Penerapan PCR-RFLP untuk Indentifikasi Cepat Utama Dermatofit patogen dari Spesimen Klinik * H Mirzahoseini1, E Omidinia1, M Syams-Ghahfarokhi 2 G Sadeghi 2, M RazzaghiAbyaneh 3 1Dept. Bioteknologi, Pasteur Institute of Iran, Teheran, Iran 2Dept. dari ilmu jamur, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Tarbiat Modares, Tehran, Iran 3Dept. dari ilmu jamur, Pasteur Institute of Iran, Teheran, Iran (Diterima 31 Mei 2008; diterima 6 Jan 2009) Abstrak Latar Belakang: Dalam penelitian ini, teknik PCR-RFLP molekul berbasis dirancang untuk identifikasi cepat dermatofit dalam spesimen klinis. Kulit mengorek diperoleh dari kasus manusia diduga dermatofitosis dipelajari dalam memesan untuk mengidentifikasi jamur etiologi terlibat. Metode: Dalam penelitian eksperimental, spesimen (mengorek kulit) pasien yang dirujuk ke Mycology Departemen Pasteur Institut Iran diinokulasi pada cawan Petri berisi agar-agar selektif untuk jamur patogen (SAPF) dan diinkubasi pada 25 C sampai terlihat pertumbuhan koloni jamur. Koloni diperiksa untuk karakteristik morfologi standar setelah terlihat pertumbuhan pada media agar-agar. Sebagian kecil dari setiap koloni jamur selanjutnya dipelajari oleh panjang fragmen restriksi polimorfisme (RFLP) analisis spacer PCR diamplifikasi ditranskripsi internal (ITS) wilayah DNA ribosom (rDNA). PCR dielektroforesis pada amplikon yang 2% gel agarosa setelah mencerna oleh enzim restriksi yang berbeda termasuk MvaI, HinfI dan HaeIII. Hasil: Di antara 160 sampel klinis diperiksa, 6 spesies dermatofit termasuk Trichophyton mentagrophytes, T. rubrum, T. verrucosum, T. tonsurans, Microsporum canis dan Epidermophyton floccosum akhirnya diidentifikasi berdasarkan morfologi koloni dan kriteria mikroskopis. Spesifik PCR produk dan RFLP pola untuk MvaI, HinfI dan enzim HaeIII memungkinkan identifikasi cepat dan diferensiasi dapat diandalkan dermatofit terisolasi di genus atau spesies untuk tingkat 5-10 hari berusia koloni. Kesimpulan: Hasil penelitian menunjukkan bahwa PCR-RFLP analisis daerah ITS rDNA dari adalah alat yang cepat dan handal yang memungkinkan identifikasi dermatofit patogen utama terisolasi dalam studi di tingkat spesies dalam 5-10 hari muda berusia koloni. Kata kunci: Dermatofitosis, PCR-RFLP, daerah ITS, Identifikasi, spesies dermatofit Pengenalan Dermatofit adalah kelompok jamur khusus yang mempengaruhi jaringan keratin kulit, kuku dan rambut pada manusia dan berbagai liar dan hewan peliharaan di seluruh dunia (1, 2).

