PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ISOLASI DAN...

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SAPONIN PADA KECAMBAH KEDELAI

(Glycine max L.)

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Yustina Sakundita Puspariani

NIM : 038114014

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2007

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

AAppaakkaahh ssuukksseess iittuu?? SSeerriinngg ddaann bbaannyyaakk tteerrttaawwaa

MMeennddaappaattkkaann rraassaa hhoorrmmaatt ddaarrii oorraanngg ppaannddaaii ddaann rraassaa kkaassiihh ddaarrii oorraanngg sseekkiittaarr

MMeerraaiihh ppeenngghhaarrggaaaann kkrriittiikkuuss yyaanngg jjuujjuurr

MMeenngghhaarrggaaii kkeeiinnddaahhaann

MMeenneemmuukkaann ssiiffaatt bbaaiikk ddaallaamm ddiirrii oorraanngg llaaiinn

MMeemmbbuuaatt dduunniiaa lleebbiihh bbaaiikk,, ddeennggaann sseeppeettaakk kkeebbuunn

MMeennggeettaahhuuii bbaahhwwaa sseesseeoorraanngg tteellaahh hhiidduupp lleebbiihh mmuuddaahh kkaarreennaa kkeebbeerraaddaaaannmmuu;;

IIttuullaahh aarrttii ssuukksseess..

(Ralph Waldo Emerson)

TTuuggaass ddii hhaaddaappaann kkiittaa ttiiddaakk ppeerrnnaahh sseebbeessaarr kkeekkuuaattaann ddii bbeellaakkaanngg kkiittaa

(Anonim)

KKuuppeerrsseemmbbaahhkkaann kkaarryyaa kkeecciill iinnii uunnttuukk ::

MMaammaa && PPaappaa tteerrcciinnttaa

KKaakkaakkkkuu tteerrssaayyaanngg

OOrraanngg--oorraanngg yyaanngg mmeennyyaayyaannggiikkuu

ddaann AAllmmaammaatteerrkkuu


PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan pada Allah Bapa di Surga, karena atas

berkat dan kekuatan yang diberikan-Nya, penulis dapat menyelesaikan tugas

skripsi yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi Saponin pada Kecambah Kedelai”

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

Dalam pelaksanaan dan penyusunan skripsi ini, penulis mendapat bantuan,

bimbingan, dan dorongan dari berbagai pihak, sehingga penulis berkewajiban

untuk menyampaikan terimakasih kepada :

1. Ibu Rita Suhadi, M.Si, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen pembimbing yang telah

memberikan bimbingan, saran, pengarahan, pengetahuan dan kesabaran

dalam membimbing selama penelitian dan penulisan skripsi ini.

3. Bapak Drs. Sulasmono, Apt., selaku dosen penguji yang telah bersedia

menguji, memberikan saran dan masukan yang sangat berguna dalam

penyelesaian skripsi ini.

4. Ibu Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah

bersedia menguji, memberikan saran dan masukan yang sangat berguna

dalam penyelesaian skripsi ini.

5. My beloved family, Papa dan Mama, serta Kakakku Petra Chanelia, atas

cinta, kasih sayang, pengorbanan, dukungan, dan doa yang tak pernah

henti.


6. Mas-ku, Laurentius Dian ‘Ndolith’ Krislianto atas dukungan, perhatian,

serta rasa sayang. Terima kasih untuk kebaikan hatimu mengantarku

mencari kedelai dan selalu siap menjadi penolongku.

7. Sahabatku, Raya, atas dukungan dan persahabatan yang menyenangkan.

Terima kasih juga dapat menjadi andalanku.

8. Teman seperjuanganku, Yohana, atas kerjasama dan suka duka selama

penelitian di laboratorium, juga untuk printernya. Jangan menyerah,

kawan!

9. Teman-teman d’Sindens : Moncee (terima kasih atas pengalaman-

pengalaman seru di awal kuliah), Vera, Dita, Rosa, Ana, Sari, Tata, dan

Angger. Dunia hiburan kelas A akan sepi tanpa kalian.

10. Mas Wagiran, Pak Mukmin, Mas Parlan, Mas Sigit, Pak Prapto, Mas

Kunto dan Mas Iswandi yang selalu membantu kemudahan penelitian di

laboratorium.

11. Teman-teman angkatan 2003, khususnya kelas A (khususnya lagi Shyu

‘Baby’, Andi ‘Papi’, dan Adi ‘Gondes’), sebagai supporting team, dan atas

pelangi penuh warna selama belajar di Farmasi.

12. Semua pihak serta teman-teman yang tidak dapat penulis sebutkan satu

persatu yang telah banyak memberikan bantuan, dukungan, dan doanya

selama ini. God bless you all!

Penulis menyadari sepenuhnya bahwa penyusunan skripsi ini masih jauh

dari sempurna. Maka dari itu, penulis dengan senang hati menerima segala saran

maupun kritik yang bersifat membangun, dan yang dapat membantu skripsi ini


agar dapat menjadi lebih sempurna dan berguna. Akhir kata semoga skripsi ini

dapat memberi manfaat bagi pembacanya dan bagi perkembangan ilmu

pengetahuan terutama di bidang kefarmasian.

Yogyakarta, Oktober 2007

Penulis


INTISARI

Kedelai (Glycine max L.) selain dikonsumsi sebagai sayuran juga dapat digunakan sebagai tanaman obat karena memiliki kandungan kimia yang cukup bermanfaat. Salah satu senyawa kimia yang terkandung dalam kedelai adalah saponin, dimana secara umum kadar saponin meningkat bila kedelai dikecambahkan. Menurut golongannya, saponin terbagi dua yakni steroid dan triterpenoid. Saponin steroid berguna untuk pengembangan hormon kelamin dan kontrasepsi oral. Sedangkan saponin triterpenoid biasa digunakan sebagai ekspektoran, antiinflamasi, larvasida, serta dapat meningkatkan ekskresi kolesterol. Penentuan tipe saponin berguna untuk pemanfaatan selanjutnya dari tanaman yang mengandung tipe saponin tersebut. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui tipe saponin yang terdapat dalam kecambah kedelai serta karakteristik saponin tersebut secara Kromatografi Lapis Tipis dan spektroskopi UV.

Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian non-eksperimental dengan cara analisis deskriptif komparatif. Uji saponin dilakukan dengan uji busa, reaksi Liebermann-Burchard, dan reaksi Salkowski. Selanjutnya saponin dihidrolisis. Isolasi dilakukan dengan KLT preparatif. KLT dan spektroskopi UV digunakan untuk karakterisasi, dan uji kemurnian menggunakan KLT multi-eluen. Sebagai pembanding digunakan Succus Liquiritae.

Berdasarkan hasil penelitian, kecambah kedelai mengandung saponin triterpenoid. Isolasi menggunakan KLT preparatif menghasilkan isolat murni berwarna biru-ungu hasil reaksi dengan penampak bercak anisaldehid-asam sulfat. Hasil spektroskopi UV menunjukkan puncak tunggal isolat saponin kecambah kedelai dengan serapan maksimum pada panjang gelombang 280,6 nm.

Kata kunci : saponin, triterpenoid, kecambah, Glycine max L., isolasi, identifikasi,

KLT, KLTP, spektroskopi UV


ABSTRACT

Soybean (Glycine max L.) can be used as medicinal plants, in other side as vegetable because of its benefit constituents. One of the chemical substance in soybean is saponin, when commonly the saponin amount promotes up in the sprout-shape. Saponin are divided into two types, they are steroid and triterpenoid. Steroid saponins are useful for development of sex hormones and oral contraceptions. Meanwhile the triterpenoid saponins generally used for expectorant, antiinflamation, larvacides, and also can increase excretion of cholesterol. Knowing the type of saponin is very helpful for the next preparation of the plants that include the type of the saponin. The purposes of this research are to knowing the type of saponin of soybean sprouts and their characterization based on Thin Layer Chromatography and UV spectroscopy.

This was a non-experimental research using comparative descriptive analysis. Saponin was tested with foam test, Liebermann-Burchard reaction, and Salkowski reaction. Next, saponin was hydrolysed. The isolation was done through preparative TLC method. Characterization was use TLC and UV spectroscopy, and for purity test used multi-eluen TLC. Succus Liquiritae is used as standard.

Based on the research, indicate that soybean sprout contains triterpenoid saponins. Isolation result using TLC preparative give blue-violet pure isolate by reaction with anisaldehide-sulphuric acid. The result of UV spectroscopy showed only one peak with maximum absorbance on wave length about 280.6 nm. Key words : saponin, triterpenoid, sprout, Glycine max L., isolation,

identification, TLC, PTLC, UV spectroscopy


DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL............................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN..................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................ iv

PRAKATA......................................................................................................... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................ viii

INTISARI . ........................................................................................................ ix

ABSTRACT......................................................................................................... x

DAFTAR ISI...................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL.............................................................................................. xiv

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................... xvii

BAB I . PENGANTAR .................................................................................. 1

A. Latar Belakang.................................................................................... 1

1. Permasalahan ......................................................................... 3

2. Keaslian penelitian................................................................ 3

3. Manfaat penelitian................................................................. 4

B. Tujuan Penelitian................................................................................ 4

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.......................................................... 5

A. Kedelai................................................................................................. 5

1. Keterangan botani ................................................................. 5

2. Nama Daerah ......................................................................... 5


3. Deskripsi................................................................................. 5

4. Khasiat dan kegunaan........................................................... 6

5. Kandungan kimia .................................................................. 6

B. Penyarian ............................................................................................. 6

C. Saponin. ............................................................................................... 9

D. Kecambah............................................................................................ 13

E. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)...................................................... 16

F. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)................................. 19

G. Spektroskopi Ultra Violet (UV) ....................................................... 21

H. Keterangan Empiris ........................................................................... 24

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ................................................... 25

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ....................................................... 25

B. Definisi Operasional .......................................................................... 25

C. Bahan dan Alat Penelitian................................................................. 26

D. Jalan Penelitian ................................................................................... 26

1. Identifikasi tanaman.............................................................. 26

2. Pengumpulan bahan dan proses perkecambahan .............. 27

3. Pemeriksaan organoleptik dan makroskopik..................... 27

4. Uji saponin ............................................................................. 27

5. Hidrolisis saponin kecambah kedelai dan

Succus Liquiritae............................................................ 28

6. Ekstraksi saponin kecambah kedelai dan

Succus Liquiritae................................................................... 28


