Bioindustri Minggu 6

Oleh : Sri Kumalaningsih, dkk

Penyiapan KulturStarter

Pendahuluan Beberapa faktor yang mempengaruhi

keberhasilan produksi barang dan jasa denganmenggunakan mikroorganisme diantaranyaadalah kultur starter, kondisi lingkungandan media yg digunakan.

Salah satu penentu keberhasilan kultur adalahpenyiapan kultur starter yang baik

Untuk itu perlu dipelajari tentang penyiapankultur dan mikroorganismenya.

Kultur starter (Holzapfel, 2002; Tarmine 1990)

Bahan yang mengandung sejumlahbesar mikroorganisme untukmempercepat proses fermentasi

Medium segar berupa nutrien dgjumlah ttt yang telah diinokulasikandg mikroorganisme pd jumlah tttpula

Mikroorganisme yang dimaksudadalah bakteri, kapang, khamir ataukombinasi diantara ketiga jenismikroorganisme tersebut.

SUMBER MIKROBIA INDUSTRIa. Sumber Alami : dari tanah, air sungai, laut,

tanaman, hewan, limbah, dan kotoran denganmenggunakan metode isolasi

b. Koleksi kultur : dari lembaga tempat menyimpandan memelihara mikro-organisme.

Seleksi Mikroba Industri Tahap pertama adalah isolasi mikroba, sehingga diperoleh

kultur murni (sifat morfologi & fisiologi seragam).

Tahap kedua adalah seleksi sehingga diperoleh galurdengan kinerja terbaik.

Tahap ketiga dilakukan identifikasi dengan menggunakankunci-kunci yang sesuai, sehingga diketahui nama(klasifikasi) mikroba tersebut

Tahap keempat adalah menyimpan mikroba yg telahdiperoleh dgn teknik penyimpanan yg baik, sehinggakemurniannya terpelihara dalam jangka waktu yg panjang.

Kriteria Mikroba IndustriMerupakan galur murni

Sifat genetiknya stabil

Dpt m’hasilkan sel vegetatif, spora atau unit-unit reproduktif lain

Mampu tumbuh dengan cepat setelah diinokulasi

Mampu menghasilkan produk yg diinginkan dalam waktu yg pendek & tdk menghasilkan produk sampingan yg toksik

Mampu melindungi diri dari kontaminasi (pH, suhu, inhibitor)

Dapat disimpan dalam jangka waktu yang panjang

Galur dpt dikembangkan kualitasnya (mutasi), shg produksinyameningkat

Hal yg perlu diperhatikan

saat melakukan seleksi

Sensitivitas

Tidak mahal

Dpt digunakan utk memprediksi hasilnya nanti

Sederhana

Dpt ditingkatkan ke cara lebih modern (otomatisasi)

Fungsi seleksiHarus dihasilkan produk baru yang kompetitif,bermutu tinggi, harga bersaing, tanpa meninggalkankonsep lingkungan

Meningkatkan Konsumsi produk menggunakanmikroorganisme dan enzim untuk pangan dan obat-obatan

Menjawab tantangan peningkatan kapasitas produk

Memenuhi kebutuhan penelitian dasar danpengembangannya

Rekayasa pengolahan harus dilakukan

PENYIAPAN KULTUR

Isolasi kultur : kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari campuran biakan mikroba di alam sel individu terpisah

Sebelum mengisolasi, harus diketahui mikroba apa yang akan diisolasi dan habitatnya menentukan sampel apa yang akan diambil dari alam dan media apa yang akan digunakan

Sampel biasanya segera dipakai atau disimpan pada suhu dingin (kulkas)

Teknik Isolasi Kultur Murni

Penggoresan (Streak-plate) &

Penyebaran (Spread-plate)

Penuangan (Pour-plate)

Kultur yangDiperkaya

PengenceranBerseri (Serial-

dilution)

Isolasi SelTunggal

TEKNIK ISOLASIa. Teknik Penggoresan (Streak-plate) dan

Penyebaran (Spread-plate)

Menggunakan agar cawan

Untuk bakteri paling sesuai

Teknik ini merupakan prosedur rutin untuk isolasi bakteri & menggunakan peralatan yang sederhana.

Kelemahan : hanya sejumlah kecil contoh yang dapat digunakan/disebarkan pada media

Dua sel dapat bergabung manjadi membentuk satu koloni, contoh : bakteri yang menghasilkan lendir & yang tidak pencegahan dengan menambahkan deterjen

Penggoresan dilakukan berulang, sehingga

Diperoleh kultur murni

1 sel 1 koloni

Pengenceran berseri dg larutan garam

fisiologis (0,85 %)

Penggoresan (jarum Ose) atau penyebaran (batang

gelas) pada media agar , sehingga koloni tumbuh

menyebar

Sampel

Teknik Penggoresan (Streak-plate) dan Penyebaran

(Spread-plate)

Goresan T

Goresan

Kuadran

Teknik Penggoresan (Streak-plate) dan Penyebaran

(Spread-plate)

b. Teknik Penuangan (Pour-plate)

Metode Penuangan Pengamatan dapat dilakukan secara kualitatif (morfologi) & kuantitatif (jumlah sel mikroba)

Teknik penggoresan/penyebaran dan penuangan ini lebih efektif dengan menggunakan media selektif/ diferensial atau dengan perlakuan khusus sebelum penanaman pada agar cawan

Contoh : Isolasi bakteri pembentuk spora contoh dipanaskan terlebih dulu s.d 850C 5 menit

Lanjutan...

