PENGARUH KONSENTRASI ISOPROPHYIL THIO D-GALACTOSIDE

(IPTG) TERHADAP EKSPRESI PROTEIN REKOMBINAN GST-VP28

PADA ESCHERICIA COLI BL21

PUBLIKASI ILMIAH

Diserahkan Guna Memenuhi Sebagian Syarat yang Diperlukan

Untuk Mendapatkan Derajat Sarjana Peternakan

pada Program Studi Peternakan

Oleh

MUH. HERU RESPADI

B1D 011 176

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS MATARAM

MATARAM

2015

PENGARUH KONSENTRASI ISOPROPHYIL THIO D-GALACTOSIDE

(IPTG) TERHADAP EKSPRESI PROTEIN REKOMBINAN GST-VP28

PADA ESCHERICIA COLI BL21

PUBLIKASI ILMIAH

Oleh

MUH. HERU RESPADI

B1D 011 176

Diserahkan Guna Memenuhi Sebagian Syarat yang Diperlukan

Untuk Mendapatkan Derajat Sarjana Peternakan

pada Program Studi Peternakan

PROGRAM STUDI PETERNAKAN

Menyetujui,

Pada Tanggal : _______________

Pembimbing Utama,

Muhammad Ali, S.Pt, M.Si, Ph.D

NIP. 19720727 199903 1 002

PENGARUH KONSENTRASI ISOPROPHYIL THIO D-GALACTOSIDE

(IPTG) TERHADAP EKSPRESI PROTEIN REKOMBINAN GST-VP28

PADA ESCHERICIA COLI BL21

ABSTRAK

Muh. Heru Respadi / B1D 011 176 Fakultas Peternakan Universitas Mataram

VP28 merupakan salah satu protein pembungkus virus White Spot

Syndrome (WSS) yang terlibat dalam infeksi sistemik udang dan banyak dipelajari

penggunaannya sebagai vaksin. Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui

pengaruh tingkat IPTG terhadap ekspresi protein rekombinan GST-VP28 pada

bakteri E. coli BL21. Pada penelitian ini dihasilkan protein VP28 yang difusi

dengan GST menggunakan inang E. coli BL21 (DE3). Pada beberapa tingkat

konsentrasi induser (IPTG), hasil SDS-PAGE menunjukan bahwa protein target

yang berukuran sekitar 44.6 kDa dapat diekspresikan dengan menggunakan 0.25

mM IPTG. Uji solubilitas protein tersebut menunjukan bahwa protein GST-VP28

yang dihasilkan dengan konsentrasi IPTG sebagian besar diekspresikan dalam

keadaan larut.

Kata kunci : Protein Rekombinan GST-VP28, IPTG, SDS-PAGE, E. coli BL21.

EFFECT OF CONCENTRATION ISOPROPYL THIO D-GALACTOSIDE

(IPTG) ON PROTEIN EXPRESSION OF RECOMBINANT GST-VP28

ESCHERICHIA COLI

ABSTRACT

Muh. Heru Respadi / B1D 011 176 / Fakultas Peternakan Universitas Mataram

VP28 is a viral envelope proteins of White Spot Syndrome (WSS) which involved

in the systemic infection of shrimp and much studied as a vaccine. The aim of this

study is to determine the effect of IPTG level on the expression of recombinant

GST-VP28 proteins in bacteria E. coli BL21. In this study, VP28 protein fused to

using GST in host E. coli BL21 (DE3) at some level of concentration of inducer

(IPTG). SDS-PAGE results showed that the protein target (about 44.6 kDa) can be

expressed by using a 0,25 mM IPTG. The protein solubility test showed that the

GST-VP28 protein produced by the concentration of IPTG mostly expressed in

soluble form.

Keywords: Recombinant of GST-VP28 protein, IPTG, SDS-PAGE, E. coli BL21.

PENDAHULUAN

Teknologi molekular merupakan disiplin ilmu yang berkembang sangat

pesat dan sangat banyak dipergunakan dalam berbagai kehidupan manusia saat ini.

Disiplin ilmu tersebut menggunakan jasa teknologi DNA rekombinan untuk

menghasilkan aneka produk yang dibutuhkan oleh manusia (Glick, 2003).

Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu metode untuk menyatukan DNA

dari satu sumber atau lebih yang tergabung dalam satu molekul rekombinan

(Barnum, 2005). Dengan teknologi ini aneka produk telah dihasilkan, diantaranya

seperti vaksin, antibodi, hormon, enzim, dan aneka obat. Antibodi monoklonal,

misalnya, dipergunakan sangat luas seperti untuk terapi medis, pembuatan kit

maupun alat deteksi cepat untuk penyakit. Produk tersebut sangat diperlukan

sehingga berbagai keperluan dapat dilakukan dengan lebih mudah dan lebih

spesifik sesuai keinginan manusia (Muladno, 2002).

Salah satu produk dari teknologi ini yaitu aneka protein rekombinan yang

dipergunakan sebagai vaksin. Viral Protein-28 (VP28) merupakan salah satu

protein struktural dari virus bercak putih (White Spot Syndrome Virus/WSSV)

(Zuidema et al., 2004). VP28 terletak pada pembungkus virion (envelope) (van

Hunten et al., 2001). Penemuan protein rekombinan VP28 sangat bermanfaat untuk

pembuatan vaksin maupun deteksi penyakit infeksi sistemik pada udang yang

disebabkan oleh virus WSS (van Hunten, 2001). Protein ini telah berhasil

diproduksi pada bakteri Escherichia coli maupun mkroba lainnya sepert Bacillus

subtilis melalui proses rekayasa virulen protein yang diperoleh dari DNA virus

White Spot Syndrome (WSS) pada udang.

Dalam proses rekayasanya, protein VP28 ini disisipkan pada vektor pGEX

kemudian ditransformasikan kedalam sel inang. Sel inang yang biasa digunakan

yaitu Escherichia coli (E. coli) (Caipang, 2008). E. coli memiliki kelebihan sebagai

sel inang karena dapat memperbanyak diri dalam waktu yang cepat, singkat dan

stabil, bersifat tidak pathogen, dapat diintroduksi sebagai gen asing pengkode

protein target (Brock et al., 1994). E. coli juga memiliki tingkat ekspresi yang tinggi

dalam sistem ekspresi karena mudah untuk melakukan manipulasi DNA

rekombinan (mirip seperti kloning plasmid) (Sahdev et al., 2008).

Protein VP28 juga diekspresikan dengan bantuan vektor plasmid, yang

diantaranya dapat diinduksi dengan Isoprophyil Thio D-galactoside (IPTG). IPTG

yang melepas represi promotor untuk mengasilkan ekspresi dalam jumlah tinggi

sebelum kemudian dilekatkan. Melekatkan protein tertentu pada molekul lain

misalnya β galaktosidase dapat lebih menstabilkan protein dan akan mudah

terdegradasi dalam E. coli. Hal umum lain yang juga dilakukan adalah dengan

menambahkan perunut (tag) yang diekspresikan untuk memudahkan

menemukan/mengisolasi protein. Perunut yang banyak digunakan adalah Glutation

S-transferase (GST) yang dapat diisolasi menggunakan kolom glutation

(Marceline, 2008).

Pada penelitian sebelumnya, pengklonan gen VP28 penyandi Viral Protein-

28 untuk Produksi Vaksin Rekombinan yang dilakukan oleh Mukhlis (2010)

menggunakan perlakuan tanpa induksi IPTG. Begitu juga yang dilakukan oleh Ali

et al. (2010) pada produksi antigen permukaan virus White Spot Syndrome (WSS)

untuk menghasilkan kandidat vaksin rekombinan udang dan Ashari et al. (2014)

pada pengembangan kandidat vaksin rekombinan VP28 yang hanya menggunakan

perlakuan IPTG dengan konsentrasi 1 mM untuk melihat ekspresi protein

rekombinan VP28-nya.

Berdasarkan uraian di atas, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui

tingkat ekspresi protein target dalam hal ini Viral Protein-28 (VP28). VP28

merupakan salah satu protein amplop White Spot Syndrome Virus (WSSV) yang

terlibat dalam penempelan dan penetrasi virus ke dalam sel udang (penyebab

kematian lobster secara mendadak). Di induksi IPTG dengan konsentrasi yang lebih

rendah (< 1 mM). Akibat penggunaan IPTG ini selain dari harganya yang relatif

mahal, dapat bersifat racun apabila digunakan dalam konsentrasi yang tinggi

(Ashari et al., 2014). Berdasarkan referensi juga belum ada yang meneliti tentang

optimalisasi IPTG (penggunaan IPTG dengan konsentrasi lebih rendah) pada GST-

VP28 yang kemudian diperbanyak dalam inang (E. coli BL21).

