewaktu 300 g/mgCobas Integra 400Nominal2. Polimorfisme gen APOE, 2,3, 4PCR, RFLP, SekuensingNumerik3.Profil Lipid Hipertrigliseridemia (TG > 150 mg/dL)Cobas Integra 400Nominal4HbA1CJumlah protein hemoglobin darah yang berikatan secara irreversibel dg glukosaHPLCNumerik5.Status Gizi (IMT)Hasil pembagian BB dalam kg dengan kuadrat TB dalam meter persegiAlat pengukur BB dan TB. Obes bila IMT >25Nominal6. TD Nilai yang didapat melalui pengukuran TD A. Brachialis.Sphygmomanometer air raksa (Hipertensi bila TDS 140 dan atau TDD 90 mmHg)Nominal

51

Analisis StatistikProgram SPSS 20.0 for window - distribusi frekuensi alel gen APOE pada kelompok kasus dan kelompok kontrol.

Hubungan polimorfisme gen APOE dengan kejadian ND digunakan uji x2 , Odds Ratio (OR), batas kepercayaan 95% dan = 0,05.

Analisis multivariat regresi logistik

Data akan ditampilkan secara deskriptif dalam bentuk narasi, tabel prevalensi dan presentase serta mean SD.

Populasi penelitianPenjelasan tentang penelitianInformed consentAnamnesis, pemeriksaan fisik, laboratorium Kelompok KasusKelompok KontrolKriteria penyertaanDMT2 dengan makroalbuminuriaDMT2 dengan normoalbuminuriaDiambil sampel darah vena sebanyak 7 ml Ekstraksi DNA , PCR-RFLP, Sekuensing2 ml darah dengan EDTA untuk pemeriksaan HbA1C dan analisis genetik

5 ml darah tanpa EDTA untuk pemeriksaan glukosa darah puasa, ureum, kreatinin dan profil lipidAnalisis Data

HASIL PENELITIANTabel 4.1 Karakteristik dasar subjek penelitian

Tabel 4.2 Karakteristik klinis subjek penelitian

Gb. 4.1 Hasil visualisasi PCR-RFLP DN

200 100 91 81 50 43 38

Gb. 4.2 Hasil visualisasi PCR-RFLP DM tanpa Nefropati

200

100 91 81 50 38 33

57

Tabel 4.3 Frekuensi genotip, alel dan carrier gen APOE

58

Gb. 4.3 Distribusi alel gen APOE

Gb. 4.4 Distribusi frekuensi carrier gen APOE

Tabel 4.4 Perbedaan profil lipid penyandang ND

Tabel 4.5 Perbedaan profil lipid penyandang DM tanpa Nefropati

Tabel 4.6 Faktor yang memengaruhi perkembangan ND

Tabel 4.6 Faktor yang memengaruhi perkembangan ND

Tabel 4.7 Hasil akhir analisis multivariat

Gb. 4.5 Hasil Sekuensing gen APOE

Analisis hasil Sekuensing 110 115CysE3 GAC GTG TGCGGC CGC CTGE4 CGC Arg

155 160 ArgE3 CTG CAGAAG CGC CTG GGA TGCE2 Cys

PEMBAHASAN5.1 Gambaran Umum Subjek Penelitian

- Usia, jenis kelamin, BB, TB tidak bermakna.- Kyu Ha usia, jenis kelamin, IMT, HbA1c dan profil lipid tidak bermakna- Lama DM p=0,041, lama DM memengaruhi ND- IMT p=0,043, IMT pada kontrol > kasus. DMT2 sering terjadi pada obes atau sind. metabolik- Glukosa darah puasa, HbA1c, profil lipid dan TDS tidak berbeda.

