PENENTUAN KADAR PROTEIN TOTAL(METODE KJELDAHL)

I. TUJUAN1. Dapat memahami metode kjeldahl untuk penentuan kadar protein2. Dapat mengetahui cara penentuan kadar protein secara kuantitatifII. TEORI DASARPrinsip metode kjeldahl adalah mula-mula bahan didestruksi dengan asam sulfat pekat menggunakan katalis selenium oksiklorida atau butiran Zn. Amonia yang terjadi ditampung dan dititrasi dengan bantuan indikator. Metode kjeldahl pada umumnya dapat dibedakan atas dua cara,yaitu cara makro dan semimikro.cara makro kjeldahl digunakan untuk sampel yang sukar dihomogenisasi dan besarnya 1-3 gram, sedangkan semi-mikro kjeldahl dirancang untuk sampel yang berukuran kecil. Yaitu kurang dari 300 mg dari bahan yang homogeny. kekurangannya adalah bahwa purin, pirimidin, vitamin-vitamin, asam amino besar, kreatin, dan kreatinin ikut teranalisis dan terukur sebagai nitrogen protein. Walaupun demikian, cara ini masih digunakan hingga kini dan dianggap cukup teliti untuk pengukuran kadar protein dalam bahan makanan, analisis protein dengan metode mikro-kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan, yaitu proses destruksi, proses destilasi, dan tahap titrasi. (Bintang, 2010)1. Proses Destruksi Pada tahap ini sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi penguraian sampel menjadi unsur-unsurnya, yaitu unsur-unsur C,H,O,N,S dan P. unsur N dalam protein ini dipakai untuk menentukan kandungan protein dalam suatu bahan. Sebanyak 100 mg sampel (kedelai,tepung terigu, atau bahan lain) ditambahkan dengan katalisator N sebanyak 0,5-1 gram yang dibungkus dengan kertas saring untuk memudahkan memasukkannya kedalam tabung reaksi besar,sehingga sampel dan katalisator tidak tercecer. Selain itu, kertas saring juga berfungsi untuk menyaring filtrate yang mengandung residu.Katalisator berfungsi untuk mempercepat proses destruksi dengan menaikkan titik didih asam sulfat saat dilakukan penambahan H2SO4 pekat,serta untuk mempercepat kenaikan suhu asam sulfat,sehingga destruksi berjalan lebih cepat. Sampel didestruksi hingga larutan berwarna jernih yang mengindikasikan bahwa proses destruksi telah selesai. Selama destruksi terjadi reaksi sebagai berikut :HgO + H2SO4HgSO4 + H2O2 HgSO4 Hg2SO4 + SO2 + 2OnHg2SO4 + 2 H2SO4 2 HgSO4 + 2 H2O +SO2(CHON) + On + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO42. Proses destilasi Larutan sampel jernih yang telah dingin kemudian ditambahkan dengan akuades untuk melarutkan sampel hasil destruksi agar hasil destruksi dapat didestilasi dengan sempurna, serta untuk lebih memudahkan proses analisis karena hasil destruksi mwelekat pada tabung reaksi besar. Kemudian,larutan sampel dan blanko didestilasi dalam kjeldahl. Pada dasarnya, tujuan destilasi adalah memisahkan zat yang diinginkan, yaitu dengan memecah ammonium sulfat menjadi ammonia (NH3) dengan menambahkan 20 mL NaOH-Na2S2O3 ,kemudian dipanaskan.Prinsip destilasi adalah memisahkan cairan atau larutan berdasarkan perbedaan titik didih. Fungsi penambahan NaOH adalah untuk memberikan suasana basa, karena reaksi tidak dapat berlangsung dalam keadaan asam, sedangkan fungsi penambahan Na2S2O3 adalah untuk mencegah terjadinya ion kompleks antar ammonium sulfat dengan Hg dari katalisator (HgO) yang membentuk merkuri ammonia sehingga membentuk ammonium sulfat. Kompleks yang terjadi, ikatannya kuat dan sukar diuapkan. HgO merupakan senyawa yang sukar dipecah dan