Jamur ini terutama diklasifikasikan dalam tiga besar termasuk genera Microsporum, Trichophyton dan Epidermophyton berdasarkan morfologi struktur reproduksi khusus bernama macroconidia (1). Dermatofitosis (cacing cincin; tinea) disebut semua gangguan kulit yang disebabkan oleh dermatophytic jamur. Ini adalah zoonosis penting gangguan dengan distribusi di seluruh dunia yang menerima pertimbangan utama berkaitan dengan ekonomi, dan kesehatan masyarakat masalah (2). Penyakit ini dilaporkan melibatkan manusia dan hewan di berbagai belahan Iran (3-6) dengan prevalensi lebih tinggi di daerah yang hangat dan lembab. Meskipun frekuensi tinggi dari penyakit yang disebabkan oleh berbeda dermatofit spesies di Iran, diagnosis rutin berdasarkan metode konvensional adalah memakan waktu prosedur diperlukan untuk bahkan 30 d untuk isolasi akhir dan identifikasi etiologi agen di tingkat genus atau spesies. Demikian juga, dalam beberapa kasus, dermatofit penyebab gagal menghasilkan setiap struktur reproduksi jelas dalam budaya (Disebut steril miselia) yang tidak memungkinkan untuk diagnosis definitif akhir. Di sisi lain, obat antijamur yang mahal, dan mereka memiliki banyak efek samping pada manusia Sesuai * dan hewan menganggap terhadap fenomena eukariotik anggota kerajaan jamur. Oleh karena itu, sangat penting untuk memilih pilihan terapi prosedur untuk pengobatan dermatofitosis berdasarkan spesies dermatofit terlibat (7). Dalam beberapa tahun terakhir, beberapa peneliti telah berfokus pada perancangan metode molekuler baru untuk cepat identifikasi dermatofit pada genus dan spesies tingkat baik secara langsung pada sampel klinis atau di muda non-reproduksi jamur koloni (8-12). Namun, tidak ada molekul diterima secara luas prosedur yang mampu membedakan semua dikenal dermatofit dari 3 genera utama. Karena banyak tumpang tindih ada di dalam dan antar marga dan spesies dalam diagnosis jamur dermatophytic, yang tuntutan untuk pengujian sampel lebih dari yang berbeda geografis daerah untuk membangun tinggi prosedur diagnostik yang efektif telah secara dramatis meningkat dalam beberapa tahun terakhir.

Dalam pekerjaan sebelumnya, kami memiliki kesempatan untuk mengevaluasi spesifikasi cepat dan langsung dari jamur dengan menggunakan PCR pada spesimen kulit pasien (13). Hasil penelitian menunjukkan bahwa prosedur ini bisa tidak dianggap sebagai metode yang dapat diandalkan rutin untuk identifikasi akurat jamur dermatophytic Dengan memeriksa langsung dari bahan klinis. Dalam komunikasi ini, prosedur PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragmen polimorfisme panjang) diidentifikasi dalam ribosomDNA (rDNA) ulangi didirikan untuk molekul identifikasi dan diferensiasi lebih lanjut dari jamur dermatophytic terisolasi dari manusia kasus dermatofitosis. Khusus pertimbangan telah dilakukan untuk mengevaluasi efektivitas PCRRFLP metode untuk diferensiasi yang cepat dan akurat isolat dermatofit Iran di muda (D 5-10) koloni dibandingkan dengan rutinitas timeconsuming budaya teknik. Bahan dan Metode Klinis bahan Dalam penelitian eksperimental, sejumlah total 160 kasus dermatofitosis manusia disebut ilmu jamur Departemen Pasteur Institute of Iran selama bulan Juni 2005 sampai Mei 2006 adalah 12 bulan diperiksa (Tabel 1). Klinis spesimen (kulit mengorek) yang diperoleh dari daerah tubuh yang terkena dampak termasuk pangkal paha, kaki, tangan dan dada (Tabel 2) adalah dikumpulkan pada cawan Petri