PENGARUH LOGAM BERAT PB TERHADAP PROFIL PENGARUH LOGAM BERAT PB TERHADAP PROFIL

PROTEIN ALGA MERAH (PROTEIN ALGA MERAH (GracillariaGracillaria sp.)sp.)

DOSEN PEMBIMBING:DOSEN PEMBIMBING:

1.1. KRISTANTI KRISTANTI INDAH.P.,S.si.,M.siINDAH.P.,S.si.,M.si

2.2. TUTIK TUTIK NURHIDAYATI.,S.si.,M.siNURHIDAYATI.,S.si.,M.si

OLEH:OLEH:

HENNY ANDHINI OKTAVIA (1504 100 022)HENNY ANDHINI OKTAVIA (1504 100 022)

TUGAS AKHIR SB 1358

PENDAHULUAN

� Gracilaria sp. termasuk kelompok alga merah yang merupakan organisme autotrof yang belum mempunyai akar, batang dan daun yang sebenarnya

� Secara alami Gracilaria sp. hidup dengan melekatkan thallusnya pada substrat

� Gracilaria sp. dapat dimanfaatkan sebagai sumber makanan, industri gel, adsorben logam berat, pembuatan bir, sumber

potensial senyawa bioaktif

Timbal (Pb) adalah unsur kimia termasuk logam berat yang Timbal (Pb) adalah unsur kimia termasuk logam berat yang

digunakan sebagai bahan additive bensin dan dapat bersifat racundigunakan sebagai bahan additive bensin dan dapat bersifat racun

LogamLogam PbPb thallusthallus GracilariaGracilaria sp.sp.

diikatdiikat oleholeh metalotioninmetalotionin padapada thallusthallus

Logam Pb dapat menyebabkan pigmen thallus menjadi semakin sedikit, pemberian Pb sebesar 0,1 ppm dengan lama pemaparan 7 hari menyebabkan kadar klorofil dan fikoeritrin menurun. Untuk klorofil dari 128,70 mg/kg menjadi 95,30 mg/kg sedangkan fikoeritrin dari 66,10 mg/kg menjadi 53,45 mg/kg (Muslihatin, 2006). Jadi, semakin menurun kadar klorofil alga maka protein yang terdapat dalam tubuh alga juga akan semakin menurun.

�� PERUMUSAN MASALAHPERUMUSAN MASALAH

Apakah akan terjadi perubahan profil protein pada Apakah akan terjadi perubahan profil protein pada Gracilaria Gracilaria sp. yang sp. yang

tercemar logam berat Pb dibanding pada kondisi normaltercemar logam berat Pb dibanding pada kondisi normal

�� BATASAN MASALAHBATASAN MASALAH

Batasan masalah pada penelitian adalah profil protein pada Batasan masalah pada penelitian adalah profil protein pada

Gracilaria Gracilaria sp. dengan SDSsp. dengan SDS--PAGE elektroforesisPAGE elektroforesis

�� TUJUANTUJUAN

Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui profil protein Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui profil protein Gracilaria Gracilaria sp. yang sp. yang

tercemar logam berat Pbtercemar logam berat Pb

�� MANFAATMANFAAT

Hasil penelitian diharapkan dapat menjadi bahan informasi awal tHasil penelitian diharapkan dapat menjadi bahan informasi awal tentang entang

daya absorpsi daya absorpsi Gracilaria Gracilaria sp. terhadap logam berat Pb berdasar pada profil sp. terhadap logam berat Pb berdasar pada profil

proteinprotein

TIJAUAN PUSTAKA

Klasifikasi Gracillaria sp.Divisio : Rhodophyta Classis : FlorideophyceaeOrdo : Gracillariales Familia : GracillariaceaeGenus : GracillariaSpecies : Gracilaria sp.(Cavalier-Smith,1998)

BudidayaBudidaya GracilariaGracilaria sp.sp.

�� Metode dasar (Metode dasar (bottom methodbottom method))

Di dalam tambak dengan menebarkan bibit pada dasar tambak.Di dalam tambak dengan menebarkan bibit pada dasar tambak.

