DEPARTEMEN FARMAKOGNOSI DAN FITOKIMIAFAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA

PETUNJUK PRAKTIKUMFITOFARMASI

Semester Gasal 2015/2016

Disusun oleh :Idha Kusumawati

Suciati

2

PERATURAN

1. Mahasiswa peserta praktikum fitofarmasi wajib mentaati peraturan yang berlaku dan

mengikuti semua kegiatan praktikum yang telah dijadwalkan

2. Mahasiswa peserta praktikum fitofarmasi yang tidak mengenakan jas lab dan kartu tanda

peserta praktikum, tidak diijinkan mengikuti praktikum fitofarmasi

3. Mahasiswa peserta praktikum fitofarmasi tidak dijinkan keluar dari laboratorium selama

praktikum berlangsung tanpa ijin dari dosen pembimbing/dosen koordinator praktikum

4. Sebelum praktikum mahasiswa peserta praktikum menandatangani presensi, tidak boleh

diwakilkan

5. Mahasiswa peserta praktikum harus datang tepat waktu, keterlambatan lebih dari 15

menit tanpa alasan yang jelas, tidak diijinkan mengikuti praktikum

6. Mahasiswa peserta praktikum harus membawa sendiri peralatan pribadi seperti lap, tissue,

pipet panjang, pipet pendek

7. Tiap kelompok membawa buku sebagai catatan harian praktikum

8. Laporan harian praktikum dikumpulkan sehari sebelum praktikum berikutnya ke dosen

pembimbing

9. Laporan akhir praktikum diserahkan paling lambat 1 minggu setelah semua praktikum

berakhir pada koordinator praktikum.

10. Mahasiswa yang berhalangan mengikuti materi praktikum karena suatu hal harus

mendapat ijin dari koordinator praktikum dan harus mengganti di lain hari pada materi

yang sama.

11. Pada praktikum ini ada beberapa prosedur yang tidak sesuai dengan persyaratan

dikarenakan keterbatasan alat, bahan serta waktu

3

Jadwal PraktikumJadwal praktikum

Minggu KelompokI II III IV

1 Pengarahan praktikum2 Diskusi dengan pembimbing*3 Pre test4 Materi 1 Materi 2 Materi 3 Materi 4

5 Materi 2 Materi 3 Materi 4 Materi 1

6 Materi 3 Materi 4 Materi 1 Materi 2

7 Materi 4 Materi 1 Materi 2 Materi 3

Keterangan:

* Diskusi dilakukan secara pararel dengan pembimbing masing-masing materi. Waktuyang dialokasikan untuk masing-masing materi adalah 50 menit.

4

MATERI I : DETEKSI SENYAWA MARKER SPESIFIK PADA CABE JAWA DANMERICA HITAM

Bahan Praktikum :1.Serbuk simplisia Cabe Jawa2.Serbuk simplisiaMerica3.Sampel Campuran dengan perbandingan

- Cabe Jawa: Merica (75:25)- Cabe Jawa:Merica (50:50)- Cabe Jawa:Merica (25:75)

Prosedur :1. Preparasi Sampel

50,0 mg masing-masing sampel campuran dan simplisia tunggal dimasukkan dalam labuukur 5 ml, ditambah dengan 3,0 ml n-hexane diekstraksi dengan menggunakanmicrowave dengan power 30% selama 2 x 10 detik, kemudian tambahkan n-hexane ad5,0 ml. Saring larutan dengan kertas saring rangkap 2 menggunakan filter holder.

2. Penotolan sampelSampel ditotolkan menggunakan plate silica gel (NP, 60 F254, Merck) menggunakanautosampler (Camag TLC Automatic Sampler Linomat 5) dengan kondisi sebagai berikut:

Band Length : 7 mmJumlah track : 5

Posisi penotolanTrack Volume

penotolan (μL)Sample

1 35 Cabe Jawa2 35 Sampel 75%3 35 Sampel 50%4 35 Sampel 25%5 35 Merica

3. EluasiEluasi plate menggunakan automatic developing chamber (ADC2) dengan eluenKloroform: Hexane (35:5) buat 40 mL.

4. Analisis menggunakan visualizerPlate discanning menggunakan Camag Visualizer dengan lampu UV 366 nm

5. Analisis dengan Scanner 3Plate discanning menggunakan Camag Scanner 3 pada lamda 366 nm.

Data yang anda peroleh:1. Kromatogram masing-masing sampel dibuat overlay2. Rf senyawa marker3. Profil UV spektra untuk menentukan peak purity dan peak identity dari masing-masing

senyawa marker spesifik.