7. Pemeriksaan pendahuluan saponin dengan KLT………. 29

8. Isolasi saponin dengan KLTP.............................................. 29

9. Uji kemurnian dengan KLT multi-eluen……………….. 30

10. Spektroskopi Ultra Violet (UV) .......................................... 31

E. Tata Cara Analisis Hasil.................................................................... 31

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................... 33

A. Identifikasi tanaman........................................................................... 33

B. Pengumpulan Bahan dan Proses Perkecambahan.......................... 33

C. Pemeriksaan Organoleptik dan Makroskopik................................. 34

D. Uji Saponin ......................................................................................... 35

E. Hidrolisis Saponin Kecambah Kedelai dan Succus Liquiritae..... 38

F. Ekstraksi Saponin Kecambah Kedelai dan Succus Liquiritae...... 40

G. Pemeriksaan Pendahuluan Saponin dengan KLT .......................... 41

H. Isolasi Saponin dengan KLTP .......................................................... 44

I. Uji Kemurnian dengan KLT multi-eluen........................................ 47

J. Spektroskopi Ultra Violet (UV) ....................................................... 54

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN...................................................... 58

A. Kesimpulan ......................................................................................... 58

B. Saran .................................................................................................... 58

DAFTAR PUSTAKA..................................................................................... 59

LAMPIRAN..................................................................................................... 62

BIOGRAFI PENULIS.................................................................................... 72


DAFTAR TABEL

Tabel I . Hasil pemeriksaan organoleptik dan makroskopik terhadap

kecambah kedelai........................................................................ 34

Tabel II . Hasil kromatogram KLT Pendahuluan ................................... 43

Tabel III . Hasil kromatogram uji kemurnian dengan KLT multi-eluen 48


DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Kerangka steroid ................................................................ 10

Gambar 2. Kerangka triterpenoid, α-amirin, β-amirin, dan lupeol ...... 12

Gambar 3. Bagan spektrofotometer UV berkas ganda ………………….. 21

Gambar 4. Tingkat energi elektron molekul.......................................... 24

Gambar 5. Mekanisme terbentuknya buih ........................................... 35

Gambar 6. Reaksi Liebermann-Burchard…………………………….. 37

Gambar 7. Reaksi Salkowski ............................................................... 38

Gambar 8. Kerangka asam glisiretinat ................................................. 40

Gambar 9. Mekanisme hidrolisis Succus Liquiritae

dalam suasana asam ........................................................... 40

Gambar 10. Hasil kromatogram KLT Pendahuluan………………… .. 42

Gambar 11. Hasil uji kemurnian isolat tahap pertama dengan

fase gerak n-butanol:etanol:air (7:2:5 v/v).......................... 46

Gambar 12. Hasil kromatogram KLT multi-eluen

dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v)……… 49


dengan fase gerak kloroform:metanol:air (64:50:10 v/v) .. 50


dengan fase gerak n-butanol:etanol:air (7:2:5 v/v) ............ 51

Gambar 15. Reaksi antara saponin triterpenoid

dengan anisaldehid-asam sulfat ......................................... 52


Gambar 16. Gugus kromofor asam glisiretinat………………………… 55

Gambar 17. Spektra saponin kecambah kedelai (sampel) ................... 56

Gambar 18. Spektra saponin Succus Liquiritae (pembanding)............ 56


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 . Surat keterangan determinasi........................................... 62

Lampiran 2. Sertifikat analisis Succus Liquiritae…………………….. 64

Lampiran 3 . Foto tanaman kedelai....................................................... 65

Lampiran 4 . Foto biji kedelai dan kecambah kedelai .......................... 66

Lampiran 5 . Foto uji saponin dengan uji buih ..................................... 67

Lampiran 6 . Foto uji saponin dengan reagen Liebermann-Burchard .. 68

Lampiran 7 . Foto reaksi Salkowski...................................................... 69

Lampiran 8 . Foto alat hidrolisa ............................................................ 70

Lampiran 9 . Foto alat menyaring isolat ............................................... 71


BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Gaya hidup back to nature kian diminati sebagai bagian dari kesadaran

untuk hidup sehat. Masyarakat memanfaatkan berbagai macam tanaman untuk

kelangsungan hidupnya. Dalam hal ini, bukan saja tanaman pangan tetapi juga

tanaman obat yang mengandung metabolit sekunder yang cukup bermanfaat

dalam pengobatan. Tanaman obat merupakan tanaman yang dapat digunakan

dalam pengobatan baik sebagai pemeliharaan kesehatan maupun untuk

penyembuhan penyakit. Salah satu jenis tanaman obat adalah kedelai (Glycine

max L.), walaupun selama ini masyarakat lebih mengenal kedelai sebagai sayuran

dan bahan pangan, bukan sebagai tanaman obat.

Kedelai termasuk dalam jajaran bahan makanan yang ditargetkan sebagai

sumber protein nabati untuk memerangi PMN (protein malnutrition) oleh WHO

dan FAO. Kecambah kedelai adalah salah satu bentuk penggunaan kedelai,

dimana biasa digunakan saat masih mentah maupun dimasak sebagai sayur.

Hanya saja, lebih dianjurkan mengkonsumsi kecambah kedelai dalam keadaan

mentah, misalnya dijadikan lalapan atau diminum sebagai jus, karena zat-zat

bermanfaat yang dikandungnya masih utuh. Jika harus dimasak sebagai sayur,

sebaiknya kecambah dimasukkan sesaat sebelum masakan matang. Selain

dikonsumsi sebagai sayuran, ternyata kedelai juga dapat digunakan untuk

pengobatan pada beberapa penyakit, seperti diabetes mellitus, reumatik, sakit

ginjal (Arisandi dan Andriani, 2006).


Kedelai diperkirakan memiliki kandungan kimia berupa protein, lemak,

karbohidrat, mineral (Na, K, Fe), vitamin A, vitamin B, saponin, isoflavonoid,

lesitin, glisinin peptida, dan fito-estrogen (Dora, 2005).

Berdasarkan hal tersebut, kedelai memiliki dua fungsi yaitu selain

dikonsumsi sebagai sayuran ternyata dapat juga digunakan sebagai tanaman obat

karena memiliki kandungan kimia yang cukup bermanfaat. Jika tanaman obat

tersebut dapat dimakan sebagai sayuran sekaligus dapat mengobati penyakit

seperti yang telah disebutkan diatas, tentu masyarakat akan merasa lebih

diuntungkan.

Dalam setiap bagian tanaman pasti terdapat metabolit sekunder. Salah satu

senyawa kimia yang termasuk dalam golongan metabolit sekunder yang

terkandung di dalam kedelai adalah saponin. Menurut golongannya, saponin dapat

dibedakan menjadi dua macam tipe yaitu tipe steroid dan triterpenoid (Evans,

2002). Penentuan tipe dari saponin ini berguna untuk pemanfaatan selanjutnya

dari tanaman yang mengandung tipe saponin tersebut. Saponin steroid berguna

untuk mendapatkan prekursor obat jenis kortison serta pengembangan hormon

kelamin dan kontrasepsi oral (Evans, 2002). Sedangkan saponin triterpenoid biasa

digunakan sebagai ekspektoran (obat batuk), antiinflamasi, larvasida serta dapat

menurunkan kadar kolesterol. Menurut penelitian, pada anak ayam yang diberi

0,9% saponin triterpenoid dapat menurunkan konsumsi pakan, menurunkan berat

badan, serta meningkatkan ekskresi kolesterol (Anonim, 2006).

Sebuah penelitian menyatakan bahwa ketika biji-bijian dikecambahkan,

secara umum kadar saponin meningkat sekitar 450% (Wahyuni, 2006). Saponin


dalam kecambah mampu menurunkan kadar lemak LDL (Low Density

Lipoprotein) dalam tubuh, tanpa mengganggu lemak HDL (High Density

Lipoprotein). LDL bersifat atherogenik (dapat memicu atherosklerosis atau

pengerasan pembuluh darah akibat penimbunan lemak) sehingga disebut ’lemak

jahat’, sedangkan HDL bersifat anti atherogenik, karena fungsinya mengangkut

kolesterol kembali ke hati untuk dikatabolisme sehingga mengurangi simpanan

kolesterol. Kadar lemak LDL normal yakni < 130 mg/dl, sedang kadar HDL yang

baik adalah > 40 mg/dl (Soeharto, 2000).

Untuk lebih mendalami dan mengetahui tipe saponin yang terkandung di

dalam kedelai, maka dilakukan penelitian mengenai isolasi dan identifikasi

saponin pada kecambah kedelai (Glycine max L.) serta karakterisasi saponin

tersebut secara kromatografi lapis tipis (KLT) dan spektrofotometri ultra violet

(UV).

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang yang dikemukakan di atas, timbul

permasalahan untuk diteliti, yaitu :

1. tipe saponin apakah yang terkandung dalam kecambah kedelai?

2. bagaimana ciri karakteristik saponin kecambah kedelai secara

kromatografi lapis tipis (KLT) dan spektroskopi ultra violet (UV)?

2. Keaslian Penelitian

Penelitian tentang isolasi dan identifikasi saponin pada kecambah kedelai

sepanjang pengetahuan penulis belum pernah dilakukan. Penelitian sejenis yang


pernah dilakukan adalah isolasi dan identifikasi aglikon saponin pada buah lerak

(Sapindus rarak D.C.) oleh Yanuarsih (2001), isolasi dan identifikasi glikosida

saponin pada herba krokot (Portulaca oleracea L.) oleh Kristianti (2007).

3. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi sumbangan baru bagi

perkembangan ilmu kefarmasian, kedokteran, maupun kesehatan pada umumnya.

Hal tersebut dapat berupa manfaat teoritis dan manfaat praktis.

a. Manfaat Teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam pengembangan ilmu

kefarmasian khususnya tentang tipe saponin kecambah kedelai.

b. Manfaat Praktis

Penelitian ini diharapkan dapat melengkapi informasi mengenai kecambah

kedelai berdasarkan aktivitas farmakologi golongan saponin yang

terkandung dalam kecambah kedelai.

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan Umum

Penelitian ini secara umum bertujuan untuk lebih mendalami

pengetahuan tentang kecambah kedelai.

2. Tujuan Khusus

Penelitian ini secara khusus bertujuan untuk mengetahui tipe saponin

kecambah kedelai dan karakteristik saponin kecambah kedelai secara

kromatografi lapis tipis (KLT) dan spektroskopi ultra violet (UV).


BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kedelai

1. Keterangan botani

Kedelai mempunyai nama ilmiah Glycine max L. dan termasuk dalam suku

Leguminosae. Tanaman ini memiliki sinonim yakni, Glycine soja L. dan Soja max

Piper (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991 ; Thomas, 1992).

2. Nama Daerah

Di beberapa wilayah Indonesia, kedelai dikenal dengan berbagai nama,

antara lain : dele, dangsul, dekeman (Jawa), kacang bulu, kacang rimang

(Minangkabau), retak mejong (Lampung), kadhele (Madura), kacang jepun

(Sunda) (Thomas,1992).

3. Deskripsi

Tumbuhan kedelai mempunyai habitus berupa semak, semusim, tinggi 20-

60 cm. Batang bersegi, berkayu, berambut, bercabang, hijau keputih-putihan.

Berdaun majemuk, menyirip ganjil, bulat telur, ujung tumpul, tepi rata, pangkal

membulat, panjang 2-5 cm, lebar 2-4 cm, pertulangan menyirip, hijau. Bunganya

majemuk, bentuk tandan, kelopak 5-7 mm, berambut, bertaju sempit, runcing,

ungu. Buah berupa polong, bertangkai pendek, pipih, masih muda hijau setelah

tua kuning kecoklatan. Biji berbentuk bulat telur, kuning keputih-putihan. Berakar

tunggang, putih kekuningan (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991).


4. Khasiat kegunaan

Biji kedelai berkhasiat untuk mencegah kanker, menurunkan tekanan darah

tinggi, mencegah dan menurunkan kelebihan kolesterol dalam tubuh, antioksidan,

dan mencegah osteoporosis (Dora, 2005).

5. Kandungan kimia

Kedelai mengandung protein, lemak, karbohidrat, mineral (Na, K, Fe),

vitamin A, vitamin B, saponin, isoflavonoid, lesitin, glisinin peptida, dan fito-

estrogen (Dora, 2005).

B. Penyarian

1. Cairan Pelarut

Cairan pelarut dalam proses pembuatan ekstrak adalah pelarut yang baik

(optimal) untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau yang aktif, dengan

demikian senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan dan dari senyawa

kandungan lainnya, serta ekstrak hanya mengandung sebagian besar senyawa

yang diinginkan. Dalam hal ekstrak total, maka cairan pelarut dipilih untuk

melarutkan hampir semua metabolit sekunder yang terkandung (Anonim, 2000).

Faktor utama untuk pertimbangan pada pemilihan cairan penyari adalah :

(1) selektivitas

(2) kemudahan bekerja dan proses dengan cairan tersebut

(3) ekonomis

(4) ramah lingkungan

(5) keamanan (Anonim, 2000)


2. Metode ekstraksi dan pemisahan

Dalam analisis fitokimia digunakan jaringan tumbuhan yang masih segar

(Anonim, 1986). Untuk mendapatkan suatu zat dari bahan tanaman perlu

dilakukan penyarian. Metode ekstraksi menggunakan pelarut dapat dibedakan

menjadi dua cara yaitu cara dingin dan cara panas.

(1) cara dingin

a. maserasi

maserasi adalah proses pengekstraksian simplisia menggunakan

pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada

temperatur. Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan yang terus-

menerus. Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan

pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan

seterusnya.

b. perkolasi

perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai

sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur kamar. Prinsip

perkolasi dengan cara serbuk simplisia ditempatkan dalam bejana

silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan dialirkan

dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan

melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan

jenuh. Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi

antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak)


terus menerus sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5

kali bahan (Anonim, 1986 ; Anonim, 2000).

(2) cara panas

a. refluks

refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya,

selama waktu tertentu dan jumlah pelarutnya terbatas yang relatif

konstan dengan adanya pendingin balik.

b. soxhlet

soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang

umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi

kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya

pendingin balik.

c. digesti

digesti adalah maserasi kinetik pada temperatur yang lebih tinggi dari

temperatur ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-

50 °C.

d. infus

infus adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia dengan

air pada suhu 900C selama 15 menit (Anonim, 1986).

e. dekok

dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (≥ 30 menit) dan

temperatur sampai titik didih air (Anonim, 2000).


C. Saponin

Saponin adalah senyawa aktif permukaan yang dapat membentuk buih jika

dikocok dalam air. Saponin juga mempunyai sifat hemolisis, dan jika diinjeksikan

langsung ke dalam aliran darah akan sangat toksik, namun akan tidak berbahaya

jika digunakan melalui mulut, karena itu saponin biasa dipakai untuk bahan

tambahan dalam minuman non-alkohol/beverages (Evans, 2002). Saponin

merupakan racun kuat untuk ikan dan amfibi, kemungkinan karena mempunyai

sifat mengiritasi mucosa. Saponin dapat membentuk kompleks dengan asam

empedu dan kolesterol (Nio, 1990). Pada pangan nabati, saponin memberikan rasa

pahit. Saponin larut dalam etanol dan air tetapi tidak larut dalam eter (Robinson,

1991).

Saponin relatif merupakan senyawa yang stabil, tetapi lama-lama mungkin

diubah sebagian ke dalam zat yang tidak aktif. Sarsaparilla yang disimpan selama

50 tahun tetap mempunyai aktivitas penuh seperti aktivitas permulaannya (Evans,

2002).

Saponin mempunyai berat molekul yang tinggi, dan isolasinya yang

membutuhkan kemurnian, cukup sulit. Sebagai glikosida, saponin terhidrolisis

oleh asam, memberikan aglikon (sapogenin) triterpenoid atau steroid, bermacam

gula (glukosa, galaktosa, pentosa, atau metil pentosa) dan asam uronat (Evans,

2002).

Berdasarkan struktur sapogenin, dikenal dua macam saponin, yaitu steroid

(biasanya tetrasiklik triterpenoid) dan tipe pentasiklik triterpenoid. Keduanya


mempunyai ikatan glikosida pada C-3 dan mempunyai asal-usul biogenesis

melalui jalur asam mevalonat dan unit isoprenoid (Evans, 2002).

1. Saponin steroid

Saponin steroid lebih sedikit terdistribusi di alam dibandingkan tipe

triterpenoid. Survey fitokimia menunjukkan bahwa saponin steroid terdapat dalam

banyak tumbuhan monokotil, terutama Dioscoreaceae, Amaryllidaceae, dan

Liliaceae. Pada dikotil terdapatnya diosgenin pada Leguminosae dan alkaloid

steroida pada Solanum secara potensial sangat penting. Beberapa spesies

Strophantus dan Digitalis mengandung saponin steroida disamping glikosida

jantung (Evans, 2002).

OH H

A B

C1

2

34

56

7

89

10

1112

13

14

2526O

O

15

16

17

18

19

20

21

2223

24

H

R2

R1D

E

Gambar 1 : Kerangka steroid

Saponin steroid mempunyai pengaruh yang penting dikarenakan adanya

hubungan dengan beberapa bahan seperti hormon seks, kortison, steroid diuretik,

vitamin D, dan glikosida jantung. Beberapa saponin steroid digunakan sebagai

senyawa awal untuk sintesis bahan-bahan tersebut (Evans, 2002). Saponin steroid

yang penting adalah diosgenin yang terdapat pada akar Dioscorea (yam) dan

secara komersial dipergunakan untuk sintesis steroid yang penting bagi


pengobatan medis (Mann, 1994). Solasodin (dari Solanum sp.) dan diosgenin

biasa digunakan untuk obat kontrasepsi (Yuliani, 2001).

2. Saponin triterpenoid

Saponin triterpenoid jarang terdapat pada tumbuhan monokotil. Mereka

banyak terdapat pada tumbuhan dikotil. Saponin triterpenoid sering dimanfaatkan

sebagai ekspektoran karena dapat merangsang keluarnya sekret dari bronkial.

Menurut beberapa penelitian, saponin triterpenoid mempunyai aktivitas

antiinflamasi, larvasida, serta dapat meningkatkan eksekresi kolesterol (Anonim,

2006).

Menurut Harborne (1987), banyak triterpenoid dikenal dalam tumbuhan

dan secara berkala senyawa baru ditemukan dan dicirikan. Sampai saat ini hanya

beberapa saja yang diketahui tersebar luas. Senyawa tersebut adalah triterpena

pentasiklik α-amirin dan β-amirin serta asam turunannya, yaitu asam ursolat dan

asam oleanolat. Senyawa ini dan senyawa sekerabatnya terutama terdapat dalam

lapisan malam daun dan dalam buah, seperti apel dan per, dan mungkin mereka

berfungsi sebagai pelindung untuk menolak serangga dan serangan mikroba

(Harborne, 1987).

Saponin triterpenoida dapat dibedakan ke dalam tiga golongan yang

diwakili oleh α-amirin, β-amirin, dan lupeol.


OH

COOH

R2

R1

H

A B

C D

E

12

34

56

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

1718

1920

21

22

2324

2526

27

28

29 30

(1)

C H 3

H 3C

CH 3

C H 3

D

H 3C C H 3

C H 3

C H 3

C H 3

C H 3

C H 3H 2C

13

14

17

1920

E

(2) (3) (4) Gambar 2 : Kerangka triterpenoid (1), α-amirin (2), β-amirin (3), dan Lupeol (4)

Adanya saponin dalam tanaman juga dapat ditunjukkan dengan beberapa

cara antara lain:

a . indeks buih (foam index)

indeks buih menunjukkan angka pengenceran dari zat atau obat yang

diperiksa yang akan memberikan suatu lapisan buih yang tingginya 1 cm sampai

10 cm, bila larutan digojok dalam gelas ukur selama 15 detik dan selanjutnya

dibiarkan dulu selama 10 menit sebelum dilakukan pembacaan (Anonim, 1995a).

b. haemolisa

campur bahan yang akan diperiksa dengan larutan dapar fosfat pH 7,4 ,

panaskan, dinginkan, dan saring. Ambil filtrat campur dengan suspensi darah.


Diamkan selama 30 menit, terjadi haemolisa total berarti menunjukkan adanya

saponin (Anonim, 1995a).

c. reaksi warna

reaksi warna dapat digunakan untuk menggolongkan saponin (sapogenin)

yang digunakan untuk membuktikan identitas dari suatu obat, dan jika perlu untuk

memonitor pada waktu pemisahan. Tidak ada reaksi warna yang secara spesifik

untuk tiap jenis saponin. Reaksi berikut ini dapat digunakan yaitu:

1) dengan menggunakan asam asetat anhidrat dan asam sulfat (disebut reaksi

Liebermannn-Burchard). Hasilnya ditunjukkan dengan adanya perubahan

warna yang bergantung dari aglikonnya yaitu, merah muda sampai merah

berarti termasuk golongan triterpenoid. Sedangkan jika warnanya biru hijau

maka menunjukkan adanya senyawa golongan steroid (Bruneton,1999).