TUJUAN DAN KEGUNAAN PENELITIAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh tingkat IPTG terhadap

ekspresi protein rekombinan GST-VP28 pada bakteri E. coli BL21 dan untuk

mengumpulkan data yang diperlukan dalam menghasilkan protein rekombinan

GST-VP28 dalam skala yang lebih besar.

METODOLOGI PENELTIAN

Penelitian ini dilaksanakan dengan metode Kultur Bakteri E. coli

Rekombinan Pembawa Plasmid pGEX-VP28 terlebih dahulu. Kemudian Ekspresi

Plasmid pGEX-VP28 dengan induksi IPTG dengan berbagai konsentrasi (0.10 mM,

0.25 mM, 0.50 mM, 0.75 mM dan 1.00 mM). Uji Kelarutan (Solubility) Protein

Rekombinan GST-VP28 dengan menggunakan sonikator untuk memecah dinding

sel bakteri agar mengetahui larut atau tidaknya protein target (GST-VP28) yang

dihasilkan.

Analisa data

Analisis data dari penelitian ini menggunakan analisa kualitatif melalui

deskriptif visual yang ditunjukan dengan tebal atau tidaknya pita protein pada saat

dilakukan proses SDS-PAGE.

HASIL PENELTIAN

Pada penelitian ini digunakan isolat E.coli BL21 pembawa plasmid

rekombinan pGEX-VP28 yang disimpan sebagai stok gliserol yang telah diketahui

dapat mengekspresikan protein rekombinan ketika dikultur. Isolat tersebut

kemudian digoreskan pada media LB menggunakan metode streak atau

penggoresan menggunakan goresan kuadran untuk kemudian diinkubasi semalam

pada suhu 37oC.

Stok gliserol yang digunakan diperoleh dari penelitian sebelumnya yang

dilakukan oleh Ashari et al. (2014). Peremajaan (re-kultur) tersebut telah berhasil

dilakukan yang dibuktikan dengan tumbuhnya koloni bakteri pada media LB padat

setelah melalui tahapan inkubasi dalam inkubator dengan suhu 37oC selama 24 jam.

Penggunaan antibiotik pada media tumbuh dimaksudkan untuk mencegah

tumbuhnya bakteri lain selain bakteri penghasil protein target (kontaminan).

Kontaminasi tersebut dapat berasal dari lingkungan selama proses pembuatan stok

gliserol. Ampisilin bekerja dengan menghambat dinding sel yaitu dengan

menyerang peptidoglikan (Brander et al., 1991). Penggunaan ampisilin didasarkan

pada jenis plasmid atau vektor yang digunakan dalam penelitian ini yaitu pGEX-

4T.2 yang membawa gen penyandi resistensi terhadap ampisilin. Sehingga pada

saat proses pertumbuhan bakteri, tidak ada jenis bakteri lain yang dapat tumbuh

selain E.coli BL21 VP28 yang disisipkan dengan vektor pGEX (Anonim, 2014).

Kultur Bakteri E. coli Rekombinan Pembawa Plasmid pGEX-VP28

Koloni hasil peremajaan kemudian digunakan sebagai inokulan dalam

pembuatan starter untuk ditumbuhkan pada LB cair yang mengandung antibiotik

ampisilin. Media yang digunakan adalah media LB karena merupakan media

konvensional yang biasa dipergunakan untuk menghasilkan protein rekombinan.

Hasil inokulasi menunjukan perubahan warna media setelah diinkubasi

selama 19 jam (over night) pada mesin shaker dengan suhu 37oC. Tingkat

kekeruhan pada media semakin meningkat yang menunjukan bahwa bakteri E. coli

BL21 pembawa pGEX-VP28 berhasil tumbuh pada media tersebut.

Hal tersebut sesuai dengan pendapat Wibowo (2012) yang menyatakan

bahwa suatu bakteri memerlukan kondisi yang optimum agar dapat tumbuh dengan

baik, antara lain mencakup faktor suhu dan pH, kemudian faktor kelengkapan

nutrisi dari media yang digunakan. Nutrisi yang tersedia haruslah lengkap dan

sesuai dengan kebutuhan bakteri yang dibiakan, sedangkan untuk kondisi suhu dan

pH, bakteri biasanya tumbuh baik pada suhu 37oC dan pH 7.

