PERCOBAAN XI

PENENTUAN COLIFORM DAN COLI TINJA

PADA SAMPEL AIR

1. TEKNIK PENGAMBILAN SAMPEL

Hal-hal yang harus diperhatikan

Hasil analisis laboratorium tidak hanya ditentukan oleh faktor ketelitian dalam

melakukan prosedur analisis di laboratorium, melainkan juga sangat ditentukan oleh

prosedur pengambilan dan penanganan sampel. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam

pengambilan sampel adalah

1. Harus ditentukan lokasi sampling yang tepat, agar sampel cukup representatif. Yang

dimaksudkan dengan sampel representatif adalah : benar-benar mempunyai

karakteristik yang mewakili kualitas air dari lokasi di mana sampel tersebut

diperoleh.

2. Botol sampel harus bersih dan steril

3. Cara pengambilan sampel harus se-aseptik mungkin.

4. Selama pengambilan sampel tidak perlu dilakukan pembilasan

5. Sebaiknya botol tidak dipenuhi oleh sampel (biarkan 2,5 cm kosong) agar

memudahkan homogenisasi.

Teknik pengambilan sampel

Dari saluran distribusi air minum

Bukalah kran semaksimum mungkin dan biarkan air mengalir selama 2-3 menit.

Setelah itu kurangi kecepatan aliran air, sehingga memungkinkan air

tertampung dalam botol sampel tanpa memercik ke luar atau tumpah. Hindarkan

pengambilan sampel dari kran bocor atau tidak dapat berfungsi dengan baik.

Dari air sumur

Pompalah air dari sumur clan biarkan air mengalir selama 5 menit. Lalu

tampung sampel air seperti prosedur di atas. Apabila tidak tersedia pompa air,

ambillah sampel langsung dari dalam sumur dengan memberikan pemberat pada

botol sampel.

Dari air permukaan

Usahakan memilih lokasi sampling di mana terjadi pencampuran air yang

sempurna. Jangan memilih lokasi yang terlalu dekat dengan tepian sungai.

Hindarkan lokasi sampling di mana air tidak mengalir dengan konstan. Arahkan

mulut botol pada posisi melawan arus.

Penanganan sampel

Apabila sampel air tidak dapat segera dianalisis dalam waktu 1 jam setelah waktu

pengambilannya, gunakan fasilitas pendingin untuk menyimpan sampel tersebut.

Usahakan agar waktu pengangkutan sampel dalam kotak pendingin ice

laboratorium tidak lebih dari 6 jam. Setiba di laboratorium, masukkan semua

sampel ke lemari pendingin, dan usahakan agar kegiatan analisis dapat selesai

dalam waktu 2 jam.

2. PENENTUAN COLIFORM PADA SAMPEL AIR

Metode penentuan tingkat pencemaran miktoorganisme pada air minum dan air permukaan

yang umum dilakukan pada saat ini adalah teknik membran filter untuk penentuan bakteri

coliform dan coli tinja. Karena sifatnya yang lebih cepat dan lebih reprodusibel, metode ini

lebih unggul bila dibandingkan dengan metode Most Probable Number, atau MPN.

Kelemahan pada membran filter terletak pada kepekaannya terhadap gangguan yang

disebabkan oleh kekeruhan air. Kekeruhan air yang disebabkan oleh partikel-partikel zat

organik yang tinggi dapat mengganggu pertumbuhan koloni mikroorganisme. Selain itu basil

analisis dapat pula terganggu apabila dalam sampel terdapat zat beracun atau bakteri jenis

lain dalam jumlah besar.

Metoda membran filter

Metode ini menggunakan prinsip filtrasi dengan menggunakan membran filter dengan

ukuran porositas 0,45 µm. Untuk pengujian air minum diperlukan 100-150 ml, sampel

yang dilewatkan pada membran filter steril (Sampel yang ideal adalah sampel yang

dapat menghasilkan 50 - 200 koloni). Filter yang telah mengandung bakteri selanjutnya

ditaruh secara aseptik pada media steril yang sesuai di dalam cawan petri. Untuk

penentuan coliform total digunakan media M-Endo, sedangkan untuk penentuan bakteri

coli tinja digunakan media M-FC. Untuk penentuan coliform total diperlukan suhu

inkubasi 35 ± 0,5° C selama 22-24 jam, adapun untuk penentuan coli tinja diperlukan

waktu inkubasi selama 24 ± 2 jam pada suhu 44,5 ± 0,5 °C.

Metode MPN

Dalani metoda ini terdapat 3 tahap pengujian yaitu

1. Uji Presumtif (presumptive test)

Tahap ini merupakan uji spesifk terhadap bakteri coliform. Setiap sampel air

membutuhkan 15 tabung reaksi yang masing-masing berisi 10 ml kaldu laktosa dan

sebuah tabung Durham yang terbalik disterilisasi terlebih dahulu. Selanjutnya 5 buah

tabung berisi kaldu laktosa diisi dengan sampel 10 ml air sampel, 5 buat lainnya diisi

dengan 1 ml sampel air dan selebihnya diisi dengan 0,1 nil sampel air Seluruh tabung

diinkubasi pada suhu 35 ± 0,5°C selama 24 ± 2 jam. Apabila terdapat bakteri

coliform, maka akan terbentuk gas yang terlihat di dalam tabung Durham.