2) dengan menggunakan vanillin, anisaldehid, dan aldehid aromatik lainnya yang

ditambah dengan asam mineral kuat. Senyawa yang mengandung saponin

akan berwarna kuat, yang kemungkinan hasil reaksi antara aldehid dan aglikon

(Bruneton,1999).

Uji saponin di atas juga ditunjang dengan cara kromatografi lapis tipis (KLT) atau

pengukuran spektrum (Harborne, 1987).

D. Kecambah

Kecambah merupakan tumbuhan kecil yang baru tumbuh dari biji dan

masih hidup dari persediaan makanan yang terdapat dalam biji (Tjitrosoepomo,


2003). Perkecambahan biji ditandai dengan pecahnya kulit biji dan munculnya

calon tanaman baru.

Proses perkecambahan benih merupakan suatu rangkaian kompleks dari

perubahan-perubahan morfologi, fisiologi, dan biokimia. Tahap-tahap

perkecambahan meliputi :

1. tahap pertama dari perkecambahan benih dimulai dengan proses

penyerapan air oleh benih, melunaknya kulit benih dan hidrasi dari

protoplasma.

2. tahap kedua dimulai dengan kegiatan-kegiatan sel dan enzim-enzim

serta naiknya tingkat respirasi benih.

3. tahap ketiga merupakan tahap dimana terjadi penguraian bahan-bahan

seperti karbohidrat, lemak dan protein menjdi bentuk-bentuk yang

melarut dan ditranslokasikan ke titik-titik tumbuh.

4. tahap keempat adalah asimilasi dari bahan-bahan yang telah diuraikan

tadi di daerah meristematik untuk menghasilkan energi bagi kegiatan

pembentukan komponen dan petumbuhan sel-sel baru.

5. tahap kelima adalah pertumbuhan dari kecambah melalui proses

pembelahan, pembesaran dan pembagian sel-sel pada titik-titik

tumbuh.

Sementara daun belum dapat berfungsi sebagai organ fotosintesa maka

pertumbuhan kecambah sangat tergantung pada persediaan makanan yang ada

dalam biji (Sutopo, 1985).


Kecambah memperlihatkan bagian-bagian seperti lembaga, karena memang

kecambah berasal dari lembaga. Lembaga adalah calon tumbuhan baru, yang

nantinya akan tumbuh menjadi tumbuhan baru, setelah biji memperoleh syarat-

syarat yang diperlukan. Lembaga memperlihatkan ketiga bagian utama tubuh

tumbuhan, yaitu:

a. akar lembaga atau calon akar (radicula / hipokotil)

b. daun lembaga atau calon daun (cotyledon)

c. batang lembaga (cauliculus)

Batang lembaga beserta calon-calon daun merupakan bagian lembaga yang

dinamakan pucuk lembaga / plumula (Sutopo, 1985 ; Tjitrosoepomo, 2003).

Syarat biji dapat berkecambah bila biji berada dalam keadaaan yang

memenuhi syarat perkecambahan, meliputi kadar air, suhu, cahaya, dan oksigen

(Tjitrosoepomo, 2003). Suhu optimal untuk perkecambahan antara 10-30°C.

Oksigen diperlukan untuk respirasi yang merupakan reaksi pembongkaran atau

pemecahan cadangan makanan. Sedang cahaya diperlukan selama berlangsungnya

perkecambahan. Namun demikian biji dapat berkecambah dengan baik dengan

atau tanpa cahaya.

Faktor-faktor yang mempengaruhi perkecambahan benih :

a. faktor dalam, antara lain : tingkat kemasakan benih, ukuran benih,

dormansi.

b. faktor luar, antara lain : air, temperatur, oksigen, cahaya, dan medium.

Kandungan zat gizi pada biji sebelum dikecambahkan berada dalam bentuk

tidak aktif (terikat). Setelah perkecambahan, bentuk tersebut diaktifkan.


Peningkatan zat-zat gizi pada kecambah mulai tampak sekitar 24-48 jam saat

perkecambahan (Rukmana, 1997).

Pada saat perkecambahan, terjadi hidrolisis karbohidrat, protein, dan lemak

menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana sehingga mudah dicerna, selain

itu juga terjadi peningkatan jumlah protein, sedangkan kadar lemaknya

mengalami penurunan. Ketika biji-bijian dikecambahkan, secara umum kadar

saponinnya meningkat 450%, bahkan meningkatkan jumlah vitamin A sebanyak

300 % (Wahyuni, 2006). Menurut Arisandi dan Andriani (2006), kandungan gizi

yang terdapat pada 100 g biji kedelai yakni protein (34,9 g), kalori (331 kal),

lemak (18,1 g), hidrat arang (34,8 g), kalsium (227 mg), saponin (200 mg), fosfor

(585 mg), vitamin A (110 SI), dan vitamin B1 (1,07 mg).

E. Kromatografi Lapis Tipis

KLT merupakan metode pemisahan komponen-komponen atas dasar

perbedaan adsorbsi atau partisi oleh fase diam di bawah pergerakan pelarut

pengembang atau pelarut pengembang campur. Pemilihan pelarut pengembangan

atau pelarut pengembangan campur sangat dipengaruhi oleh macam dan polaritas

zat-zat kimia yang dipisahkan (Mulja dan Suharman, 1995).

Menurut Gritter, Bobbitt, dan Schwarting (1991), pada hakikatnya KLT

melibatkan dua peubah: sifat fase diam, dan sifat fase gerak atau campuran pelarut

pengembang. Fase diam dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai

permukaan penjerap atau berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair.


Hampir segala macam serbuk dapat dipakai sebagai penjerap pada KLT, tetapi

yang paling umum dipakai adalah sebagai berikut :

a. silika gel (asam silikat)

silika gel merupakan penjerap yang paling banyak dipakai dalam KLT. Sebagian

besar silika gel bersifat sedikit asam, maka asam sering agak mudah dipisahkan,

jadi meminimumkan reaksi asam-basa antara penjerap dan senyawa yang

dipisahkan.

b. alumina

berbeda dengan silika gel, alumina bersifat sedikit basa dan sering dipakai untuk

pemisahan basa. Cara ini juga meminimumkan reaksi asam-basa.

c. kiselgur dan selulosa

kiselgur dan selulosa merupakan bahan penyangga lapisan zat cair yang dipakai

dalam sistem kromatografi cair-cair. Kromatografi jenis ini selalu dipakai untuk

pemisahan senyawa polar seperti asam amino, karbohidrat, nukleotida, dan

berbagai senyawa hidrofil alam lainnya.

Lapisan penjerap sering mengandung indikator fluoresensi yang

ditambahkan untuk membantu penampakan bercak tidak berwarna pada lapisan

yang telah dikembangkan. Indikator fluoresensi adalah senyawa yang

memancarkan sinar tampak jika disinari dengan sinar berpanjang gelombang lain,

biasanya sinar ultraviolet. Dan biasanya penjerap yang dicampur dengan indikator

fluoresensi diberi tanda F, misalnya silica gel GF. Jika senyawa pada bercak yang

ditampakkan mengandung ikatan rangkap terkonjugasi atau cincin aromatis, maka

sinar UV yang mengeksitasi tidak dapat mencapai indikator fluoresensi sehingga


tidak ada cahaya yang dipancarkan. Dengan demikian hasilnya ialah bercak gelap

dengan latar belakang yang bersinar. Cara ini sangat peka dan tidak merusak

senyawa yang ditampakkan. Indikator fluoresensi yang paling sering digunakan

adalah sulfida anorganik, yang dapat memancarkan cahaya jika disinari pada 254

nm (Gritter, 1985).

Menurut Mulja dan Suharman (1995), pada sistem KLT dikenal istilah

kecepatan rambat suatu senyawa dan diberi simbol Rf. Harga Rf ini ditentukan

oleh jarak rambat senyawa dari titik awal dan jarak rambat pelarut dari titik awal,

ditulis dengan rumus :

Rf =

Angka Rf berkisar antara 0,00 – 1,00 dan hanya dapat ditentukan dengan dua

desimal. HRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai

berkisar antara 0 – 100 (Harborne, 1987 ; Stahl, 1973).

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan bercak dalam KLT yang juga

mempengaruhi harga Rf adalah struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan, sifat

dari penjerap dan derajat aktifitasnya, tebal dan kerataan dari lapisan penjerap,

derajat kemurnian fase gerak, derajat kejenuhan uap dalam bejana pengembangan,

jumlah cuplikan yang digunakan, suhu, kesetimbangan antara atmosfer dalam

bejana jenuh dengan uap pelarut (Sastrohamidjojo, 2002).

Densitometri adalah metode analisis instrumental yang berdasarkan

interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT.

Interaksi radiasi elektromagnetik dengan noda pada KLT yang ditentukan adalah

absorpsi, transmisi, pantulan pendar fluor atau pemadaman pendar fluor dari


radiasi semula. Densitometri lebih dititikberatkan untuk analisis kuantitatif analit-

analit dengan kadar sangat kecil yang perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu

dengan KLT. Prinsip analisis kuantitatif dengan metode densitometri hampir sama

dengan metode spektrofotometri penentuan kadar analit yang dikorelasikan

dengan area noda pada KLT akan lebih terjamin kesahihannya dibanding metode

KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) atau KGC (Kromatografi Gas Cair),

sebab area noda kromatogram diukur pada posisi diam (Mulja dan Suharman,

1995).

F. KLT Preparatif

KLT preparatif adalah salah satu metode yang paling mudah dan murah

yang digunakan untuk isolasi komponen suatu senyawa. Tetapi membutuhkan

kerja yang lebih intensif dan tiap-tiap fraksi yang diperoleh hanya dalam jumlah

kecil. Sebenarnya prinsip dasar KLTP sama dengan KLT pada umumnya. Tetapi

ada perbedaan yang paling mendasar yaitu tentang ukuran ketebalan penjerap dan

metode penotolannya. Pada KLTP, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan

berupa garis lurus mendatar pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan

dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan

terpisah menjadi beberapa pita. Pita akan nampak dengan cara yang tidak merusak

jika senyawa itu berwarna. Setelah itu penjerap yang mengandung pita dikerok

dari pelat kaca. Kemudian cuplikan dielusi dari penjerap dengan pelarut polar.