Ekspresi Plasmid pGEX-VP28

Ekspresi protein rekombinan GST-VP28 telah berhasil dilakukan dengan

menggunakan inang E.coli BL21 (DE3). Berdasarkan hasil ekspresi yang diperoleh

setelah induksi tampak adanya band protein sesuai dengan berat molekul protein

target (GST-VP28) yang berukuran sekitar 44.6 kDa dan dilakukannya SDS-PAGE.

Terlihat berbeda nyata sekali ekspresi antara perlakuan yang diinduksi IPTG

dengan yang tidak. Pada kolom yang diberikan perlakuan tanpa IPTG yaitu pada

kolom 3 (uninduced), kolom 5 (uninduced), kolom 7 (uninduced), dan kolom 9

(uninduced) tidak ada ekspresi (pita protein), sedangkan pada perlakuan dengan

penambahan (induksi) IPTG terdapat perbedaan tebal pita protein (band)

konsentrasi 0.25 mM dan 0.50 mM (band paling tebal) dengan 0.10 mM, 0.75 mM

dan 1 mM, berat molekul 44.6 kDa.

Gambar 1. Hasil ekspresi plasmid pGEX-VP28 setelah induksi IPTG, penambahan

(induced) 0.1 mM (1) & tanpa penambahan (uninduce) 0.1 mM (2),

penambahan (induced) 0.25 mM (3) & tanpa penambahan (uninduce) 0.25

mM (4), penambahan (induced) 0.50 mM (5) & tanpa penambahan

(uninduce) 0.50 mM (6), penambahan (induced) 0.75 mM (7) & tanpa

penambahan (uninduce) 0.75 mM (8), penambahan (induced) 1.00 mM (9),

Marker (10).

Hal tersebut terjadi karena terlalu rendah konsentrasi IPTG (0.10 mM) yang

digunakan maka ekspresi pita-pita protein VP28 tidak terlalu bagus. Begitu pula

apabila terlalu tinggi konsentrasi IPTG (1,00 mM) yang digunakan, maka dapat

memberikan efek racun atau tidak akan dapat terekspresikannya protein

rekombinan VP28, sedangkan berat molekulnya diperoleh dari penjumlahan antara

berat molekul protein VP28 (19.9 kDa) dengan GST (24.7 kDa) serta dapat juga

dihitung berdasarkan sumbu grafik.

Snustad dan Simmons (2003) menyatakan bahwa penggunaan IPTG diawali

dengan terikatnya IPTG pada situs pengikat induser pada protein represor.

Penambahan induser (IPTG) represor mengakibatkan perubahan struktur pada situs

pengikat protein represor dengan situs pengikat represor pada operator. Hal tersebut

menimbulkan tidak adanya interaksi yang terjadi antara protein represor dan

operator, sehingga memungkinkan RNA polimerase sel inang yang telah berikatan

dengan promoter lac yang merupakan titik awal proses transkripsi dan translasi gen

menjadi protein rekombinan (VP28). Kemudian dilanjutkan dengan induksi

ekspresi protein yang dilakukan setelah nilai OD600 tercapai satu pada fase log

(Brock et al., 1994).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (kDa)

250

130

100

70

55

35

25

15

10

Uji Kelarutan (Solubility) Protein Rekombinan GST-VP28

E. coli dapat menghasilkan protein rekombinan dalam jumlah yang besar

dengan sangat cepat dan biaya murah. Namun salah satu permasalahan yang

dihadapi dalam produksi protein rekombinan dalam E. coli adalah terbentuknya

inclusion body yakni protein rekombinan beragregat dalam bentuk tidak larut dalam

sitoplasma. Fenomena ini menjadi kendala dalam efisiensi produksi protein

rekombinan (Juniarti, 2012). Menurut Glick dan Pasternak (2003) inclusion body

yang terbentuk dapat disebabkan oleh beberapa hal meliputi ekspresi protein

rekombinan yang berlebihan, tidak terjadinya perlipatan protein yang sesuai

menjadi protein aktif dan ada kemungkinan terjadinya pengurangan ikatan disulfida

dalam lingkungan intraseluler sel E. coli. Adanya proses ekspresi yang berlebihan

dapat membebani dan menghambat sekresi protein rekombinan oleh sel. Hal

tersebut menyebabkan banyak protein tidak dapat disekresikan ke bagian tempat

terjadinya pembentukan ikatan disulfide, pelipatan protein menjadi protein aktif

dan matang (prisplasmik) sehingga akan membentuk kumpulan atau agregat dari

protein yang tidak dapat larut (inclusion body) (Sorenson dan Mortensen, 2004).