steril dan dipelihara pada suhu kamar sampai mereka dianalisis. Budaya kondisi Sebagian dari mengorek kulit dikultur pada Cawan Petri berisi agar-agar selektif untuk patogen jamur (SAPF) menengah dengan inokulasi tempat teknik. Kultur diinkubasi pada 25 C hingga pertumbuhan jamur terlihat untuk awal PCR-RFLP analisis dan kemudian untuk maksimal 4 minggu untuk identifikasi rutin berdasarkan pengamatan reproduksi struktur dengan metode slide budaya. Persiapan DNA DNA genomik diekstraksi dari jamur muda koloni, 5-10 hari-tua, ditanam di SAPF Petri piring dengan menggunakan penggiling di hadapan cair nitrogen untuk awal putus dari miselia tersebut. Ekstraksi DNA Akhir dicapai dengan menggunakan sebuah DNP TMKIT (CinnaGen Inc, Teheran-Iran) (8). Itu sebesar 2 uL larutan DNA digunakan sebagai

template di PCR berikut: Kontrol negatif DNA dari prokariota (E. coli) dan eukariota (manusia dan kelinci) diperoleh dari koloni terisolasi dan dari perifer darah mononuklear sel, masing-masing, dengan menggunakan kit yang sama. DNA dari Pichia pastoris dan Candida albicans digunakan sebagai kontrol positif. Baik positif dan negatif kontrol DNA sampel diperiksa dan diukur pada 2% gel agarose dan dengan menggunakan spektrofotometer. PCR dan penyaringan awal oleh RFLP PCR-diperkuat spacer ditranskripsi internal yang Wilayah (ITS) dari DNA ribosom (rDNA) adalah dilakukan dengan primer-PERUSAHAAN 1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG) dan ITS-4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC) bawah PCR berikut kondisi (8, 10, 11). Reaksi amplifikasi dilakukan pada akhir volume 50 uL berisi 25 ng dari template DNA, reaksi penyangga (10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 50 mM KCl), 2,5 mM MgCl2, 200 M (Masing-masing) dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP, 160 ng U primer, dan 2,5 DNA polimerase Taq. Sampel dilapis dengan parafin steril minyak dan PCR dilakukan selama 35 siklus dalam DNA Thermal Cycler (Bio-Rad) dengan 1 min dari denaturizing di 93 C, 1 menit dari annealing pada 58 C, dan 1 menit perpanjangan pada 72 C dan kemudian akhir perpanjangan selama 7 menit pada 72 C PCR produk (5 uL / sampel) dipisahkan dengan elektroforesis dalam gel agarosa 2% selama 2 jam. Amplifikasi produk dideteksi dengan pewarnaan etidium dengan bromida dan yang divisualisasikan di bawah sinar UV. Untuk mengevaluasi spesifisitas uji tersebut, sukses amplifikasi DNA kontrol dari eukariota lainnya dan prokariota juga dilakukan dalam cara yang sama. Para amplikon yang dicerna dengan enzim restriksi MvaI, HinfI dan HaeIII (MBI Fermentas) dan kemudian dielektroforesis dalam gel agarosa 2%, diwarnai dengan etidium bromida, dan diamati di bawah sinar UV. Hasil Frekuensi dermatofit terisolasi Seperti terlihat pada Tabel 1, jumlah total 160 bahan klinis (mengorek kulit) yang diperoleh dari

pasien, 97 pria dan 63 wanita, disebut Ilmu jamur Departemen Pasteur Institute of Iran selama 12 bulan dianalisa dengan baik langsung pemeriksaan mikroskopis dan tes budaya. Sejak PCR-RFLP dilakukan untuk menganalisis muda jamur koloni, spesimen budaya hanya positif dipertimbangkan dalam penelitian ini. Tabel 1 dan 2 menggambarkan frekuensi dan asal dari spesies dermatofit terisolasi dari Iran pasien. Jamur ini diidentifikasi berdasarkan pada pengamatan karakteristik koloni pada SAPF menengah serta morfologi mikroskopis reproduksi struktur koloni dewasa (2-4 minggu-lama) dengan teknik geser budaya. Sebagaimana ditunjukkan pada Tabel 1, sejumlah 6 dermatofit spesies yang diidentifikasi pada bahan klinis pasien yang diperiksa, dari yang T. rubrum (36,8%) menunjukkan frekuensi tertinggi diikuti oleh E. fluccosum (30,0%), T. mentagrophytes (24,3%), T. verrucosum (4,3%), T. tonsurans (3,1%) dan M. canis (0,6%). Frekuensi isolat dermatofit adalah ditunjukkan pada Tabel 2 berdasarkan daerah yang terkena tubuh pasien. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kedua T. rubrum dan T. mentagrophytes spesies adalah terutama diisolasi dari kaki, sedangkan E. fluccosum dan T. verrucosum terutama diperoleh dari pangkal paha dan tangan daerah, masing-masing. Amplifikasi PCR profil Sampel DNA dari koloni muda (dayold 5-10) diamplifikasi dengan PCR dan terdeteksi pada 2% gel agarosa. Untuk konfirmasi identitas, RFLP pola dermatofit terisolasi dibandingkan dengan yang dilaporkan untuk standar dermatofit oleh Mochizuki dkk. (10). Demikian juga, untuk kontrol positif dan negatif, DNA dari organisme yang dipilih untuk uji spesifisitas primer termasuk dua ragi (C. albicans dan Pichia pastoris), dua mamalia (manusia dan kelinci) dan satu prokariota, E. coli juga diperkuat (Gambar 1). Daerah ITS diperkuat dari spesies T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans dan T. verrucosum sekitar 680 bp panjang. Daerah ITS amplikon dari E. floccosum dan M. canis lebih besar, 780bp dan 720bp masing-masing (Tabel 3 dan Gambar. 1 & 2). Awal skrining daerah PERUSAHAAN dengan RFLP

analisa Untuk menghasilkan spesies-spesifik pola untuk jamur identifikasi, produk PCR dari sampel disaring dengan analisis RFLP dengan pembatasan enzim MvaI, HinfI dan HaeIII. Pencernaan produk PERUSAHAAN diperkuat dengan pembatasan endonuklease HinfI, untuk semua dermatofit diuji kecuali E. floccosum (250, 180, & 150 bp) yang dihasilkan unik dan mudah diidentifikasi fragmen pola 380 & 160 bp. Bagi M. canis, HinfI tidak dapat menghasilkan apapun jelas memotong pola (Tabel 3). Pola pemotongan produk PCR ITS untuk HaeIII adalah serupa untuk T. mentagrophytes, T. tonsurans, dan T. verrucosum (400 & 100 bp), lemah berbeda dengan M. canis (370 & 100 bp) dan berbeda nyata dibandingkan dengan T. rubrum (320 & 100 bp) dan E. floccosum (450 & 140 bp) (Tabel 3). Seperti terlihat pada Tabel 3 & Gambar. 3 pola pencernaan, diperoleh MvaI enzim cukup berbeda untuk semua isolat dermatofit kecuali M. canis (tidak dicentang). Pola-pola ini adalah sebagai 250, 160 & 120 bp untuk T. mentagrophytes, 370 & 160 bp untuk T. rubrum, 360 & 250 bp untuk T. tonsurans, 450 bp untuk T. verrucosum, dan 360, 230 & 170 bp untuk E. floccosum. Seperti ditunjukkan pada Tabel 3, di antara 59 isolat T. rubrum dan 7 isolat T. verrucosum berbeda band-ukuran produk PCR diperoleh dari hanya satu Trichophyton rubrum mengisolasi (800 bp terkait Tidak ada pasien yang ke 101) dan satu T. verrucosum (550 bp terkait Tidak ada pasien yang 137). RFLP pola Tidak ada pasien 137 dilaporkan harus benar-benar berbeda dengan pasien lain terinfeksi T. verrucosum (HinfI 300 bp; HaeIII 320 & 100 bp; MvaI 350 & 200 pb). Selanjutnya, antara 39 diperiksa isolat T. mentagrophytes, hanya dua khusus RFLP pola dilaporkan untuk nomor pasien 66 & 109 (Gbr. 3). Tabel 1: Jumlah frekuensi spesies dermatofit terisolasi dari budaya sampel klinis pada media SAPF berdasarkan jenis kelamin pasien Jenis n (%)