Cara ini berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa

murni (Gritter, 1991).


Berbagai penelitian telah dilakukan untuk memeriksa pengaruh ketebalan

penjerap terhadap kualitas pemisahan tetapi ketebalan yang paling sering dipakai

adalah 0,5 – 2 mm. Ukuran pelat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x40

cm. Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran pelat sudah tentu mengurangi

jumlah bahan yang dipisahkan dengan KLTP. Penjerap yang paling umum ialah

silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun

campuran senyawa hidrofil.

Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara pengembangan

berulang. Jika pemisahan secara KLTP telah dicapai, pelat dikeringkan dan

kemudian dimasukkan lagi ke dalam bejana. Bergantung pada Rf pita, proses ini

dapat diulang beberapa kali, walaupun ada kerugian waktu.

Kebanyakan penjerap KLTP mengandung indikator fluoresensi yang

membantu kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan

menyerap sinar UV. Untuk senyawa yang tidak menyerap sinar UV, ada beberapa

pilihan:

a) menyemprot dengan air,

b) menutup pelat dengan sepotong kaca menyemprot salah satu sisi dengan

pereaksi semprot,

c) menambahkan senyawa pembanding (Hostettmann, 1995).

Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari pelat dengan spatula

atau pengerok berbentuk tabung yang disambungkan ke pengumpul vakum. Cara

terakhir tidak dapat dilakukan untuk senyawa peka karena penjerap yang

mengandung senyawa yang sudah murni terus menerus terkena aliran udara dan


resiko otooksidasi selalu ada. Kemudian senyawa harus diekstraksi dari penjerap

dengan pelarut sekitar 5 ml untuk 1 g penjerap. Harus diperhatikan bahwa makin

lama senyawa berkontak dengan penjerap makin besar kemungkinan penguraian

(Hostettmann, 1995).

G. Spektroskopi Ultra Violet (UV)

Spektroskopi ultra violet merupakan salah satu dari metode analisis yang

digolongkan dalam metode spektroskopi yang memakai sumber radiasi

elektromagnetik UV dekat (190-380 nm) dengan memakai instrumen

spektrofotometer (Mulja dan Suharman, 1995). Pada umumnya konfigurasi dasar

setiap spektrofotometer UV berupa susunan peralatan optik yang terkonstruksi

dengan susunan tertentu (gambar 3).

Gambar 3 : Bagan spektrofotometer UV berkas ganda (Skoog, et al, 1998)

Dasar dari metode ini adalah interaksi antara radiasi elektromagnetik

dengan atom, molekul atau ion. Dalam praktek spektrofotometri UV untuk

sebagian besar dibatasi pada sistem terkonjugasi (Mulja dan Suharman, 1995).

Analisis kuantitatif spektroskopik berdasarkan hubungan antara jumlah

cahaya yang diabsorpsi dan konsentrasi senyawa pengabsorpsi. Banyaknya cahaya


yang diserap pada frekuensi atau panjang gelombang tertentu sesuai dengan

jumlah molekul yang ada. Hal ini menentukan banyaknya intensitas serapan yang

dinyatakan sebagai transmitan (T), didefinisikan sebagai berikut:

T = IoI = 10-ε.b.c………………………………. (1)

dimana Io adalah intensitas dari energi pancaran yang mengenai cuplikan, I adalah

intensitas pancaran yang keluar dari cuplikan, c adalah konsentrasi, ε adalah daya

serap molar dan b adalah panjang sel.

Rumusan tersebut disempurnakan dalam Hukum Lambert-Beer yang

menyatakan hubungan antara transmisi dengan tebal cuplikan dan konsentrasi

bahan penyerap. Hubungan tersebut dinyatakan sebagai:

A = log T1 = a.b.c …………………............... (2)

Keterangan: T = persen transmitan a = daya serap (L/g.cm) c = kadar zat (g/L) b = panjang sel (cm) A = serapan ( Anonim, 1995b).

Harga ε didefinisikan sebagai daya serap molar. Harga ε adalah

karakteristik untuk molekul atau ion penyerap dalam pelarut tertentu, pada

panjang gelombang tertentu dan tidak bergantung pada konsentrasi dan panjang

gelombang lintasan radiasi (Sastrohamidjojo, 2001).

ε =

dimana c dalam mol/L.


Bila diketahui konsentrasi (c) larutan dalam gram per liter (g/L), maka

persamaan Lambert-Beer dapat ditulis menjadi,

A = A(1%,1cm).b.c …………………………… (3)

A adalah serapan; A(1%,1cm) adalah serapan jenis dari larutan 1% zat terlarut

dalam sel dengan ketebalan 1 cm; b adalah panjang sel dalam cm; dan c adalah

kadar dalam g/L zat (Anonim, 1995b).

Suatu molekul dapat menyerap radiasi elektromagnetik bila mempunyai

kromofor yakni gugus penyerap dalam molekul. Pada senyawa organik dikenal

pula gugus auksokrom yaitu gugus fungsional yang tidak menyerap radiasi namun

bila terikat bersama kromofor dapat meningkatkan penyerapan oleh kromofor atau

merubah panjang gelombang serapan dan intensitas ketika bergabung dengan

kromofor, misal –OCH3, -Cl, -OH dan –NH3 (Christian, 2004).

Pergeseran serapan ada 4 macam yaitu pergeseran batokromik, pergeseran

hipsokromik, hiperkromik, dan hipokromik. Pergeseran batokromik adalah

pergeseran ke arah panjang gelombang yang lebih panjang disebabkan substitusi

atau pengaruh pelarut. Pergeseran hipsokromik adalah pergeseran ke arah panjang

gelombang yang lebih pendek disebabkan substitusi atau pengaruh pelarut,

misalnya dari pelarut nonpolar ke pelarut polar (Sastrohamidjojo, 2001). Efek

hiperkromik adalah kenaikan intensitas serapan. Efek hipokromik adalah

penurunan intensitas serapan (Connors, 1982).

Transisi elektronik senyawa organik yang dapat terjadi yaitu transisi dari

orbital σ→ σ*, π→ π*, n→ σ*, n→ π* yang ditunjukkan oleh gambar berikut:


Gambar 4 : Tingkat energi elektron molekul (Skoog, et al, 1998)

1. transisi elektron n→ π*, meliputi transisi elektron-elektron heteroatom tak

berikatan ke orbital antibonding π* seperti N, S, O, dan Halogen. Serapan ini

terjadi pada panjang gelombang yang panjang dan intensitasnya rendah

2. transisi elektron n→ σ*. Senyawa-senyawa jenuh yang mengandung

heteroatom memiliki elektron-elektron nonbonding, disamping elektron σ,

yang dapat dipromosikan pada panjang gelombang yang pendek, ke keadaan

antibonding σ*. Transisi ini terjadi pada panjang gelombang di bawah 200 nm.

3. transisi elektron π→ π*, terjadi pada elektron di orbital π, yaitu pada ikatan

rangkap dua dan rangkap tiga. Eksitasi ini paling mudah terbaca dan

bertanggung jawab terhadap spektra elektronik dalam daerah UV dan tampak

4. transisi elektron σ→ σ*, terjadi pada elektron yang mempunyai ikatan

tunggal kovalen. Tingkat energi yang dibutuhkan untuk eksitasi ini sangat

besar dan absorpsi elektron σ untuk bertransisi yaitu pada panjang gelombang

sekitar 150 nm (Christian, 2004 ; Sastrohamidjojo, 2001).

H. KETERANGAN EMPIRIS

Dari penelitian ini diharapkan dapat diketahui tipe saponin pada kecambah

kedelai beserta karakternya secara KLT dan spektroskopi UV.


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian yang dilakukan merupakan jenis penelitian non-eksperimental,

karena di dalam penelitian ini tidak dilakukan manipulasi atau intervensi terhadap

subjek uji.

B. Definisi Operasional

1. Identifikasi organoleptik dan makroskopik adalah cara untuk menentukan ciri

khas simplisia yang dilakukan berdasarkan pengamatan terhadap rasa, warna,

bau, dan bentuk dari kecambah kedelai.

2. Uji buih adalah cara untuk mengetahui adanya saponin dengan menggojok

ekstrak air dari kecambah kedelai dalam tabung reaksi sampai terbentuk busa

yang mantap selama 10 menit.

3. Isolasi saponin kecambah kedelai adalah proses pengambilan saponin dari

kecambah kedelai dengan cara kromarografi lapis tipis preparatif.

4. Karakteristik saponin kecambah kedelai secara KLT adalah hasil KLT yang

didapatkan berupa warna bercak dan Rf saponin kecambah kedelai.

5. Karakteristik saponin kecambah kedelai secara spektroskopi UV adalah hasil

spekra isolat saponin kecambah kedelai berupa serapan maksimum pada

panjang gelombang tertentu.


C. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan Penelitian

a. bahan utama : kecambah kedelai varietas Galunggung yang bijinya diambil

dari Balai Pengembangan dan Promosi Agribisnis Perbenihan Tanaman

Pangan, Gunungkidul, Yogyakarta.

b. bahan kimia yang digunakan, kecuali disebut lain, berderajat pro analisis,

yaitu: aquadestilata (diambil dari Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia

Fakultas Farmasi USD), asam asetat anhidrida, asam sulfat, asam klorida,

kloroform, metanol, n-butanol, etanol, natrium sulfat anhidrat, silika gel

GF254, anisaldehid, Succus Liquiritae sebagai pembanding yang diambil dari

Laboratorium Farmasetika Fakultas Farmasi USD (asal

BRATACO/pharmaceutical grade).

2. Alat Penelitian

Bakul bambu, neraca analitik (Metler Toledo), kompor, alat hidrolisis /

pendingin balik, magnetic stirrer, oven, penangas air, atomizer, mikropipet,

sinterred glass, lampu UV 254 nm, alat untuk fotografi, spektrofotometer UV-

Vis Lambda 20 (Perkin Elmer) dan kuvet (Quartz), serta peralatan gelas

(pipet, tabung reaksi, Erlenmeyer, corong pisah, gelas Baker, dan lain-lain).

D. Jalan Penelitian

1. Identifikasi Tanaman

Identifikasi tanaman dilakukan di Balai Pengembangan dan Promosi

Agribisnis Perbenihan Tanaman Pangan di Gunung Kidul, Yogyakarta untuk

memastikan bahwa tanaman yang digunakan untuk penelitian ini adalah benar.