�� Metode lepas dasar (Metode lepas dasar (off bottom methodoff bottom method))

Yaitu dengan mengikatkan bibit rumput laut pada taliYaitu dengan mengikatkan bibit rumput laut pada tali--tali yang dipatok secara tali yang dipatok secara berjajarberjajar--jajar di daerah perairan laut dengan kedalaman antara 30jajar di daerah perairan laut dengan kedalaman antara 30--60 cm. 60 cm. Rumput laut ditanam di dasar perairan.Rumput laut ditanam di dasar perairan.

�� MetodeMetode rakitrakit apungapung ((floating rack methodfloating rack method))

Dikerjakan dengan mengikat bibit rumput di taliDikerjakan dengan mengikat bibit rumput di tali--tali yang diikatkan di patoktali yang diikatkan di patok--patok dalam posisi seperti melayang di tengahpatok dalam posisi seperti melayang di tengah--tengah kedalaman perairan.tengah kedalaman perairan.

�� Metode rawai (Metode rawai (longline methodlongline method))

Dikerjakan dengan cara mengikatkan bibitDikerjakan dengan cara mengikatkan bibit--bibit rumput laut dalam posisi bibit rumput laut dalam posisi vertikal (tegak lurus) pada talivertikal (tegak lurus) pada tali--tali yang disusun berjajar.tali yang disusun berjajar.

LogamLogam BeratBerat

Logam adalah unsur alam yang dapat diperoleh dari laut, erosi baLogam adalah unsur alam yang dapat diperoleh dari laut, erosi batuan tuan

tambang, vulkanismetambang, vulkanisme

Pencemaran logam berat ini menimbulkan berbagai permasalahan Pencemaran logam berat ini menimbulkan berbagai permasalahan

diantaranya: diantaranya:

�� Berhubungan dengan estetika (perubahan bau, warna dan rasa Berhubungan dengan estetika (perubahan bau, warna dan rasa

air)air)

�� Berbahaya bagi kehidupan tanaman dan binatangBerbahaya bagi kehidupan tanaman dan binatang

�� Berbahaya bagi kesehatan manusiaBerbahaya bagi kesehatan manusia

�� Menyebabkan kerusakan pada ekosistem.Menyebabkan kerusakan pada ekosistem.

Absorbsi Timbal (Pb) Pada Organisme LautAbsorbsi Timbal (Pb) Pada Organisme Laut

Lapisan membran pada alga terdiri dari lipid Lapisan membran pada alga terdiri dari lipid bilayerbilayer

dimana permukaannya mengandung lapisan yang dapat dimana permukaannya mengandung lapisan yang dapat

mengikat ionmengikat ion--ion yang akan diserap. Ion logam akan masuk ion yang akan diserap. Ion logam akan masuk

kedalam sel dengan cara penetrasi kedalam lapisan lipid. kedalam sel dengan cara penetrasi kedalam lapisan lipid.

Semakin banyak Pb yang terikat pada dinding sel maka akan Semakin banyak Pb yang terikat pada dinding sel maka akan

semakin banyak pula Pb yang dapat masuk ke dalam sel. semakin banyak pula Pb yang dapat masuk ke dalam sel.

Interaksi antara logam dengan permukaan thallus yang Interaksi antara logam dengan permukaan thallus yang

melibatkan ikatan elektrostatik dapat meningkatkan absorbsi melibatkan ikatan elektrostatik dapat meningkatkan absorbsi

logam pada permukaan sel.logam pada permukaan sel.

METODOLOGI

Waktu dan Tempat PenelitianPenelitian ini dilakukan pada bulan Januari-Juni 2009.

Gracillaria sp. dibudidayakan dalam skala laboratorium di Laboratorium Zoologi Program Studi Biologi Fakultas MIPA ITS. Analisis kandungan Pb dilakukan di Balai Penelitian dan

Konsultasi Industri (BPKI) Surabaya. Analisis profil protein Gracillaria sp. dilakukan di Laboratorium Sentral Ilmu Hayati (LSIH) Universitas Brawijaya.