Laki-laki (%) Perempuan (%) T. mentagrophytes 39 (24,3) 17 (17,5) 22 (34,9) T. rubrum 59 (36,8) 43 (44,3) 16 (25,4) T. tonsurans 5 (3,1) 3 (3,1) 2 (3,2) T. verrucosum 7 (4,3) 4 (4,1) 3 (4,8) E. floccosum 49 (30,0) 29 (29,9) 20 (31,7) M. canis 1 (0,6) 1 (1,0) _ Jumlah 160 (100) 97 (100) 63 (100) Tabel 2: Perbandingan frekuensi spesies dermatofit diperoleh dari budaya sampel klinis berdasarkan daerah yang terkena dampak dari tubuh pasien Jenis Selangkangan Kaki Tangan Dada Jumlah T. mentagrophytes 2 33 2 2 39 T. rubrum 6 49 1 3 59 T. tonsurans _ 1 3 1 5 T. verrucosum _ 2 5 7 _ E. floccosum 39 2 3 5 49 Tabel 3: Pola produk PCR RFLP analisis rDNA dari koloni jamur menggunakan enzim restriksi HinfI, HaeIII dan MvaI. Pasien Bilangan 101, 137 dan juga hasil 109, 106 dan 137 acara yang berbeda untuk PCR dan RFLP, masing-masing Jenis produk PCR (bp) HinfI (bp) HaeIII (bp) MvaI (bp) T. mentagrophytes 680 370 -160 400-100 250-160-120-360-250-160-120 (109) 400 (66) T. rubrum 680-800 (101) 380-150 320-100 370-160 T. tonsurans 680 380-160 400-100 360-250 T. verrucosum 680-550 (137) 380-150-300 (137) 400-100 320-100 (137) 450 350-200 (137) E. floccosum 780 250-180-150 450-140 360-230-170 M. canis dipotong 370-100 720 Gambar. 1: Agarose gel elektroforesis (2%) dari produk PCR dari organisme yang berbeda. Jalur 1 & 12: Ukuran penanda; Lane 2: Candida albicans; Lane 3: Pichia pastoris; Lane 4: T.tonsurans; Lane 5: E. Flucosom; Lane 6: T. verrucosum; Lane 7: T. mentagrophytes; Lane 8: diskusi Infeksi pada jaringan keratin kulit, rambut

dan kuku pada manusia dan hewan oleh khusus kelompok jamur keratinophilic bernama, dermatofit, menghasilkan dermatofitosis. untuk seleksi identifikasi terapi terbaik, prosedur dari dermatofit pada tingkat genus atau spesies adalah sangat penting. Karena konvensional laboratorium prosedur untuk identifikasi dermatofit adalah baik spesifisitas lambat atau kurangnya aplikasi, cukup teknologi amplifikasi asam nukleat, telah membuat identifikasi cepat dan tepat dermatofit mungkin, diharuskan (14). PCRRFLP menyediakan alat cepat dan praktis untuk identifikasi isolat dermatofit yang independen karakteristik morfologi dan biokimia dan dengan demikian meningkatkan diagnosis laboratorium dari dermatofitosis (9-12). Penelitian ini dilakukan untuk mengevaluasi kemanjuran polimorfisme panjang fragmen restriksi (RFLP) analisis PCR diamplifikasi ribosom DNA (rDNA) termasuk ditranskripsi internal yang spacer (ITS) untuk mengidentifikasi jamur dermatofit dari klinis spesimen pada tingkat genus atau spesies di tahap awal pertumbuhan ketika reproduksi struktur tidak diproduksi untuk memungkinkan teknik rutin identifikasi jamur. Untuk memberikan kesempatan untuk membandingkan hasil serta akhir Kesimpulannya, semua sampel klinis dari mencurigakan lesi juga dibudidayakan dan diuji oleh konvensional diagnostik metode. Pola produk PCR, dalam beberapa kasus, efisien untuk mengidentifikasi isolat dermatoplyte di spesies misalnya tingkat E. floccosum dan M. canis, yang menghasilkan karakteristik besar am

con (780bp dan 720bp masing-masing), atau untuk membedakan antara spesies dari genus yang sama. Seperti yang diharapkan, fragmen ukuran produk PCR dari spesies yang berbeda menunjukkan panjang yang berbeda. Namun, perbedaan dengan beberapa penulis lainnya diperoleh dalam pola amplifikasi untuk T. rubrum dan T. verrucosum spesies (Tabel 3). Berdasarkan data yang dilaporkan oleh Mochizuki dkk. (9), produk PCR dari T. rubrum memiliki panjang dari 692 bp yang mirip dengan yang diperoleh untuk semua isolat T. rubrum kami (680 bp) kecuali mengisolasi Nomor 101 (800 pb). Ini adalah unik mengisolasi mungkin suatu strain atipikal dari T. rubrum atau dapat menjadi suatu strain penengah antara T. rubrum

