Plasmid adalah ganda-urutan DNA beruntai umumnya melingkar yang mampu secara otomatis bereplikasi dalam sel inang.Plasmid vektor minimalistically terdiri dari asal replikasi yang memungkinkan untuk replikasi semi-independen dari plasmid dalam host dan juga memasukkan transgen. plasmid modern umumnya memiliki lebih banyak fitur, terutama termasuk "situs kloning multiple" yang meliputi overhang nukleotida untuk pemasangan menyisipkan, dan berbagai pembatasan situs konsensus enzim untuk kedua sisi insert. Dalam hal plasmid digunakan sebagai vektor transkripsi, inkubasi bakteri dengan plasmid menghasilkan ratusan atau ribuan salinan vektor dalam bakteri dalam jam, dan vektor dapat diekstraksi dari bakteri, dan beberapa situs kloning dapat dipotong oleh enzim restriksi untuk cukai masukkan seratus atau seribu kali lipat diperkuat. Ini vektor plasmid khas kurangnya transkripsi urutan penting bahwa kode untuk urutan polyadenylation dan urutan terminasi translasi pada mRNA diterjemahkan, membuat ekspresi protein dari vektor transkripsi mustahil.

Plasmid DNA secara rutin diekstraksi dan dimurnikan dari sel berbagai mikroba pada penelitiantingkat. Namun, industri manufaktur skala dengan standar menuntut kemurnian yang dituntutproduk farmasi adalah pengejaran masih dalam masa pertumbuhan, dan sedikit telah dipublikasikan padasubjek. Pendekatan umum secara keseluruhan digunakan untuk menghasilkan DNA plasmid untuk tujuanTerapi gen percobaan disajikan pada Gambar 11.10. Sebelum pembuatannya, peneliti akandibangun sebuah perumahan vektor yang sesuai gen terapeutik dan diperkenalkan ke dalamproduser mikroorganisme, seperti E. coli. pembuatan plasmid rutin skala besar kemudian memerlukanbudaya suatu batch mikroorganisme produsen oleh fermentasi, diikuti oleh ekstraksi plasmiddan pemurnian. Dalam hal ini, pendekatan yang digunakan secara keseluruhan mirip dengan pendekatan yang diambil dalammanufaktur skala besar protein terapeutik rekombinan, seperti dijelaskan dalam Bab 3.fermentasi mikroba skala Industri (pengolahan hulu) juga telah dijelaskan dalamBab 3, yang disebut pembaca. Fermentasi mempromosikan replikasi sel mikroba dansehingga biosintesis jumlah besar plasmid. Setelah fermentasi, mikrobasel-sel yang dipanen (dikumpulkan) oleh salah satu sentrifugasi atau mikrofiltrasi. Setelah resuspensiondalam volume rendah buffer, sel-sel harus terganggu dalam rangka untuk melepaskan plasmid dalamnya.Ini tampaknya paling sering dicapai dengan penambahan pereaksi lisis, yang terdiri dariNaOH dan SDS (sodium sulfat dodesil). Kombinasi pH tinggi dan tindakan deterjenmengganggu dinding sel mikroba dan membran, dengan rilis konsekuensi dari intraselularisi. Selain DNA plasmid yang diinginkan, ini campuran minyak mentah juga akan berisikan berbagaikotoran yang harus dihilangkan dengan langkah-langkah berikutnya pengolahan hilir. Terkemukakotoran meliputi:. dinding sel puing dan beberapa sel utuh;. protein;. genom DNA;. RNA;

. rendah metabolit massa molekul;

. endotoksin.Lisis Setelah selesai, langkah berikutnya dapat berakibat penambahan netralisasi tinggi garamsolusi, seperti kalium asetat. Hal ini mendorong terbentuknya agregat DNA genom(GDNA) dan kompleks SDS-protein, yang selanjutnya dapat dihilangkan dengan sentrifugasi ataufiltrasi. Plasmid kemudian dapat menjadi diri mereka sendiri diendapkan dari larutan yang dihasilkan olehpenambahan pelarut yang sesuai (biasanya baik isoproponal atau etanol). Setelah resuspension, yangpersiapan plasmid kemudian dapat dikenakan pemurnian kromatografi. Utamakontaminan kemungkinan masih ada termasuk RNA, fragmen gDNA, sobek atau plasmidvarian dan endotoksin. kromatografi filtrasi gel dapat secara efektif menghilangkan kontaminanyang berbeda secara substansial dalam bentuk / ukuran dari plasmid yang diinginkan. Ini dapat mencakup sebagian besar gDNAfragmen, RNA dan (kebanyakan) endotoksin. Hal ini juga dapat mencapai penghapusan sebagian plasmidvarian, seperti plasmid lingkaran terbuka, dari persiapan (superkoil) utama plasmid.pertukaran Ion dapat menghilangkan kontaminan protein banyak, serta RNA. Namun, gDNAdan endotoksin umumnya co-memurnikan dengan DNA plasmid.Tambahan kromatografipendekatan berdasarkan reverse-fasa dan sistem afinitas telah dikembangkan di laboratoriumskala setidaknya.Sebuah fitur signifikan dari pemurnian plasmid menggunakan kromatografi menangkap (yaitu melibatkanplasmid mengikat manik-manik kromatografi) adalah kapasitas plasmid-mengikat rendah diamati.