- Leiva usia lebih muda pada kontrol. IMT, TD, HbA1c, kolesterol total, HDL, LDL dan kreatinin serum berbeda bermakna- Araki usia dan profil lipid tidak berbeda, jenis kelamin, lama DM, IMT, TD, HbA1c dan TG berbeda bermakna.- TDD p= 0,011, hipertensi terjadi pada 60% penyandang DM, salah satu faktor ND.- Hb, ureum, kreatinin dan eGFR berbeda bermakna - Kwang Kwon HbA1c dan kreatinin serum berbeda.

5.2. Pengaruh polimorfisme gen APOE pada ND- Genotip APOE E2/2, E2/3, E3/3, E3/4 dan E4/4 tidak berbeda antara kontrol dan kasus. - E2/4 tidak ditemukan pada kasus dan kontrol.- E4/4 tidak ditemukan pada kasus.- Ilhan E4/4 dan E2/4 tidak ada, - Werle - E4/4 tidak ditemukan.- Leiva distribusi genotip APOE tak berbeda- Kwang Kwon E3/4 pada ND 5,6%, non 20,7% (p=0,035), carrier gen 4 pada ND 5,9% dan non 22,8% - APOE 4 faktor protektif ND.

70

Lehtinen polimorfisme gen APOE modulasi komplikasi mikro dan makrovaskular pada DMT2. - alel gen 2 ND>DMT2, p=0,035 - alel gen 3 dan 4 NS

Jie Feng meta analisis alel 2 double risk ND, OR 1,85 (IK 95%, 1,49-2,29).- 4 OR 1,05 (IK 95%, 0,72-1,52)- Cina 4 faktor risiko ND- Korea, Jepang 4 faktor protektif ND

5.3. Polimorfisme gen APOE dihubungkan dengan kelainan profil lipid

- Populasi DM dislipidemia hiperkolesterolemia (51,8%), hipertrigliseridemia (54,0%) dan mixed (37,3%). - Eto kelainan lipid kontribusi terhadap perkembangan dan progresivitas ND. - Frekuensi gen APOE 2 ND (7,2%), gagal ginjal (9,7%), DMT2 (2,6%). - ND- peningkatan kadar TG-rich lipoprotein dan akumulasi lipoprotein remnants.

- Leiva - genotip E2/3 peningkatan trigliserid 2,29 mmol/L, E3/4 peningkatan kolesterol total dan LDL.

- Perbedaan profil lipid - tidak berbeda, berdasarkan alel gen APOE 2 dan 3.

- Gen APOE 2 bersifat menghambat ikatan reseptor APOE akumulasi partikel remnants yang berasal dari katabolisme lipoprotein kaya trigliserida kerusakan ginjal ND.- Gen APOE 4 meningkatkan ikatan reseptor - peningkatan metabolisme lipoprotein kaya trigliserida protektif ND

Mekanisme polimorfisme gen APOE memodulasi atau mencegah ND :- berhubungan dengan dislipidemia berupa peningkatan plasma remnants lipoprotein dan trigliserida pada carrier gen APOE 2 yang menginduksi terjadinya ND.- efek langsung protein APOE terhadap mesangial

Guan otopsi - pengecatan imunohistokemikal 51 DMT2 dan 111 kontrol histopatologikal - carrier 2 dan E3/4 hipertrofi glomerulus

APOE 2 ikatan dengan LDL 50-100 kali lebih lemah dan dengan reseptor heparin 3 dan 4 peningkatan lipoprotein kaya trigliserida dan LDL oxidized akumulasi pada sel mesangial dan makrofag.Sekresi sitokin (IL-6, PDGF, ICAM-1, TGF-, M-SCF) dan MMP peningkatan produksi matriks protein ekstra selular ekspansi mesangial.

APOE knocked out mice 6 minggu diet normal (hiperkolerolemia ringan) Western Diet (hiperkolesterolemia berat) 20 minggu injury glomerulus - ND

Faktor-faktor yang memengaruhi perkembangan ND pada DMT2- analisis bivariat alel gen APOE, hipertensi dan IMT dengan nilai p