dan T. mentagrophytes. Mengenai T. mentagrophytes, semua isolat kecuali isolat No.109 No.66 dan menunjukkan umum pola dengan MvaI yang mirip dengan T. mentagrophytes var. interdigitale seperti dilansir Mochizuki et al. (9) (Gbr. 3). Sehubungan dengan hal ini data diperoleh tampaknya bahwa kedua isolat, No.109 dan No.66, diduga T. mentagrophytes var. erinacei dan T. mentagrophytes var. quinckeanum, masing-masing. Dalam beberapa tahun terakhir pendekatan genotipik memiliki terbukti berguna untuk memecahkan masalah identifikasi tentang dermatofit, bahkan, genotipik perbedaan dianggap lebih stabil dan lebih tepat daripada karakteristik fenotipik (9-12, 14, 15). Selain itu, identifikasi spesies memiliki macam peran dalam memantau distribusi demografis dan perubahan dalam frekuensi tertentu dermatofit infeksi (16). Daerah PERUSAHAAN digunakan dalam penelitian sebelumnya untuk membedakan ragi ke tingkat spesies dengan menggunakan metode PCR (17, 18). Ini disorot oleh penelitian Colin dkk. yang menguji panjang subunit kecil-(18S) rDNA dan spacer ditranskripsi berdekatan internal yang (ITS) daerah diperkuat dengan primer ITS1-ITS4. Pencernaan produk PERUSAHAAN diperkuat dengan pembatasan endonuklease MvaI diproduksi unik dan mudah diidentifikasi fragmen pola untuk mayoritas spesies (9, 16). Laporan ini menggambarkan bagaimana aplikasi PCRRFLP untuk identifikasi spesies dan varietas dari dermatofit sering memanfaatkan primer pasang (ITS1-ITS4). Hasil penelitian menunjukkan (Tabel 3, Gambar. 3) bahwa pola pembatasan MvaI adalah sangat direproduksi dan konsisten untuk beberapa spesies, menunjukkan bahwa PERUSAHAAN daerah di dermatofit dilestarikan. Di sisi lain, dalam waktu sekitar 9 jam, kita bisa mendapatkan elektroforesis profil mulai dari budaya, sebagai teknik ekstraksi DNA kita digunakan tidak tidak memerlukan lebih dari 4 jam dan amplifikasi membutuhkan sekitar 5 jam. Secara umum, sedangkan satunya kelemahan dari penggunaan PCR-RFLP untuk mengidentifikasi dermatofit adalah biaya yang relatif lebih tinggi dibandingkan dengan metode klasik, keuntungan dari penggunaannya adalah banyak, sehingga memberikan kesempatan bagi dermatofit identifikasi pada tingkat spesies Oleh karena itu, metode ini dapat dari utilitas besar bila tidak

mungkin untuk menggunakan, untuk di atas yang ditentukan alasan, metode klasik, yang masih berlaku dan dianjurkan untuk mengidentifikasi spesies, dengan baik ditandai morfologi aspek (19). Dapat disimpulkan bahwa prosedur ini dapat membedakan marga dan kadang-kadang spesies medis jamur penting dan bahwa setelah percobaan validasi yang diperlukan, bisa digunakan langsung pada sampel klinis untuk membantu diagnosis yang tepat infeksi jamur sistemik. Ucapan Terima Kasih Karya ini didukung oleh hibah No 225 dari Pasteur Institute of Iran. Para penulis sangat berterima kasih kepada Mr A Abdollahi-Vaghe, Mr Rahimi, Nyonya M Dehnamaki, S dan L Aramli Ghasemi dari Departemen ilmu jamur dari Institute Pasteur untuk mereka jenis persiapan bahan pasien. Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki benturan kepentingan. Referensi 1. Rippon JW (1988). Kedokteran ilmu jamur: The Patogen dan Jamur Patogen yang Actinomycetes. 