Ukuran pori-komersial tersedia capture media kromatografi tidak cukup besar untukmemungkinkan masuknya plasmid, membatasi mengikat pada permukaan manik. Binding kapasitas bisa,Oleh karena itu, menjadi 100 kali lipat atau lebih rendah daripada yang diamati ketika media yang sama digunakan untukmemurnikan (jauh lebih kecil) protein terapeutik (Bab 3).plasmid Purified kemudian dapat dianalisa dengan menggunakan berbagai teknik analisis. Kebebasan darimencemari asam nukleat dan / atau protein dapat dinilai elektroforesis. Endotoksin danUji sterilitas juga akan secara rutin dilakukan. DNA plasmid dimurnikan berikutnya harusdiformulasikan untuk menghasilkan sistem pengiriman non final-virus. Formulasi penelitian yang berhubungan dengan tersebutsistem tetap merupakan daerah yang memerlukan penyelidikan lebih lanjut. Kebanyakan pekerjaan dilaporkan sampai saat berhubungan denganmerumuskan dan menstabilkan sistem pengiriman gen lipoplex berbasis. Suspensi berair ini(Dan lainnya) sistem berbasis non-virus cenderung cepat agregat (dalam hitungan menit

sampai jam).Untuk menghindari masalah ini, sistem penyerahan akhir sering sebenarnya dirumuskan disamping tempat tidur pasien dalam uji klinis sebelumnya.Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi eksipien menstabilkan format yang sesuai dan formulasiberlangsung. pembekuan Wikipedia adalah sebuah pilihan, khususnya formulasi beku akan kebal terhadapagitasi-diinduksi agregasi. Namun, proses pembekuan, khususnya pembekuan lambat, disendiri menginduksi agregasi. Hal ini dapat diminimalkan dengan pembekuan kilat (misalnya dengan perendaman dalam cairannitrogen), meskipun pendekatan ini mungkin tidak membuktikan praktis pada skala industri. Selain itudari krioprotektan dapat membantu mengurangi masalah ini dan penelitian awal menunjukkan bahwa berbagaigula (misalnya glukosa, sukrosa dan trehalosa) menunjukkan beberapa potensi dalam hal ini. jalan lainsedang diselidiki berkaitan dengan generasi akhir produk beku-kering. Sekali lagi isu-isu, sepertiyang (relatif) pembekuan lambat proses karakteristik skala industri beku-Pengering, menyulitkanmencapai tujuan ini dalam praktek.

A bakteriofag ('bakteri' dari dan phagein φᾰ�γεῖν Yunani "makan") adalah salah satu dari sejumlah virus yang menginfeksi bakteri. Bakteriofag adalah salah satu entitas biologis yang paling umum di Bumi [1] Istilah. Ini umumnya digunakan dalam bentuk singkat, fag.

Biasanya, bakteri terdiri dari protein kapsid luar melampirkan materi genetik. Bahan genetik dapat ssRNA, dsRNA, ssDNA, atau dsDNA ('ss-' atau 'ds-' awalan menunjukkan untai tunggal atau ganda-untai) bersama dengan pengaturan baik melingkar atau linier. Bakteriofag yang jauh lebih kecil daripada bakteri mereka menghancurkan.

Fag diperkirakan menjadi entitas yang paling luas dan beragam dalam biosfer [2]. Fag yang mana-mana dan dapat ditemukan di semua waduk dihuni oleh tuan rumah bakteri, seperti tanah atau usus hewan. Salah satu sumber alami terpadat untuk fag dan virus lainnya adalah air laut, dimana sampai 9 × 108 virion per mililiter telah ditemukan di tikar mikroba di permukaan, [3] dan sampai 70% dari bakteri laut mungkin terinfeksi oleh fag [4]. Mereka telah digunakan selama lebih dari 60 tahun sebagai alternatif terhadap antibiotik di Uni Soviet dan Eropa Timur [5] Mereka dilihat sebagai terapi mungkin terhadap strain resisten multi obat banyak bakteri..

Bakteriofag ('fag') adalah virus mampu menginfeksi dan mereplikasidi dalam bakteri. Λ DNA bakteriofag adalah sekitar 48 500 pb panjang. vektor lainkadang-kadang digunakan adalah jenis kromosom bakteri finansial artifi (BAC), yang secara efektifplasmid sangat besar digunakan untuk mengkloning membentang sangat besar DNA (fragmen DNA biasanya diatas100 000 bp).