2. Pengumpulan Bahan dan Proses Perkecambahan

Pengumpulan biji kedelai dilakukan dan diambil dari Balai

Pengembangan dan Promosi Agribisnis Perbenihan Tanaman Pangan di

Gunung Kidul, Yogyakarta. Kedelai yang digunakan adalah kedelai varietas

Galunggung. Biji dipilih yang baik untuk dikecambahkan

Proses pembuatan kecambah kedelai adalah dengan merendam biji

kedelai dalam air secukupnya selama satu malam. Simpan biji kedelai di

tempat yang gelap dan lembab dengan menggunakan bakul dari bambu.

Usahakan biji tetap dalam keadaan lembab dengan menyiraminya setiap 5 jam

sekali. Biji mulai berkecambah setelah 24 jam, dan kecambah siap dipakai

setelah 3 hari (Adisarwanto, 2005).

3. Pemeriksaan Organoleptik dan Makroskopik

Pemeriksaan organoleptik dan makroskopik dilakukan berdasarkan

pengamatan terhadap rasa, warna, bau, dan bentuk kecambah kedelai.

4. Uji Saponin

a. Uji buih

Sebanyak 1 g kecambah yang akan diperiksa dihancurkan kemudian

dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas,

didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuk buih

yang mantap selama tidak kurang dari 10 menit (Anonim, 1995)

b. Reaksi Liebermann – Burchard

Sejumlah 1 g bahan dipanasi dengan 1 ml asam asetat anhidrida,

dinginkan, lalu ditetesi dengan asam sulfat pekat 2 tetes. Jika mengandung


senyawa steroid akan terbentuk warna hijau biru, atau akan terbentuk

warna merah muda sampai merah jika mengandung senyawa triterpenoid

(Bruneton, 1999).

c. Reaksi Salkowski

Sebanyak 1 g kecambah kedelai utuh dan kecambah kedelai yang

telah dihancurkan, secara terpisah ditambah kloroform, kemudian

ditambahkan 1 ml asam sulfat pekat. Apabila terbentuk warna kuning yang

lama-kelamaan berubah menjadi merah tua membuktikan adanya senyawa

triterpenoid (Paech and Tracey, 1955).

5. Hidrolisis Saponin Kecambah Kedelai dan Succus Liquiritae

Sejumlah 8 g kecambah kedelai dan 5 g Succus Liquiritae dihidrolisis

secara terpisah dengan 50 ml HCl 1 M selama 2 jam dengan menggunakan

pendingin balik kemudian didinginkan (Harborne, 1987).

6. Ekstraksi Saponin Kecambah Kedelai dan Succus Liquiritae

Hidrolisat yang diperoleh dituang ke dalam Erlenmeyer bertutup,

ditambahkan kloroform 30 ml dan diaduk menggunakan magnetic stirrer

selama 30 menit. Fase kloroform yang terbentuk dipisahkan dengan corong

pisah, larutan fase air asam diekstraksi ulang dengan kloroform sebanyak 3

kali. Fase kloroform yang diperoleh ditambah dengan natrium sulfat anhidrat

lalu disaring. Filtrat yang diperoleh diuapkan di atas penangas air. Hasil yang

diperoleh adalah fraksi kloroform kecambah kedelai dan Succus Liquiritae

yang berisi saponin.


7. Pemeriksaan Pendahuluan Saponin dengan Kromatografi Lapis Tipis

Pemisahan dengan metode KLT ini menggunakan fase diam silika gel

GF254 dan fase gerak kloroform-metanol (95:5 v/v). Pada titik pertama

lempeng ditotolkan fraksi kloroform pembanding Succus Liquiritae sebanyak

5 µl dan pada titik kedua ditotolkan fraksi kloroform kecambah kedelai

sebanyak 10 µl. Jarak penotolan 1,5 cm dari tepi bawah lempeng dengan jarak

pengembangan 10 cm. Setelah eluasi mencapai batas tersebut, lempeng

diangkat dan dikeringkan, kemudian dimasukkan kembali dalam bejana.

Pengembangan berulang dilakukan 2x. Setelah 2x pengembangan, lempeng

dikeringkan, lalu diamati di bawah lampu UV 254 nm. Selanjutnya disemprot

dengan pereaksi anisaldehida-asam sulfat LP, dipanaskan pada suhu 110°C

selama 5-10 menit lalu diamati dengan sinar tampak.

8. Isolasi Saponin dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Isolasi atau pemisahan dari senyawa-senyawa lain dilakukan dengan

metode kromatografi lapis tipis preparatif. Fase diam yang digunakan adalah

silika gel GF254 pada lempeng berukuran 20x20 dengan ketebalan 0,5 mm dan

fase geraknya adalah kloroform:metanol (95:5 v/v).

Pada lempeng dilakukan penotolan 10 µl fraksi kloroform berbentuk

pita, kemudian dikembangkan dengan fase gerak. Setelah pemisahan KLTP

dicapai, pelat dikeringkan kemudian dimasukkan lagi ke dalam bejana.

Pengembangan berulang dilakukan sebanyak 2x.

Setelah pelat dikeringkan, pita yang menunjukkan hasil Rf yang sama

dengan KLT pendahuluan dikerok dan dikumpulkan, kemudian disari dengan


cara kerokan dimasukkan ke dalam sinterred glass lalu ditambah kloroform 5

x 20 ml, lalu disaring. Cairan hasil penyaringan diuapkan di atas penangas air

sampai kering.

Filtrat hasil penguapan diencerkan dengan kloroform kemudian

dilakukan kembali isolasi dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif.

Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF254 pada lempeng berukuran

20x20 dengan ketebalan 0,5 mm dan fase geraknya adalah n butanol:etanol:air

(7:2:5 v/v). Pada lempeng dilakukan penotolan 10 µl fraksi kloroform

berbentuk pita, kemudian dikembangkan dengan fase gerak.

Setelah pelat dikeringkan, pita yang menunjukkan hasil Rf yang sama

dengan KLT pendahuluan dikerok dan dikumpulkan, kemudian disari dengan

cara kerokan dimasukkan ke dalam sinterred glass lalu ditambah kloroform 5

x 20 ml, dan disaring. Cairan hasil penyaringan diuapkan di atas penangas air

sampai kering. Filtrat ini disebut isolat saponin kecambah kedelai dan Succus

Liquiritae.

9. Uji Kemurnian dengan KLT Multi-eluen

Pemisahan dengan metode KLT multi eluen ini menggunakan fase diam

silika gel GF254 dan 3 komposisi fase gerak, yaitu :

1. kloroform:metanol (95:5 v/v),

2. kloroform:metanol:air (64:50:10 v/v), dan

3. n-butanol:etanol:air (7:2:5 v/v) (Stahl, 1973 ; Wagner, 1999 ; Gasparic,

1978).


Pada titik pertama lempeng ditotolkan pembanding dan pada titik kedua

ditotolkan isolat saponin kecambah kedelai. Kedua cuplikan ditotolkan dengan

jumlah yang sama yaitu 10 µl dengan jarak penotolan 1,5 cm dari tepi bawah

lempeng. Selanjutnya lempeng dielusi dengan fase gerak dengan batas elusi 10

cm. Setelah eluasi mencapai batas tersebut, lempeng diangkat dan dikeringkan

di udara selama 10 menit, lalu diamati dengan sinar tampak, di bawah lampu

UV 254 nm. Selanjutnya disemprot dengan pereaksi anisaldehida-asam sulfat

LP, dipanaskan pada suhu 110°C selama 5-10 menit lalu diamati dengan sinar

tampak.

10. Spektroskopi Ultra Violet (UV)

Isolat yang berisi saponin kecambah kedelai diencerkan dengan etanol,

larutan ini kemudian dibaca serapannya dengan spektrofotometer UV pada

panjang gelombang 220-350 nm.

E. Tata Cara Analisis Hasil

Data yang telah diperoleh berupa data kualitatif dan akan dipaparkan secara

deskriptif komparatif, yakni dengan menggambarkan secara apa adanya hasil yang

diperoleh dan dibandingkan dengan standar/pembanding yang sesuai.

Analisis kandungan kimia kecambah kedelai, dalam hal ini untuk

mengetahui golongan saponin dilakukan dengan cara uji pendahuluan yang berupa

uji buih dan reaksi warna (reaksi Liebermann-Burchard dan reaksi Salkowski).

Selain itu untuk analisis golongan saponin pada kecambah kedelai dilakukan juga

KLT, dengan cara membandingkan warna bercak dan Rf dari ekstrak kecambah


kedelai dan ekstrak Succus Liquiritae (yang digunakan sebagai pembanding)

secara kualitatif.

Isolasi saponin kecambah kedelai dilakukan dengan metode KLT

preparatif, sedangkan uji kemurnian isolat dengan menggunakan metode KLT

multi-eluen. Analisis hasil KLT multi-eluen dilihat dari kromatogramnya yang

hanya menghasilkan satu bercak. Untuk menambah data dilakukan juga analisis

secara kualitatif dengan menggunakan spektrofotometri UV untuk melihat

identitas dari isolat.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Identifikasi Tanaman

Berdasarkan hasil identifikasi tanaman yang dilakukan di Balai

Pengembangan dan Promosi Agribisnis Perbenihan Tanaman Pangan, Gunung

Kidul, Yogyakarta, maka dapat diperoleh kepastian bahwa tumbuhan yang

diidentifikasi adalah Glycine max L. (Lampiran 1)

B. Pengumpulan Bahan dan Proses Perkecambahan

Bahan yang digunakan adalah biji kedelai yang diambil dari Balai

Pengembangan dan Promosi Agribisnis Perbenihan Tanaman Pangan di daerah

Gading, Gunung Kidul, Yogyakarta.

Untuk membuat kecambah tidak dikhususkan menggunakan varietas

tertentu. Maka dalam penelitian ini digunakan biji kedelai varietas Galunggung

dengan alasan biji kedelai varietas ini lebih besar dari biji kedelai varietas lain,

sehingga diharapkan saponin yang terkandung lebih banyak.

Proses pembuatan kecambah dilakukan dengam menggunakan biji kedelai

yang baik, artinya biji tidak busuk dan berbentuk baik. Biji kemudian dicuci

bersih dan direndam dalam air secukupnya selama 1 malam. Proses perendaman

ini bertujuan supaya biji menarik air dan kulit bijinya melunak, sehingga dapat

berkecambah. Setelah perendaman selama 1 malam, biji disebar di atas daun

pisang yang diletakkan dalam wadah bambu atau tampah dan ditutup dengan daun


pisang, kemudian disimpan dalam ruang gelap. Biji disebar supaya semua biji

mendapat udara, dan disimpan dalam ruang gelap agar biji dapat berkecambah

dengan baik. Biji kedelai disiram air tiap 5 jam sekali dengan alasan supaya biji

tetap dalam lingkungan yang lembab, sebab jika terlalu sering disiram biji akan

terlalu basah sehingga busuk dan tidak dapat berkecambah. Biji kedelai mulai

berkecambah setelah 1 hari, dan kecambah dapat digunakan setelah 3 hari.