Media Selektif :

a. Media dg NaCl 7,5 % unt mengisolasiStaphylococcus dari faeces

b. Media BGLBB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) : Salmonellae

Media Diferensial :

Media agar EMB (eosin-methylene blue agar) terbentuk koloni berbeda & mudah dikenali

Misal : E. coli : hijau kehitaman/hijau metalik

Aerobacter aerogenes : tengah ungu tua/coklat, tepi ungu muda

Teknik Penuangan (Pour-plate)

Sampel +/- 1 g)

A

B

C

Suspensi

Bakteri

1 loop

Agar cair

PengenceranPenuangan

Dibiarkan mengeras

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. .

. .

. .

Diperiksa

Koloni terisolasi

Media agar miring

Tahap I Tahap II Tahap III

A

B

C

Inkubasi

c. Teknik Kultur yang Diperkaya

Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat fisiologis yang khusus (jumlah kecil & tumbuh lambat)

Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi inkubasi tertentu, sehingga yang tumbuh hanya bakteri tertentu

Cara:1 2 3 4

(+) (-)

Media cair dgn substrat khusus

Contoh : bakteri tanah : α-conidendrin

Verifikasi

d. Teknik Pengenceran Berseri (Serial dilution)

Digunakan jika mikroba dlm kultur campuran terdapat dalam jumlah lebih besar dari pada mikroba lain.

Contoh : S. lactis dalam susu asam

Dengan tingkat pengenceran tinggi, sampel hanya mengandung 1 galur mikroba

Perlu dicek kemurnian kultur

e. Tenik Isolasi Sel Tunggal

Menggunakan alat Mikromanipulator yangdigabung dengan mikroskop untuk mengambilsuatu sel mikroba tunggal dari preparat tetes

Dengan Mikromanipulator, operator dapatmengontrol gerakan mikropipet di bawah lensaobyek, sehingga dapat diambil sel tunggal kedalam tabung dan selanjutnya dipindahkan kemedia yang sesuai

Lebih cepat, namun kelemahannya : alat mahal &operator harus trampil

TEKNIK IDENTIFIKASI

1. Morfologis

• Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela, kapsulatau spora dengan bantuan mikroskop, baik dengan pewarnaanmaupun tidak.

2. Nutrisional

• Penentuan senyawa kimia dan kondisi fisik khusus (suhu, cahaya, gas) yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba

3. Kultural

• Penentuan tampilan pertumbuhan pada berbagai macam media,baikcair maupun padat (bentuk koloni, permukaan koloni, tepi koloni, warna dll

4. Susunan Kimiawi

• Penentuan susunan kimiawi berbagai komponen sel (dinding sel, nukleus, membran dll)

Contoh 1. Karakteristik Morfologis

Aspergillus E. coli

Streptomyces Penicillium

Contoh 2. Karakteristik Kultural

Lanjutan...

5. Metabolik

• Identifikasi & pengukuran perubahan kimiawi yang dilakukan mikroba (kemampuan mikroba untuk mengubah karbohidrat menjadi asam organik; gula menjadi asam dan gas dll)

• Contoh : E. coli dapat memfermentasi laktosa, sedangkan Salmonella typhitidak dapat

6. Susunan antigen

• Penelaahan sifat antigen – antibodi yang khas

• Antigen : substansi (sel mikroba) yang menstimulasi produksi antibodi saatdiinjeksikan ke hewan

7. Patogenik

• Penentuan potensi suatu mikroba untuk menimbulkan penyakit

8. Genetik

• Kajian berdasarkan untaian DNA mikroba menggunakan DNA Probe

PEMELIHARAAN DAN PENGAWETAN

Tujuan : menjaga sampai periode tertentu mikroba tetap

dalam kondisi hidup (viable), mencegah terjadinyaperubahan genetik & tidak terkontaminasi harusmampu melestarikan karakteristik spesies mikrobaselama diawetkan

Cara :1. Pemindahan Secara Periodik2. Pelapisan kultur dengan minyak mineral3. Liofilisasi4. Penyimpanan pada suhu sangat rendah5. Penyimpanan pada tanah steril

PEMELIHARAAN DAN PENGAWETAN

a. Pemindahan Secara Periodik

• Kultur mikroba secara periodik dipindahkan ke media baru/segar

• Komposisi media & suhu serta interval waktu pemindahan harustepat tetap mempertahankan kultur awal

b. Pelapisan Kultur dgn Minyak Mineral

• Permukaan agar miring dilapisi dengan minyak mineral steril (+/-0,5 inci)

• Keuntungan : dapat memindahkan sebagian mikroba di bawahminyak mineral dg jarum Ose, lalu diinokulasi ke media segardengan tetap mempertahankan kultur awal

c. Penyimpanan pada Tanah Steril

• Diterapkan untuk penyimpanan spora

d. Liofilisasi

• Pengeringan beku (freeze-drying)

• Merupakan cara paling efektif untuk mengawetkan kulturbakteri (dapat tetap hidup & tidak berubah lebih dari 20 th)

• Keuntungan : Tahan lama, Kemungkinan perubahan kecil , Wadah penyimpanan kecil

e. Penyimpanan pada Suhu Sangat Rendah

• Menggunakan nitrogen cair (sekitar -1760C)

• Sel dibekukan dengan diberi pelindung (gliserol ataudimetil sulfoksida)

• Contoh beku disimpan dalam lemari pendingin nitrogen cair

• Cocok untuk kapang

• Kelebihan : hampir sama dgn liofilisasi & kultur yg tidakdapat diawetkan dengan liofilisasi, dapat dengan cara ini