2. Uji konfirmasi (confirmath test)

Uji ini perlu dilakukan untuk memastikan bahwa pembentukan gas pada tabung

Durham benar-benar dihasilkan oleh aktifitas bakteri coliform. Untuk itu biakan pada

media kaldu laktosa yang memberikan basil positif diinokulasikan dengan jarum ose

ke dalam tabung reaksi yang berisi media selektif cair Brilliant Green Lactosa Bile

Broth (BGLBB) yang dilengkapi dengan tabung Durham. Kemudian biakan

diinkubasi pada suhu dan waktu inkubasi yang sesuai untuk tujuan analisis

(penentuan coliform atau coli tinja) Terbentuknya gas pada tabung Durham

menunjukkan uji konfirmasi ini positif.

3. Uji pelengkap (completed test)

Uji ini dilakukan terhadap biakan pada uji konfirmasi yang memberikan hasil positif.

Dengan menggunakan jarum ose, biakan dengan hasil positif tersebut diinokulasikan

pada media Eosine Methylene Blue (EMB) di cawan petri. Bakteri

Escherichia Coli membentuk koloni berwarna gelap dengan kilauan metalik

kehijauan. Sedangkan bakteri coliform lainnya misalnya Enterobacter aerogenes

koloni yang membentuk warna gelap dengan kilau metal diisolasi dan ditumbuhkan

pada media agar miring nutrient broth. Selanjutnya dilakukan uji pewarnaan grain

pada biakan yang berumur 24-48 jam. Apabila diperoleh bakteri berbentuk batang,

gram negatif, maka hasil pengujian dengan metode MPN ini positif

Jumlah biakan pada media BGLBB yang memberikan hasil positif pada uji pelengkap

untuk setiap seri tabung (dengan sampel pada media kaldu laktosa 10 ml, 1 ml, dan 0,1 ml)

dicatat. Dengan data tersebut, jumlah bakteri coliform atau coli tinja pada setiap 100 ml sampel

air dapat ditentukan dengan menggunakan Tabel Hopkins.

Kelemahan metode MPN adalah

1. Sampel air yang digunakan hanya sedikit

2. Waktu yang dibutuhkan untuk analisis cukup lama

3. Jumlah bakteri diperoleh hanya berdasarkan perkiraan.

4. Membutuhkan banyak media dan peralatan.

5. Tidak dapat dilakukan dilapangan.

Alat-alat :

Botol sampel air, cawan petri steril, pipet steril (10 ml dan 1 ml), bunsen, inkubator,

tabung reaksi.

Bahan-bahan :

Contoh air, laktosa cair dengan tabung durham terbalik di dalamnya, media EMB dan

Endoagar, zat pewarna gram, zat pewarna spora.

Prosedur :

A. Uji Duga

1. Inokulasi 3 tabung berisi 10 ml laktosa cair konsentrasi 2 kali lipat (double strenght

lactosa broth) dengan masing-masing 10 ml air contoh.

2. Inokulasi 3 tabung berisi masing-masing 10 ml laktosa cari (single strenght lactosa broth)

dengan 1,0 ml masing-masing dari contoh air.

3. Inokulasi 3 tabung masing-masing berisi 10 ml laktosa cair (single strenght lactosa broth)

dengan 0,1 ml air contoh kedalam masing-masing tabung.

4. Inkubasikan semua piaraan itu pada suhu 35 - 37C selama 48 jam.

5. Amati setiap 24 jam. Timbulnya gas setelah 24 jam menunjukkan uji positif dan

terbentuknya gas pada 24 jam kedua menunjukkan uji yang meragukan. Sedangkan tidak

timbulnya gas setelah 48 jam, uji dinyatakan negatif yang menunjukkan bahwa air contoh

tidak tercemar.

B. Uji Penetapan.

1. Pada uji ini semua hasil uji duga baik positif maupun meragukan harus dilakukan.

2. Buatlah piaraan goresan pada EMB atau Endoagar dari mikrobia yang tumbuh pada

laktosa cair (uji duga) yang positif dengan inokulan yang paling sedikit.

3. Inkubasikan piaraan itu pada suhu 37C selama 48 jam.

4. Amati pertumbuhan koloni tipikal yang menunjukkan uji positif.

C. Uji Lengkap

1. Ambillah 2 koloni tipikal pada EMB atau Endoagar dan masing-masing dinokulasi

kedalam tabung berisi laktosa cair yang berisi tabung durhan serta dibuat piaraan miring

pada nutrient agar.