SKEMA KERJAPersiapan Media Budidaya

Gracilaria sp. diambil dengan cara memotong bagian vegetatif

Ditanam dalam akuarium berukuran 40x30x30 cm dan berisi air tambak (air tambak disaring terlebih dahulu) kemudian diperlakukan dengan menggunakan PbCl2

Bibit dikultivasi di dalam akuarium dengan volume air tambak sebanyak 30 liter. Metode kultivasi bibit menggunakan metode gantung yang telah dimodifikasi sesuai keadaan akuarium

PbCl2 dilarutkan dalm media kultivasi dengan konsentrasi (x + 0) ppm; (x + 0,03) ppm; (x + 0,06) ppm dan (x + 0,09) ppm

Dilakukan pemupukan dengan campuran pupuk urea, TSP dan ZA dengan perbandingan 1:1:1

Dianalisis kandungan Pb dalam thallus Gracillaria sp. menggunakan Atomic Absorbtion Spectrofotometry (AAS)

Analisis kandungan protein dengan metode ElektroforesisHasil

Analisis Kandungan Pb

Dilarutkan dalam 25 ml HCL encer 10% dan 10 ml HNO3 pekat 65%

Dipanaskan dan diaduk sampai abu terlarut sempurna

Dimasukkan dalam labu ukur 50 ml dan ditambahkan aquades sampai tanda batas

Disaring menggunakan kertas saring dan dimasukkan ke dalam AAS dengan pipa kapiler

Konsentrasi Pb diukur dengan panjang gelombang 217 nm

Hasil

Sampel Gracillaria sp. dikeringkan pada suhu 1200C dan diabukan dalam furnase dengan suhu 4000C – 6000C sampai menjadi abu

Persiapan Alat Elektroforesis

Perangkat Elektroforesis (Biorad ®) dirangkai

Diambil sisir setelah padat dan siap digunakan

Dimasukkan sisir pembentuk sumuran diantara plat, didiamkan 10 menit

Dibuang lapisan akuades dan diganti dengan gel penumpuk

Diisikan 6 ml larutan gel pemisah pada plat, dilapisi 1 ml akuades dan didiamkan 15 menit

Pengamatan Profil ProteinIsolasi protein Gracilaria sp.

Gracilaria sp. dicuci dengan aquades steril, ditimbang ± 0.1 gram

Dipotong-potong, digerus dan ditambahkan buffer ekstrak 500 µl

Homogenat yang dihasilkan, dipindah dalam eppendorf yang telah diisi 250 µl buffer ekstrak

Ditambahkan 26 µl PMSF 40 mM Di vortex

Di inkubasi selama 1 jam dalam refrigerator sambil sesekali di vortex

Disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 40C selama 5 menit

Supernatan dipindah ke tabung baru,pelet disuspensikan dengan 500 µl buffer ekstrak dan 26 µl PMSF 40 mM

Di vortexDi inkubasi selama 1 jam dalam refrigerator sambil sesekali di vortex

Disentriguse dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 40C selama 5 menit

Supernatan yang didapat dicampur dengan supernatan pertama Supernatan dipresipitasi dg TCA 20%

Supernatan

Elektroforesis SDS-PAGE

Dilakukan pencucian dengan larutan pencuci

Supernatan dicampur dengan buffer sampel sebanyak 6 µl dipanaskan dalam air mendidih 2 menit

Supernatan dimasukkan pada sumuran gel 25 µl/sumuran

Gel dilepas dan diwarnai dengan kromasi blue

Dilakukan running sampai warna biru menyentuh dasar gel, dihentikan

Bak bufer atas dan bawah diisi buffer elektroda

Diidentifikasi berat molekul protein

HASIL DAN PEMBAHASAN

Perlakuan

Konsentrasi Pb pada Gracillaria sp.

Hari ke 0 Hari ke 5 Serapan Pb

A 0.06 0.074 0.014

B 0.06 0.081 0.021

C 0.06 0.086 0.026

D 0.06 0.098 0.038

Ket : A adalah air tambak + 0 ppm PbB adalah air tambak + 0.03 ppm PbC adalah air tambak + 0.06 ppm PbD adalah air tambak + 0.09 ppm Pb

Akumulasi Timbal (Pb) pada Thallus Gracillaria sp.