Prinsip layar fag disajikan pada Gambar 13.2. Sebuah perpustakaan gen (salah satunya kodeuntuk protein bunga) yang terlebih dulu dihasilkan / diperoleh. Gen ini disisipkan (batch kloning) ke dalamperpustakaan fag fusi satu pengkodean gen dari protein mantel fag (PIII, PIV atau pVIII). Thefag tersebut kemudian diinkubasi dengan E. coli, yang memfasilitasi replikasi fag. Ungkapan fusiongen produk selama replikasi dan penggabungan berikutnya dari hasil fusi kehasil mantel fag dewasa dalam produk gen yang 'disajikan' pada permukaan fag. Theperpustakaan fag seluruh kemudian dapat diputar dalam rangka untuk mengidentifikasi satu (s) coding untuk proteinbunga. Hal ini biasanya dicapai oleh seleksi nity affi (biopanning).Biopanning memerlukan lewatperpustakaan atas molekul target bergerak, biasanya dalam format kolom amobil. Hanyafag mengekspresikan protein kota spesifik yang diinginkan harus disimpan pada kolom amobil.The fag terikat selanjutnya dapat dielusi, misalnya dengan mengurangi pH buffer elusiatau dimasukkannya ligan kompetitif (molekul target biasanya gratis) dalam buffer. Dielusi fag

kemudian dapat repassed atas kolom nity affi untuk mengisolasi mereka ligan mengikat amobil dengan kota yang spesifik, tertinggi / syarakat affi. Setelah ini tercapai, gen mengkode proteinkepentingan dapat dihilangkan dari genom fag dengan teknik standar biologi molekuler. Inikemudian dapat dimasukkan ke dalam mikroba yang sesuai / sel hewan / sistem ekspresi transgenik(Bab 3), memfasilitasi produksi besar-besaran dari produk gen.Variasi tampilan fagpendekatan yang telah dikembangkan, beberapa yang memanfaatkan rekayasa fag (phagemids), sedangkanorang lain mencapai ekspresi perpustakaan bukan pada permukaan fag, tetapi pada permukaan bakteri.

fag Lambda adalah partikel virus yang terdiri dari kepala, berisi double-stranded DNA linear sebagai bahan genetik, dan ekor yang dapat memiliki serat ekor. Partikel fag mengakui dan mengikat menjadi tuan rumah nya, E. coli, menyebabkan DNA di kepala fag yang akan dikeluarkan melalui ekor ke dalam sitoplasma sel bakteri. Biasanya, sebuah "siklus litik" terjadi kemudian, dimana lambda DNA direplikasi berkali-kali dan gen untuk kepala, ekor dan protein lisis disajikan. Hal ini menyebabkan beberapa perakitan partikel fag baru dalam sel dan lisis sel berikutnya, melepaskan isi sel, termasuk virion yang telah dirakit, ke lingkungan. Namun, dalam kondisi tertentu DNA fag dapat mengintegrasikan dirinya ke dalam kromosom sel tuan rumah di jalur lisogenik. Dalam keadaan ini, DNA λ disebut profag dan tetap penduduk dalam genom inang tanpa membahayakan jelas ke host, yang dapat disebut lysogen ketika profag hadir. profag ini digandakan dengan setiap pembelahan sel berikutnya dari tuan rumah. Gen-gen fag disajikan dalam keadaan tidak aktif kode ini untuk protein yang menekan ekspresi gen fag lainnya (seperti gen struktural dan lisis) dalam rangka untuk mencegah masuknya ke dalam siklus litik. Protein ini represif dipecah ketika sel inang berada di bawah stres, mengakibatkan ekspresi gen fag ditekan.Stres bisa dari kelaparan, racun (seperti antibiotik), atau faktor lain yang dapat merusak atau menghancurkan tuan rumah. Dalam respon terhadap stres, profag diaktifkan diiris dari DNA sel inang oleh salah satu produk gen baru diutarakan dan memasuki jalur litik nya.Fag lambda ditemukan oleh Esther Lederberg pada tahun 1950 [1] Ia telah digunakan berat sebagai model organisme,. Dan telah menjadi sumber yang kaya untuk alat yang berguna dalam biologi molekular. Menggunakan termasuk aplikasinya sebagai vektor untuk kloning DNA rekombinan, penggunaan rekombinase yang spesifik situs, int, untuk mengocok DNA kloning dengan metode 'Gateway', dan penerapan operon Merah, termasuk protein Merahalfa (juga disebut 'exo'), beta dan gamma dalam metode rekayasa DNA yang disebut recombineering.Pada halaman berikut, gen akan ditulis dalam huruf miring dan protein mereka yang terkait di Romawi. Sebagai contoh, CI mengacu pada gen, sedangkan ci adalah protein yang dihasilkan dikode oleh gen itu.

transposon adalah urutan DNA yang dapat bergerak atau berpindah sendiri ke posisi baru dalam genom sel tunggal.Mekanisme transposisi dapat berupa "copy dan paste" atau "cut and paste". Transposisi dapat menciptakan fenotipik mutasi yang signifikan dan mengubah ukuran genom sel. Barbara McClintock penemuan tentang gen ini melompat awal karirnya dia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1983. [1]Transposon membentuk sebagian besar dari nilai-C sel eukariotik. Transposon sering dianggap "sampah DNA". Dalam Oxytricha, yang memiliki sistem genetik yang unik, mereka memainkan peran penting perkembangannya. [2] transposon sangat berguna untuk para peneliti sebagai sarana untuk mengubah DNA di dalam organisme hidup.