2. Inkubasikan pada suhu 37C selama 48 jam.

3. Amati terbentuknya gas didalam tabung setiap 24 jam

4. Buatlah pewarnaan gram dari piaraan agar miring dan juga pewarnaan spora (apabila

mikrobia tersebut membentuk gas, gram negatif, berbentuk batang, tidak berspora

menunjukkan bahwa mikrobia yang diisolasi dari uji duga positif termasuk bakteri

kelompok coli dan menunjukan air tersebut telah tercemar.

D. Penentuan coli fekal dan non fekal

1. Inokulasi tabung berisi laktosa cair dengan koloni tipikal pada EMB.

2. Inkubasikan pada suhu 44,5C selama 48 jam.

3. Amati terbentuknya gas setiap 24 jam, (terbentuknya gas dalam tabung laktisa cair itu

menunjukkan bahwa bakteri yang diuji baru keluar bersama feses, bukan bakteri bentuk

coli yang telah lama berada pada lingkungan. Coli fecal adalah Escherichia Coli.

E. Menentukan jumlah bakteri bentuk coli

Perhitungan banyaknya bakteri bentuk coli yangada didalam sampel air dapat ditentukan

dnegan Most Probable Number (MPN). Tabel MPN berikut adalah berdasarkan 3 tabung

berisi 10 ml contoh air, 3 tabung berisi 1 ml contoh air dan 3 tabung berisi 0,1 ml contoh air.

Hasilnya menunjukkan MPN bakteri bentuk coli setiap 100 ml air contoh.

1. Catatlah banyaknya tabung laktosa yang positif (ada gas didalam tabung durham) untuk

seiap seri pengenceran.

2. Cocokkan angka-angka itu (jumlah tabung positif) pada tabel MPN seri 3 (karena dipakai

3 tabung). Akan didapatkan MPN bakteri bentuk coli per 100 ml air contoh.

Contoh :

Misalkan didapatkan angka sebagai berikut (lihat tabel MPN)

Jumlah Tabung

10 ml air contoh 1 ml air contoh 0,1 ml air contoh

3 2 3

Maka didapatkan MPN untuk bakteri bentuk coli sebesar 290 per 100 ml air contoh.

Tugas

1. Ambillah 1 sampel air dengan botol steril sesuai dengan prosedur untuk 1 kelompok

praktikan (4 orang)

2. Lakukan penentuan bakteri coliform yang terdapat dalam sampel tersebut sampai dengan uji

konfirmasi. Gunakan tabel Hopkins untuk menentukan jumlah coliform yang ada pada

sampel.

Pertanyaan :

1. Sebutkan alasan mengapa digunakannya bakteri E. coli sebagai indikator mikroorganisme

pada kualitas air minum?

2. Mengapa prosedur analisis kualitatif air lebih baik daripada analisis kuantitatif air?

3. Jelaskan mengapa uji milarobiologis air sangat diperlukan untuk menganalisis supplai air

bersih yang disediakan di komunitas industri ?

4. Apakah perlu dilakukan tes lengkap terhadap semua sampel air berdasarkan analisis?

Jelaskan !

5. Sebutkan ciri-ciri yang dapat digunakan untuk mengenali kelompok koliform

6. Sebutkan persyaratan kualitas air minum yang didasarkan pada keberadaan kelompok

koliform dan koli tinja

7. Mengapa harga MPN dihitung dari jumlah tabung yang positif mengahsilkan gas

8. Hitung harga MPN dari sampel yang saudara uji.

Daftar Pustaka :

Cappuccino, J.G.,N. Sherman. 2005.Microbiology : A Laboratory Manual Seventh Edition,

AddisonWesley Publishing Company.

Catatan :

- Tabel MPN index langsung menunjukkan harga MPN per 100 ml, bila kelompok

sampel yang digunakan adalah 5 tabung sampel tanpa pengenceran, 5 tabung

pengenceran 1/10, dan 5 tabung pengenceran 1/100

- Bila sampel air bukan air dsitribusi dan diperkirakan terkontaminasi ( misal : air

baku yang belum diolah, air sumur, air limbah ), perlu dilakukan pengenceran

sampel sebelum dilakukan pengujian. Pengenceran dapat dilakukan menggunakan

larutan buffer fosfat ( pH = 7,2) atau larutan Nacl fisiologis.

- Bila dilakukan pengenceran sampel sebelum dilakukan pengujian , harga MPN

dikoreksi dengan faktor pengenceran yang dilakukan

- Pada pengujian sampel air bukan air distribusi, pengujian dilanjutkan dengan

pengujian lengkap.

(Sumber: Cappucino,2005)

Gambar 11.1. Prosedur Pemeriksaan Kualitas Air secara Mikrobiologis dengan Metode Tabung

Ganda

(Sumber: Cappucino,2005)

Gambar 11.2. Langkah-langkah uji kualitas air dengan metode membran filter

bakteri Acetobacter xylinum