Maka dari hal tersebut dilakukanlah uji kelarutan (Solubilisasi) untuk mengubah

protein tidak terlarut (insoluble) atau yang disebut dengan inclusion body menjadi

protein terlarut (soluble) pada sampel yang digunakan (protein rekombinan GST-

VP28).

Sonikasi merupakan metode pemecahan sel yang memanfaatkan getaran

dari gelombang suara (energi ultrasuara) dengan frekuensi tinggi untuk melisiskan

dinding sel bakteri. Sehingga pada saat dinding sel bakteri lisis, protein rekombinan

yang telah diekspresi diasumsikan dapat keluar dari sel inang (Anonim, 2009a).

Sonikasi dilakukan dengan menggunakan alat yang disebut sonikator. Di dalam

sonikator, terdapat vibrating probe yang dapat menghasilkan gelombang suara.

Gelombang suara tersebut dikirimkan melalui vibrating probe yang dicelupkan ke

dalam suspensi sel. Kemudian menginisiasi pembentukan partikel uap air yang

semakin menimbulkan shockwave dan meradiasi sampel sehingga suspensi sel lisis.

Selama dilakukannya sonikasi, suspensi sel diletakkan di dalam es agar panas yang

dihasilkan oleh sonikator tidak menyebabkan protein yang didapatkan tidak

terdegradasi. Sonikasi digunakan untuk sampel dengan volume kurang dari 100 ml

(Anonim, 2009b). Tahapan sonikasi dilakukan terhadap total pellet protein

rekombinan VP28 yang diperoleh dari hasil induksi IPTG (0.25 mM) kemudian

disentrifugasi 8000 rpm pada suhu 4oC selama 15 menit.

Gambar 2. Hasil sonikasi sampel. Marker (1), pellet setelah sonikasi (2), Supernatan

setelah sonikasi (3)

Setelah dilakukannya sonikasi dilanjutkan dengan tahapan karakterisasi

menggunakan metode SDS-PAGE untuk melihat profil protein dari rekombinan

VP28. Pada hasil visualisasi SDS-PAGE sampel dengan perlakuan penambahan

IPTG 0.25 mM yang telah melalui tahapan sonikasi menunjukan bahwa pita protein

(band) paling tebal terdapat pada supernatan. Artinya bahwa protein rekombinan

VP28 tersebut larut dalam air (supernatan). Dimana protein yang larut dalam air

(supernatan) merupakan protein yang tergolong bagus untuk dimanfaatkan sebagai

bahan dalam pembuatan vaksin rekombinan (Tsumoto, 2003).

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

1) Penggunaan IPTG dengan konsentrasi 0.25 mM dapat menginduksi ekspresi

protein rekombinan GST-VP28 dengan kuantitas yang tidak berbeda dengan

penggunaan konsentrasi yang lebih tinggi (0.5 mM, 0.75 mM dan 1.00 mM).

2) Jumlah protein terlarut yang dihasilkan dengan induksi IPTG 0.25 mM lebih

banyak dibandingkan protein tidak larut (inclusion body).

1 2 3 (kDa)

250

130

100

70

55

35

25

15

10

Saran

1) Untuk keperluan lebih lanjut, konsentrasi IPTG yang akan digunakan adalah

0.25 mM.

2) Untuk menghasilkan protein rekombinan GST-VP28 dalam skala yang lebih

besar, diperlukan media yang murah dan tersedia secara kontinyu.

DAFTAR PUSTAKA

Ali, M., Sulaiman ND., Mukhlis A., dan Amin M. 2010. Produksi Antigen

Permukaan Virus White Spot Syndrome untuk Menghasilkan Kandidat

Vaksin Rekombinan Udang. Laporan Penelitian. Pusat Penelitian Agribisnis

Universitas Mataram, Mataram.

Anonim. 2009a. Cell lysis technical handbook: version 2. Thermo Fisher scientific,

inc., United States: 50 hlm.