5

MATERI II : PENETAPAN KADAR Etil p-Metoksi Sinamat (EPMS) DALAMEKSTRAK KENCUR

Bahan Praktikum :- Ekstrak kencur- Standar EPMS

Prosedur :A. Pembuatan larutan standard EPMS

1. Ditimbang 50,0 mg standart EPMS.2. Dilarutkan dengan etanol 96% secukupnya.3. Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml4. Diultrasonik sampai larut kemudian ditambahkan etanol 96% sampai tepat 10 ml

sehingga diperoleh larutan strandar EPMS dengan kadar 5.000 ppm.5. Larutan baku induk diencerkan untuk mendapatkan konsentrasi 400, 600, 800, 1000

dan 1200 ppm. (masing-masing dibuat dalam volume 5 mL)Keterangan: larutan baku induk disiapkan oleh laboran

B. Preparasi Sampel1. Timbang sampel sejumlah 20 mg, masukkan dalam labu ukur 10 mL, tambahkan 5

mL etanol 96%.2. Lakukan ekstraksi dengan microwave 2 x 10 detik dengan power 30%3. Keluarkan sampel dari microwave, kemudian tambahkan etanol 96% ad 10 mL.4. Pindahkan larutan ke venoject lalu sentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 5

menit.5. Saring larutan dengan kertas saring rangkap 2 menggunakan filter holder.6. Lakukan replikasi sampel sebanyak 3 kali

C. Penotolan sampel dan penetapan kadar1. Disiapkan plat KLT tinggi 10 cm2. Standar ditotolkan sebanyak 2 μL, sedangkan sampel ditotolkan pada plat KLT

sebanyak 4 μL dengan menggunakan Camag TLC Automatic Sampler Linomat 5,dengan posisi sebagai berikut:batas bawah penotolan = 1,5 cmbatas atas eluasi = 0,5 cmjarak totolan tepi kiri = 1.5 cmjarak antar totolan = 1,5 cmBand Length : 7 mmJumlah track : 8

Tabel 2.1 Posisi penotolan sampel dan standarTrack Sample ID

1 St 400 ppm2 Sample 13 St 600 ppm4 St 800 ppm5 Sample 26 St 1000 ppm

6

7 Sample 38 St 1200 ppm

3. Eluasi plate menggunakan automatic developing chamber (ADC2) dengan eluenheksan : Etil asetat (9:1) Buat eluen sebanyak 40 mL.

4. Plat KLT yang telah selesai dieluasi kemudian dipayar dengan densitometer pada λ =306 nm.

5. Kadar EPMS dalam sampel ditentukan berdasarkan perbandingan luas area nodasampel dan standar EPMS.

Analisis dengan TLC Scanner 3

1. Untuk menentukan panjang gelombang maksimum EPMS plat KLT dipayar pada

panjang gelombang 200-500 nm menggunakan alat TLC scanner. Dari sini dapat

diketahui pada panjang gelombang berapa EPMS memberikan absorban maksimum.

Panjang gelombang tersebut yang akan digunakan untuk pengukuran.

2. Tentukan peak purity dan peak identity

3. Dari data yang diperoleh tentukan kadar EPMS dalam sampel (%b/b), %KV dan Vx0

7

MATERI III : UJI AKTIVITAS ANALGESIK DENGAN METODE WRITHINGTEST

Bahan Praktikum :1. Ekstrak kencur2. Parasetamol

Prosedur :Perhitungan dosis

- Hewan coba yang akan digunakan adalah 5 ekor per kelompok, masing-masingakan mendapatkan 0,4 ml/20 g BB mencit

- Ekstrak kencur akan diberikan dengan dosis manusia (ekstrak yang mengandungepms 30 mg)

- Paracetamol diberikan dengan dosis 500 mg- Hitung berapa yang diberikan ke masing-masing mencit- Hitung berapa banyak ekstrak yang harus ditimbang

Preparasi Sampel1. Timbang ekstrak kencur/paracetamol sejumlah tertentu (dihitung dengan

membuat korelasi dosis ke mencit)2. Buatlah masing-masing menjadi suspensi menggunakan CMC-Na 0,5%

Penyiapan hewan coba :1.Hewan coba diaklimatisasi selama 1 minggu, sebelum digunakan untuk uji dipuasakan

selama kurang lebih 16 jam, dibagi menjadi 3 kelompok yang masing-masing terdiri 5ekor

2.Pemberian sampelKelompok 1: diberi suspensi ekstrakKelompok 2: kontrol posistipKelompok 3: kontrol negatip

3. 20 menit setelah pemberian treatment diinjeksi intra peritonial dengan asam asetat 0,6 %0,2 ml/25 g pada hewan coba

4. 10 menit setelah induksi dilakukan penghitungan geliatan selama 30 menit (direkam)5. Uji statistik menggunaka Anava

8

MATERI IV : PENGUJIAN PENANGKAP RADIKAL BEBAS DPPH SECARASPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

Bahan Praktikum :1.Ekstrak etanol 96% Merica hitam2. Ekstrak etanol 70% Merica hitam3. Ekstrak etanol 50% Merica hitam4. Vitamin C5. Larutan DPPH 0,004%

1. Preparasi SampelMasing-masing kelompok mengerjakan Vitamin C dan 1 sampel

Tabel 4.1. Jumlah sampelSampel BeratEkstrak etanol 96% 250 mgEkstrak etanol 70% 250 mgEkstrak etanol 50% 250 mgVitamin C 10 mg

Vitamin C- Timbang vitamin C 10 mg, larutkan dengan sedikit metanol, masukkan dalam labu

ukur 50 mL. Bilas cawan timbang beberapa kali dengan metanol, pastikan semua zatterpindahkan ke dalam labu ukur. Tambahkan metanol ke dalam labu ukur ad 50 mL.