C. Pemeriksaan Organoleptik dan Makroskopik

Pemeriksaan oganoleptik dan makroskopik kecambah kedelai dilakukan

untuk mengetahui ciri-ciri dari kecambah kedelai berdasarkan pengamatan

terhadap bentuk, rasa, warna, dan bau dari kecambah kedelai (Tabel I).

Tabel I : Pemeriksaan organoleptik dan makroskopik terhadap kecambah kedelai

Pemeriksaan Kecambah kedelai Rasa Tawar, agak pahit Warna Putih kekuningan Bau Langu Bentuk Radikel berwarna putih dengan panjang ± 4 cm ; kotiledon

berwarna kekuningan dengan bentuk cembung pada satu sisi dan rata pada sisi lain, jumlah dua, dan duduk berhadapan pada sisi yang rata ; ruas batang lembaga di atas kotiledon (internodium epicotylum)

Kecambah yang digunakan pada penelitian ini dipilih yang baik.

Sebelumnya, kulit biji dibersihkan. Tidak ada definisi spesifik mengenai

kecambah yang baik, karena itu pada penelitian ini kecambah yang dipilih adalah

yang segar/tidak layu, kotiledon tidak rusak, utuh, tidak lembek, serta tidak ada

noda.


D. Uji Saponin

1. Uji buih

Pemeriksaan uji saponin secara sederhana dilakukan terhadap kecambah

kedelai yang telah dihancurkan. Hasil uji buih pada awal menit pertama timbul

buih dengan tinggi lebih kurang 1,5 cm dan setelah dibiarkan 10 menit, buih tetap

ada dengan tinggi yang sama. Hasil yang diperoleh sesuai dengan ketentuan

(Anonim, 1995). Ini menunjukkan bahwa kecambah kedelai mengandung saponin.

Buih dapat terbentuk karena saponin mempunyai sifat dapat menurunkan

tegangan permukaan air. Seperti sabun, saponin mempunyai molekul besar yang

mengandung gugus hidrofilik dan lipofilik. Dalam air, molekul saponin

mensejajarkan diri secara vertikal pada permukaannya, dengan gugus lipofilik

menjauhi air (gambar 4).

OH

COO H

R 2

R 1

H

A B

C D

E

12

34

56

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

1718

1920

21

22

2324

2526

27

28

29 30

OHH

gugus h id rofilik

gugus

lipofili

k

gugus h id ro filik

OHH

Gambar 5 : Mekanisme terbentuknya buih

Adsorpsi molekul saponin pada permukaan air dapat mengakibatkan penurunan

tegangan permukaan air yang dapat menimbulkan buih. Buih merupakan suatu

struktur yang relatif stabil yang terdiri dari kantong-kantong udara terbungkus


dalam lapisan tipis cairan, dispersi gas dalam cairan yang distabilkan oleh suatu

zat penurun tegangan permukaan, dalam hal ini adalah molekul saponin.

2. Reaksi Liebermann-Burchard

Uji reaksi ini dilakukan untuk membuktikan ada tidaknya senyawa

triterpenoid atau steroid dalam kecambah kedelai karena reaksi ini positif dengan

kebanyakan triterpenoid dan steroid. Setelah kecambah kedelai dihancurkan

kemudian dipanaskan dengan asam asetat anhidrat, lalu ditambah asam sulfat

pekat yang berfungsi sebagai katalis menghasilkan warna merah ungu (gambar 5).

Hal ini menunjukkan bahwa kecambah kedelai mengandung triterpenoid.

Substitusi H pada gugus hidroksi dari glikosida saponin triterpenoid dengan gugus

CH3COO- tersebut menyebabkan energi yang dibutuhkan untuk melakukan

transisi elektron ke tingkat eksitasi menjadi lebih kecil. Oleh karena itu, panjang

gelombang menjadi lebih panjang dan intensitas warna meningkat.


OH

COO H

R2

R1

H

A B

C D

E

12

34

56

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

1718

1920

21

22

23 24

2526

27

28

29 30

(CH3 CO)2O

COO H

R2

R1

H

A B

C D

E

12

34

56

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

1718

1920

21

22

2324

2526

27

28

29 30

CH 3COO

+ CH 3COOH

Asam asetat anhidrat

+

Glikosida saponin triterpenoid


H2SO 4

(warna merah ungu)

Gambar 6: Reaksi saponin triterpenoid dengan reagen Liebermann-Burchard

3. Reaksi Salkowski

Reaksi ini untuk mempertegas bahwa senyawa yang terdapat dalam

kecambah kedelai adalah triterpenoid. Hal tersebut dapat dilihat dari hasil positif

adanya warna kuning kecoklatan yang lama-kelamaan berubah menjadi merah tua

setelah ditambah asam sulfat pekat. Kloroform digunakan sebagai pelarut, karena

saponin yang terdapat dalam kecambah kedelai larut dalam kloroform. Sedangkan

asam sulfat pekat yang ditambahkan digunakan sebagai oksidator. Dari warna

yang terbentuk kecambah kedelai mengandung saponin triterpenoid (gambar 6).


Deprotonisasi H pada glikosida saponin triterpenoid kemungkinan menyebabkan

perpanjangan gugus kromofor sehingga intensitas warna yang terjadi meningkat.

OH

COO H

R2

R1

H

A B

C D

E

12

34

56

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

1718

1920

21

22

2324

2526

27

28

29 30

+ H2SO 4 -H +

COO H

R2

R1

H

A B

C D

E

12

34

56

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

1718

1920

21

22

2324

2526

27

28

29 30

O


Glikosida saponin triterpenoid (warna merah tua)

Gambar 7 : Reaksi Salkowski

E. Hidrolisis Saponin Kecambah Kedelai dan Succus Liquiritae

Untuk mendapatkan saponin dari kecambah kedelai dan Succus Liquiritae,

maka dilakukan hidrolisis, karena dengan hidrolisis saponin dapat terurai menjadi

bagian-bagiannya yaitu glikon dan aglikon. Saponin terhidrolisis dalam suasana

asam, maka untuk menghidrolisis saponin dalam kecambah kedelai dan Succus

Liquiritae digunakan asam klorida 0,1 M untuk memberi suasana asam. Hidrolisis

dilakukan selama 2 jam menggunakan alat pendingin balik. Untuk mengetahui

bahwa hidrolisis sudah terjadi dapat diketahui dari perubahan warna yang terjadi.


Kecambah kedelai yang berwarna kekuningan setelah hidrolisis berubah menjadi

coklat. Namun untuk lebih memastikan terjadinya hidrolisis, maka dapat

dilakukan perbandingan KLT sebelum dan sesudah hidrolisis. Biasanya harga Rf

suatu senyawa setelah dihidrolisis akan lebih rendah. Maka dari itu perlu

dilakukan penelitian lebih lanjut untuk memastikan telah terjadinya hidrolisis

saponin pada kecambah kedelai dan Succus Liquiritae.

Pembanding yang digunakan dalam penelitian ini adalah Succus Liquiritae.

Serbuk Succus Liquiritae diperlakukan sama dengan sampel kecambah kedelai.

Succus Liquiritae merupakan ekstrak kering akar segar Glycyrrhiza glabra L.

yang mengandung saponin glisirisin. Saponin glisirisin dari Succus Liquiritae

terhidrolisis dalam suasana asam menghasilkan aglikon asam β-glisiretinat yang

merupakan derivat triterpen pentasiklik dengan tipe β-amirin dan glikon berupa 2

mol asam glukoronat (Anonim, 1995b ; Robbers, et al, 1996 ; Stahl, 1973).

Saponin dari Succus Liquiritae inilah yang digunakan sebagai pembanding

terhadap saponin kecambah kedelai karena menurut uji pendahuluan dengan

reaksi Lieberman-Burchard dan reaksi Salkowski, kecambah kedelai mengandung

senyawa saponin triterpenoid. Dengan alasan ini, Succus Liquiritae digunakan

sebagai pembanding untuk melihat apakah saponin kecambah kedelai mempunyai

tipe yang sama dengan dari Succus Liquiritae.


HO

H

CO O H

O

Gambar 8 : Kerangka asam glisiretinat

OOH

OH

COOH

OHH

O

H

O

OH

O

OH

COOH

COOH

H+

Kalor HO

H

CO O H

O

glisirisin (asam glisirizinat) asam glisiretinat

+

O

OH

COOH

OH

OHH

O

H

O

OH

OH

COOH

2 mol asam glukoronat

Gambar 9 : Mekanisme hidrolisis Succus Liquiritae dalam suasana asam

F. Ekstraksi Saponin Kecambah Kedelai dan Succus Liquiritae

Hidrolisat yang diperoleh dari hidrolisis didinginkan untuk selanjutnya

diekstraksi. Ekstraksi dilakukan dengan penyari kloroform sebanyak 3 x 30 ml


dengan alasan agar semua hasil hidrolisis tersari oleh kloroform. Pemakaian

kloroform dipilih karena saponin larut dengan baik dalam pelarut non polar,

selain itu karena kloroform tidak campur dengan air dan mudah diuapkan.

Setelah penyarian dengan kloroform, fraksi kloroform kecambah kedelai

dan Succus Liquiritae yang terkumpul ditambahkan natrium sulfat anhidrat,

diaduk, kemudian disaring. Tujuan penambahan natrium sulfat anhidrat adalah

untuk menarik sisa-sisa air yang kemungkinan masih ada di dalam ekstrak.

Kemudian filtrat diuapkan di atas penangas air untuk dilakukan pemeriksaan

berikutnya.

G. Pemeriksaan Pendahuluan Saponin dengan KLT

Pemeriksaan pendahuluan dengan KLT dimaksudkan untuk

membandingkan adanya saponin yang sama antara fraksi kloroform kecambah

kedelai dan pembanding fraksi kloroform Succus Liquiritae. Fase diam yang

digunakan adalah silika gel GF254 dan fase gerak kloroform:metanol (95:5 v/v).