Anonim. 2009b. Thermo scientific Pierce Cell lysis technical handbook: Featuring

cell lysis reagent and detergent. Thermo Fisher Scientific, Inc., United

States: 50 hlm.

Anonim. 2014. http://www.addgene.org/vector-database/2261/. Diakses tanggal 22

April 2015

Ashari, M, M. Ali, Sulaiman ND. 2014. Pengembangan Kandidat Vaksin

Rekombinan VP28 Strain Indonesia Untuk Udang Terhadap Virus White

Spot Syndrome Dalam Rangka Komesialisasi. Laporan Penelitian. Pusat

Penelitian Unggulan Strategis Nasional, Mataram.

Barnum, SR. 2005. Biotechnology an introduction. International Student Edition.

Ed ke-2. Belmont : Thmpson Brooks/Cole.

Brander, G.C., Pugh, R.J., and Bywater, W.L. 1991. Veterinary Applied

Pharmacology and Therapeutics. 5th ed. Bailliere Tindall ELBS. 436,467-

473.

Brock, T.D., M. T. Madigan, J.M. Martinko & J. Parker. 1994. Biology of

Microorganism. 7th ed. Prentice-Hall, Inc., New Jersey: xvii + 909 hlm.

Caipang, C.M.A., Verjan, N., Ooi, E.L., Kondo, H., Hirono, I., Aoki, T., Kiyono,

H., and Yuki, Y. 2008. Enhanced survival of shrimp, penaeus

(Marsupenaeus) japonicas from white spot syndrome disease after oral

administration of recombinant VP28 expressed in Brevibacillus brevis.

Vol.25. P. 315-320

Glick, B.R. dan J.J. Pasternak. 2003. Molecular biotecnology principles and

application of recombinant DNA. ASM Press, Washington DC: xxiii + 760

hlm.

Juniarti, F., Doddy Irawan, Subintoro, Khayu Wahyunita, Aris Rudiyanto, Chaerul

Malik dan Vanny Narita. 2012. Optimasi Produksi Protein Non Struktural

1 (NS1) Virus Dengue Serotipe 3 (DENV-3). Universitas Al Azhar,

Indonesia

Marceline, Faustine. 2008. Kloning Kerangka Baca Terbuka Gen Pengkode VP28

White Spot Syndrome Virus Pada Escherichia coli DH5a.

http://digilib.itb.ac.id/gdl.php?mod=browse&op=read&id=jbptitbpp-gdl-

faustinema-32605.

Mukhlis, A. 2010. Pengklonan Gen VP28 Penyandi Viral Protein-28 dari Virus

White Spot Syndrome Sebagai Langkah Awal Produksi Vaksin

Rekombinan Udang Penaeid (TESIS). Institut Pertanian Bogor, Bogor

Muladno. 2002. Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor baru: Pustaka Wirausaha

Muda. Bogor.

Sahdev S., Khattar S. K., Saini K. S. (2008). Production of active eukaryotic

proteins through bacterial expression systems: a review of the existing

biotechnology strategies. Mol. Cell. Biochem. 307 249–264

10.1007/s11010­007­9603­6

Snustad, D.P., and M.J., Simmons. 2003. Principles of Genetics. 3rd. en. Jhon

Welly and Sons. Inc., Hoboken: xix+ 840 hlm.

Sorensen, H.P. dan K.K. Mortensen. 2004. Advance genetic strategies for

recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotecnology

115: 113-128.

Tsumoto, K., E. Daijima, I. Kumagai, and T. Arakawa.2003. Practical consideration

in refolding proteins from inclusion bodies. Academic. 28: 1--8

van Hunten MCW, Vlak JM. 2001. Identification and Phylogeny of a protein kinase

gene of white spot syndrome virus. Virus Genes 22:201-207.

Wibowo, M.S. 2012. Pertumbuhan dan kontrol bakteri. Jurnal-Pertumbuhan-

bakteri-c070205.PDF. Diakses 11 November 2014.

Zuidema D, van Hunten MCW, Marks H, Witteveltd J, Vlak JM. 2004. Virus host

interactions of White Spot Syndrome Virus. Di dalam: Leung KY, editor.

Current Trends in the Studi of Bacterial and Viral Fish and Shrimp

Diseases. Molecular Aspects of Fish and Marine Biology; volume ke-3.

Singapore: World Scientific Publishing. Hlm 237-255.