Tabel 4.1

PerlakuanKonsentrasi Pb hari ke-0

( ppm )Konsentrasi Pb hari ke-5

( ppm )

Selisih KonsentrasiPb

( ppm)

A 0.010 0.011 -0.001

B 0.040 0.032 0.008

C 0.070 0.064 0.006

D 0.100 0.088 0.012

Konsentrasi Pb pada media

Tabel 4.2

Ket : A adalah air tambak + 0 ppm PbB adalah air tambak + 0.03 ppm PbC adalah air tambak + 0.06 ppm PbD adalah air tambak + 0.09 ppm Pb

� Berdasarkan Tabel 4.1 dan Tabel 4.2 bahwa semakin tinggikonsentrasi Pb yang diberikan maka semakin tinggi pula penyerapan yang dilakukan oleh thallus. Pada perlakuan B denganpenambahan Pb sebesar 0.03 ppm, Gracillaria sp. dapat menyerapPb sebanyak 0.021 ppm, sedangkan pada perlakuan C denganpenambahan Pb sebesar 0.06 ppm Gracillaria sp. dapat menyerapPb sebanyak 0.027 ppm dan pada perlakuan D denganpenambahan Pb sebesar 0.09 ppm Gracillaria sp. dapat menyerapPb sebanyak 0.038 ppm.

� Selisih konsentrasi Pb pada media tidak terlalu banyak, hal tersebutterjadi di karenakan Pb mengendap atau terlarut dalam media.

PROFIL PROTEIN

MARKER A B C D

221150

100

75

50

35

25

15

10

167

67

38

6

164

67

38

6

167

59

38

32

6

164

67

38

32

6

Ket : A adalah air tambak + 0 ppm PbB adalah air tambak + 0.03 ppm PbC adalah air tambak + 0.06 ppm PbD adalah air tambak + 0.09 ppm Pb

� Berdasarkan Tabel tersebut dapat diketahui bahwa pada perlakuan B, C dan D apabila dibandingkan dengan kontrol (A) terdapat perbedaan pita protein.

� Perbedaan pita protein tersebut di asumsikan sebagai protein baru yang terbentuk.

� Protein baru tersebut adalah protein dengan berat molekul 164 kDa yang ditemukan pada perlakuan B dan D, berat molekul 59 kDa ditemukan hanyapada perlakuan C dan berat molekul 32 kDa yang ditemukan padaperlakuan C dan D.

� Pola pita protein pada perlakuan B, C dan D apabila dibandingkan dengan A (kontrol) terdapat perbedaan, ada pita protein yang tebal dan ada pita protein yang tipis.

� Adanya perbedaan tebal tipisnya pola pita protein menunjukkan bahwaadanya perbedaan dalam kandungan proteinnya.

� Pada perlakuan B, C dan D apabila dibandingkan dengan kontrol (A) terdapat perbedaan pita protein.

� Pada perlakuan B jika di bandingkan dengan kontrol (A) perbedaan pita proteinnya yaitu dengan berat molekul 164 kDa, pada perlakuan C pita protein dengan berat molekul 59 kDa dan 32 kDa, dan pada perlakuan D yaitu 164 kDa dan 32 kDa.

� Tidak ditemukannya protein-protein pada tiap perlakuan (B, C, dan D) tersebut diduga mengalami degradasi protein. Degradasi protein dimungkinkan terjadinya denaturasi protein, hal tersebut terjadi disebabkankarena peningkatan konsentrasi logam Pb.

KESIMPULAN

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan profil protein pada Gracillaria sp. yang terpapar logam berat Pb. Gracillaria sp. yang terpapar logam Pb pada perlakuan B membentuk 4 pita protein dengan berat molekul 6 kDa, 38 kDa, 67 kDa dan 164 kDa. Pada perlakuan C membentuk 5 pita protein dengan berat molekul 6kDa, 32 kDa, 38 kDa, 59 kDa dan 167 kDa. Pada perlakuan D juga membentuk 5 pita protein dengan berat molekul 6 kDa, 32 kDa, 38 kDa, 67 kDa dan 164 kDa.

SaranDiperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui jenis

protein pertahanan yang di bentuk oleh Gracillaria sp.