3rd ed, Harcourt Brace Menerjemahkan, Inc, Philadelphia, hlm: 169-275. 2. Weitzman I, Summerbell RC (1995). Itu dermatofit. Mikrobiologi Klinik Reviews, 8: 240-59.3. Mahmoudabadi AZ (2005). Sebuah studi dari dermatofitosis di Barat Daya Iran (Ahwaz). Mycopathologia, 160: 21-24. 4. Falahati M, L Akhlaghi, Lari AR, Alaghehbandan R (2003). Epidemiologi dermatophytoses di daerah selatan Teheran, Iran. Mycopathologia, 156: 279-87. 5. Khosravi AR, Mahmoudi M (2003). Dermatofit diisolasi dari hewan domestik di Iran. Mycoses, 46: 222-25. 6. Chadeganipour M, Shadzi S, Dehghan P, Movahed M (1997). Prevalensi dan etiologi dari dermatophytoses di Isfahan, Iran. Mycoses, 40: 321-24. 7. Gutzmer R, Mommert S, Kuttler U, Werfel T (2004). Cepat identifikasi dan diferensiasi DNA jamur pada dermatologi spesimen oleh Light Cycler PCR. J Med Microbiol, 53: 1207-1214. 8. Turin L, Riva F, G Galbiati, Cainelli T (2000). Doubleround cepat, sederhana dan sangat sensitif polymerase chain reaction assay untuk mendeteksi secara medis jamur relevan dalam dermatologis

spesimen. Eropa Jurnal Clinical Investigation, 30: 511-18. 9. Mochizuki T, H Tanabe, Kawasaki M, Ishizaki H, Jackson CJ (2003). Cepat identifikasi dari Trichophyton tonsurans oleh PCR-RFLP analisis DNA ribosom daerah. J Dermatol Sains, 32 (1): 25-32. 10. Mochizuki T, Kawasaki M, Ishizaki H, Makimura K (1999). Identifikasi beberapa isolat klinis dermatofit berdasarkan pada urutan nukleotida ditranskripsi internal yang spacer 1 (1 ITS) di ribosom nuklir DNA. J Dermatol, 26 (5): 276-81. 11. Kanbe T, Suzuki Y, Kamiya A, Mochizuki T, Kawasaki M, Fujihiro M, Kikuchi A. (2003). Spesies-identifikasi dermatofit Trichophyton, Microsporum dan Epidermophyton dengan PCR dan PCR-RFLP sasaran topoisomerase II DNA gen. J Dermatol Sains, 33 (1): 41-54. 12. Kanbe T, Suzuki Y, Kamiya A, Mochizuki T, Fujihiro M, Kikuchi A (2003). PCRbased identifikasi dermatofit umum spesies menggunakan primer spesifik menetapkan untuk topoisomerase II DNA gen. J Dermatol Sains, 32 (2): 151-61. 13. Mirzahoseini H, Bayat M, Razzaghi-Abyaneh M (2007). Cepat identifikasi dermatofit pada spesimen kulit Dermatophytic pasien dengan PCR: hambatan dan solusi. Iran Journal of Infectious Penyakit dan Kedokteran Tropis, 36: 39-44. 14. Liu D, Coloe S, R Baird, Pedersen J (2000). Penerapan PCR untuk identifikasi jamur dermatofit. J Med Microbiol, 49: 493-97. 15. Graser Y, El Fari M, Presber W, Sterry W, Tietz HJ (1998). Identifikasi umum dermatofit (Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton) dengan menggunakan polymerase rantai reaksi. Br J Dermatol, 138: 576-82. 16. Jackson CJ, Barton RC, Glyn V, E Evans (1999). Spesies identifikasi dan regangan diferensiasi jamur dermatofit oleh analisis ribosomal DNA spacer intergenik

daerah. J Clin Microbiol, 37: 931-36. 17. Chen YC, Eisner JD, Kattar MM, RassoulianBarrett SL, Lafe K, Yarfitz SL (2000). Identifikasi medis penting ragi menggunakan PCR deteksi berbasis polimorfisme DNA urutan dalam internal yang spacer wilayah 2 ditranskripsi dari yang rRNA gen. J Clin Microbiol, 38: 2302-10. 18. Lindsley MD, Hurst SF, Iqbal NJ, Morrison CJ (2001). Cepat identifikasi dimorfik dan ragi-seperti jamur patogen menggunakan probe DNA spesifik. J Clin Microbiol, 39: 3505-511. 19. Faggi E, Pini G, Campisi E, Bertellin C, Difonzo E, F Mancianti (2001). Aplikasi PCR untuk membedakan spesies umum dari dermatofit. J Clin Microbiol, 39: 3382-85.