- Dari larutan induk diatas buat pengenceran dengan sesuai tabel berikut- Pengenceran tiap konsetrasi dibuat dalam volume 5 mL.

Sampel- Timbang sampel sesuai dengan pembagian kelompok anda.- Masukkan sampel ke dalam labu ukur 25 mL, tambahkan air 5 mL, lalu microwave 2 x

10 detik dengan power 30%- Keluarkan sampel dari microwave, kemudian tambahkan metanol 10 mL, dan

microwave 2 x 10 detik dengan power 30%.- Tambahkan metanol ad 25 mL- Pindahkan larutan ke venoject lalu sentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 5

menit.- Saring larutan dengan kertas saring rangkap 2 menggunakan filter holder.- Campur larutan hasil penyaringan dalam satu wadah, homogenkan.- Masing-masing sampel (ekstrak) diencerkan seperti tabel berikut, dari larutan induk

dan dibuat dengan volume 2 mL.

9

Tabel 4.2 Konsetrasi sampelSampel Pengenceran (ppm)Ekstrak 96% 10.000

7500500025001000500

Ekstrak 70% 75006000450030001500750

Ekstrak 50% 75006000450030001500750

Vitamin C 50403020105

1. Pembuatan larutan DPPH 0,004%

- Timbang DPPH (4,0 mg) dengan cawan timbang- Tambahkan metanol (10-20 mL) untuk melarutkan DPPH- Pindahkan larutan ke dalam labu ukur 100 mL- Bilas cawan timbang dengan metanol beberapa kali. Pastikan semua DPPH larut dan

terpindahkan ke labu ukur.- Larutan DPPH dijaga pada temperatur rendah dan terlindung dari cahaya. Proses

tersebut menggunakan gabungan metode dari Rai et.al (2009), Huang et.al (2010),Ersam dan Mudjirahmini (2006).

- Bungkus labu ukur dengan aluminium foil untuk melindungi DPPH dari cahaya.

1. Pengukuran

Blanko Metanol

Pengukuran antiradikal bebas panjang gelombang 497 nm, 517 nm dan 537 nm1. Absorbansi DPPH yang dipakai pada praktikum ini adalah 0,8 – 0,82 pada panjang

gelombang 517 nm.

10

2. Ukur absorbansi larutan DPPH 0,004%. Pada lambda 517. Jika absorbansi terukur beradadi atas rentang yang diperbolehkan, maka lakukan pengenceran, dengan menggunakanrumus Lambert Beer.

3. Jika diatas nilai tersebut, maka lakukan pengenceran dengan metanol hingga diperolehabsorbansi yang diinginkan.

4. Pengenceran larutan DPPH lakukan dalam jumlah kecil terlebih dahulu (skala kuvet 1.5mL). Jika nilai absorbansi yang diperoleh sudah benar, maka dilakukan pengencerandalam jumlah besar sesuai kebutuhan.

5. Ukur absorbansi larutan DPPH hasil pengenceran sebanyak 5 kali6. Penentuan persen peredaman DPPH untuk sampel dan vitamin C:

Masing-masing konsentrasi dipipet sebanyak 150,0 µL ditambah dengan 1350,0 µLlarutan DPPH (sehingga kadarnya menjadi 1/10 nya).

7. Perhitungan kapasitas antiradikal bebas ekstrak diukur dari peredaman warna ungu merahDPPH yaitu pada puncak 517 nm. Untuk itu digunakan persamaan sebagai berikut:

Absorban hitung larutan metanol 517 nm = A517 -2

537497 AA

Perhitungan antiradikal bebas sebagai persen peredaman absorban pada puncak 517 nmmenggunakan rumus sebagai berikut:

% peredaman DPPH = %100tan

1 xDPPHAbsorbansi

ujilaruhitungAbsorbansi

Nilai 0% berarti tidak mempunyai aktivitas antiradikal bebas, sedangkan nilai 100% berartiperedaman total dan pengujian dilanjutkan dengan pergerakan bahan uji untuk melihatbatas konsentrasinya.

8. Nilai IC50 masing-masing sampel tersebut diperoleh dengan melakukan analisis regresilinier dengan konsentrasi (ppm) sebagai absis dan % peredaman sebagai ordinatnya

Tentukan:- IC50 sampel- IC50 vitamin C