Silica gel GF254 merupakan silica gel yang mengandung perekat CaSO4 dan

indikator fluoresensi, sehingga jika dideteksi pada UV 254 nm silica gel akan

berfluoresensi sedangkan bercaknya akan memadamkan fluoresensi. Fase gerak

yang digunakan bersifat non polar sehingga sistem KLT ini merupakan

kromatografi fase normal. Saponin setelah proses hidrolisis cenderung bersifat

non polar, sehingga dengan fase gerak yang digunakan juga bersifat non polar

diharapkan saponin terelusi dengan baik. Fraksi kloroform kecambah kedelai dan

Succus Liquiritae masing ditotolkan 10 µl dengan menggunakan mikropipet

(gambar 9 dan Tabel II).


(1) (2)

Gambar 10 : KLT pendahuluan

Keterangan : A = fraksi kloroform Succus Liquiritae (pembanding) B = fraksi kloroform kecambah kedelai (sampel) Deteksi:

(1) Dilihat dibawah sinar UV 254 nm (2) Deteksi dengan anisaldehid-asam sulfat, dipanaskan 110°C selama 5-10

menit, dilihat dengan sinar tampak Fase diam : silika gel GF254Fase gerak : kloroform:metanol (95:5 v/v) Jarak pengembangan : 10 cm


Tabel II : Hasil kromatogram KLT pendahuluan dengan menggunakan fase diam silica gel GF254 dan fase gerak kloroform:metanol (95:5 v/v)

Nama bercak

Nomor bercak

Rf UV 254 nm Anisaldehid-asam sulfat

A 1 2 3 4 5 6

0,25 0,32 0,38 0,49 0,65 0,92

Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu

Kuning Kuning

Coklat pucat Biru-ungu

- Coklat tua

B 1 2 3 4 5 6

0,19 0,34 0,50 0,65 0,81 0,95

Ungu Ungu Ungu

- Ungu Ungu

- Coklat pucat Biru-ungu

Coklat -

Coklat tua Keterangan : A = fraksi kloroform Succus Liquiritae (pembanding) B = fraksi kloroform kecambah kedelai (sampel) Deteksi : (1) Dilihat dibawah sinar UV 254 nm

(2) Pereaksi anisaldehid-asam sulfat, dipanaskan 110°C selama 5-10 menit

Dari hasil kromatogram yang menghasilkan banyak bercak tersebut

terdapat beberapa bercak yang mempunyai Rf dan warna yang sama. Bercak

tersebut adalah A4 dengan Rf 0,49 dan B3 dengan Rf 0,50 yang berwarna biru–

ungu, serta bercak A6 dengan Rf 0,92 dan B6 dengan Rf 0,95 dengan warna

coklat tua. Menurut Stahl (1985), bercak asam glisiretinat yang merupakan

saponin golongan triterpenoid berwarna biru-ungu dengan hRf sekitar 20-30 pada

fase diam silica gel GF254 asam (yang dibuat dengan asam o-fosfat 0,25 % sebagai

pengganti air) dan fase gerak kloroform:metanol (95 : 5 v/v), pengembangan 2x

suhu percobaan 20°C, dan deteksi dengan anisaldehid-asam sulfat (dipanaskan

selama 5 menit pada suhu 105°C). Maka kedua bercak A4 dan B3 yang mendekati

referensi inilah yang selanjutnya akan diisolasi. Perbedaan Rf yang terjadi antara


penelitian dengan literatur mungkin karena fase diam yang dipakai berbeda, juga

kondisi percobaan yang berbeda karena pada penelitian suhu yang dipakai adalah

suhu ruangan (± 25-27°C), sehingga memungkinkan terjadinya Rf lebih tinggi.

Selain itu dari hasil penelitian sebelumnya tentang saponin, menyatakan bahwa

hRf saponin triterpenoid golongan β-amirin sekitar 55 dengan warna kebiruan

setelah dideteksi dengan anisaldehid-asam sulfat (Yanuarsih, 2001).

H. Isolasi Saponin dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Isolasi dengan kromatografi lapis tipis preparatif dilakukan untuk

memperoleh isolat yang mengandung saponin yang dimaksud. Fase diam yang

digunakan adalah silika gel GF254 pada plate kaca 20 x 20 cm. Fase gerak yang

digunakan pada tahap pertama adalah kloroform:metanol (95:5 v/v) karena pada

KLT pendahuluan menghasilkan pemisahan yang cukup baik. Setelah

pengembangan berulang sebanyak 2x, hasil eluasi yang menunjukkan Rf yang

sama dengan KLT pendahuluan kemudian dikerok dengan hati-hati menggunakan

spatula dan dikumpulkan. Pengembangan berulang dimaksudkan untuk mencapai

keefisienan pemisahan, karena semakin banyak dilakukan pengembangan

berulang, pemisahan senyawa semakin baik. Dalam penelitian ini, 2x

pengembangan sudah menghasilkan pemisahan yang cukup baik karena bercak

yang didapat terlihat jelas dan tidak terlalu dekat satu sama lain, sehingga lebih

mudah untuk dikerok. Hasil kerokan kemudian disaring dengan kloroform

menggunakan sinterred glass lalu diuapkan. Jumlah fase diam yang digunakan

pada isolasi ini sejumlah 5 plate dengan maksud agar isolat yang didapat lebih

banyak. Jumlah kloroform yang digunakan untuk menyari adalah 5 x 20 ml


berdasarkan alasan bahwa untuk menyaring menggunakan sinterred glass hasil

kerokan harus benar-benar terendam oleh pelarut, dan dilakukan minimal 3x

sehingga penyaringan dilakukan sebanyak 5x.

Isolat tahap pertama yang didapatkan kemudian diisolasi kembali dengan

metode yang sama. Fase diam yang digunakan sama dengan sebelumnya, namun

fase gerak yang dipakai adalah n-butanol:etanol:air (7:2:5 v/v) alasannya karena

ternyata setelah isolat tahap pertama diuji kemurniannya dengan fase gerak

tersebut, masih bisa terpisahkan menjadi 2 bercak dengan Rf sekitar 0,8 berwarna

biru ungu dan Rf sekitar 0,88 berwarna coklat (gambar 10). Hal ini dapat terjadi

kemungkinan karena kekuatan pemisahan fase gerak ini paling baik. Dengan

begitu maka akan timbul pertanyaan mengapa pada KLT pendahuluan, fase gerak

ini tidak digunakan. Hal tersebut karena pada KLT pendahuluan, yang ditotolkan

adalah ekstrak kloroform kecambah kedelai dan Succus Liquiritae yang pekat,

sehingga fase gerak ini malah tidak cukup baik memisahkan.


Gambar 11 : Uji kemurnian isolat tahap pertama dengan fase gerak n-butanol:etanol:air (7:2:5 v/v)

Keterangan : A = isolat saponin kecambah kedelai (sampel) B = isolat saponin gabungan (Succus Liquiritae dan kecambah kedelai) C = isolat saponin Succus Liquiritae (pembanding) Deteksi : anisaldehid-asam sulfat, dipanaskan 110°C selama 5-10 menit, dilihat

dengan sinar tampak Fase diam : silika gel GF254Jarak pengembangan : 10 cm


Pada isolasi tahap yang kedua, langkah yang digunakan sama seperti isolasi

tahap pertama, hanya saja tidak dilakukan pengembangan berulang, karena fase

gerak ini sudah memisahkan dengan baik dengan satu kali eluasi. Bercak yang

diisolasi adalah bercak dengan Rf sekitar 0,8 (bercak yang bawah) karena bercak

tersebut pada KLT uji kemurnian isolat tahap pertama menghasilkan warna biru

ungu (sesuai literatur). Sehingga akhirnya didapatkan isolat yang murni yang

berisi saponin kecambah kedelai dan Succus Liquiritae yang dimaksud.

I. Uji Kemurnian dengan KLT Multi-eluen

Isolat saponin yang didapat kemudian diuji kemurniannya dengan KLT

multi-eluen (Gambar 10, 11, dan 12). Fase gerak yang digunakan berbeda-beda

dengan maksud untuk melihat apakah isolat tersebut benar-benar murni, karena

jika isolat tersebut merupakan 1 senyawa murni maka hanya memberi satu bercak

saja untuk setiap fase gerak yang berbeda. Fase gerak yang dipakai dalam uji

kemurnian ini adalah kloroform:metanol (95:5 v/v), kloroform:metanol:air

(64:50:10 v/v) dan n-butanol:etanol:air (7:2:5 v/v). Adapun alasan digunakan 3

fase gerak karena untuk uji kemurnian dengan KLT multi-eluen paling sedikit

dipakai 3 fase gerak yang berbeda. Fase gerak-fase gerak yang dipilih berdasarkan

tingkat kepolarannya sehingga dapat diketahui benar kemurniannya. Fase gerak

kloroform:metanol (95:5 v/v) bersifat non polar, sedang kloroform:metanol:air

(64:50:10 v/v) dan n-butanol:etanol:air (7:2:5 v/v) bersifat semi polar.


Tabel III : Uji kemurnian isolat saponin dengan beberapa fase gerak

Fase gerak

Nomor bercak

Rf UV 254 nm

Anisaldehid-asam sulfat

A 0,45 Ungu Biru-ungu Kloroform:metanol (95:5 v/v) B 0,46 Ungu Biru-ungu

A 0,93 Ungu Biru-ungu Klorofrom:metanol:air (64:50:10 v/v) B 0,94 Ungu Biru-ungu

A 0,78 Ungu Biru-ungu n-butanol:etanol:air (7:2:5 v/v) B 0,81 Ungu Biru-ungu

Keterangan :

A = isolat Succus Liquiritae (pembanding) B = isolat kecambah kedelai (sampel) Deteksi : (1) Dilihat dibawah sinar UV 254 nm

(2) Pereaksi anisaldehid-asam sulfat, dipanaskan 110°C selama 5-10 menit


(1) (2)

Gambar 12 : Uji kemurnian dengan KLT multi-eluen

dengan fase gerak kloroform:metanol (95:5 v/v)

Keterangan : A = isolat saponin Succus Liquiritae (pembanding) B = isolat saponin kecambah kedelai (sampel) Deteksi:

(1) Dilihat dibawah sinar UV 254 nm (2) Deteksi dengan anisaldehid-asam sulfat, dipanaskan 110°C selama 5-10

menit, dilihat dengan sinar tampak Fase diam : silika gel GF254Jarak pengembangan : 10 cm


(1) (2)

Gam

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ISOLASI DAN...

Documents

Transcript of PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ISOLASI DAN...