bersifat mudah meledak Na2S2O3 berfungsi untuk mengendapkan HgO, sehingga tidak mengganggu reaksi kimia selanjutnya.Hg + H2O + SO4 HgSO4 + H2OPada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan penambahan NaOH sampai alkali dan dipanaskan dengan pemanas dalam alat kjeldahl. Selain itu, sifat NaOH yang apabila ditambah dengan akuades akan menghasilkan panas, meskipun energinya tidak terlalu besar jika dibandingkan pemanasan dari alat kjeldahl, yang ikut memberikan masukan enrgi pada proses destilasi. Panas tinggi yang dihasilkan alat kjeldahl juga berasal dari reaksi antara NaOH dengan (NH4)2SO4 yang merupakan reaksi yang sangat eksoterm, sehingga energinya sangat tinggi. Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh larutan asam standar. Asam standar yang dipakai dalam percobaan ini adalah asam borat 4% dalam jumlah yang berlebih. Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut :(NH4)2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2 NH4OH2 NH4OH 2 NH3 + 2 H2O4 NH3 + 2 H3BO3 2 (NH4)2BO3 + H2Reaksi destilasi akan berakhir bila ammonia yang telah terdestilasi tidak bereaksi lagi.setelah destilasi selesai, larutan sampel berwarna keruh dan terdapat endapan didasar tabung (endapan HgO), sedangkan larutan asam dalam Erlenmeyer akan berwarna biru karena berada dalam suasana basa akibat menangkap ammonia. Amonia yang terbentuk selama destilasi dapat ditangkap sebagai destilat setelah diembunkan (kondensasi) oleh pendingin balik di bagian belakang alat kjeldahl dan dialirkan ke dalam Erlenmeyer.3. Tahap Titrasi Titrasi merupakan tahap akhir dari seluruh metode kjeldahl pada penentuan kadar protein dalam bahan pangan yang dianalisis. Dengan melakukan titrasi, dapat diketahui banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia. Untuk tahap titrasi, destilat dititrasi dengan HCl yang telah distandardisasi (telah disiapkan) sebelumnya. Normalitas yang diperoleh dari hasil standardisasi adalah 0,02 N. selain destilat sampel, destilat blanko juga dititrasi, karena selisih titrasi sampel dengan titrasi blanko merupakan ekuivalen jumlah nitrogen. Jadi banyaknya HCl yang diperlukan untuk menetralkan akan ekuivalen dengan banyaknya N. Titrasi HCl dilakukan sampai titik ekuivalen yang ditandai dengan berubahnya warna larutan dari biru menjadi merah muda karena adanya HCl berlebih yang menyebabkan suasana asam (indicator BCG-MR berwarna merah muda pada suasana asam ) melalui titrasi ini, dapat diketahui kandungan N dalam bentuk NH4, sehingga kandungan N dalam protein pada sampel dapat diketahui.Kadar nitrogen (%N) dapat ditentukan dengan rumus berikut ini:%N N HCl 14,0008 100 Nts : Volume titrasi sampeltb : Volume titrasi blankodengan demikian % protein adalah sebagai berikut:% Protein = %N fkf k : Faktor konversi atau perkalian = 6,25III. ALAT DAN BAHANALATBAHAN

Labu kjeldahlSampel

Alat destilasiKalium sulfat

Pipet tetesAsam sulfat pekat

ErlenmeyerLempeng Zn

Gelas ukurAquadest

WaterbathAir es

Gelas kimiaNatrium hidroksida 0,1 N

TermometerAsam klorida 0,1 N

Alat pemanas (heater)Indikator Phenolftalein

IV. PROSEDUR KERJADitimbang 1 gram sampel yang telah dihaluskan kemudian dimasukkan ke dalam labu kjeldahl. Setelah itu ditambahkan 7,5 gram kalium sulfat dan 0,35 gram raksa (II) oksida dan 15 ml asam sulfat pekat. Semua bahan dipanaskan dalam labu kjeldahl dalam lemari asam sampai berhenti berasap dan diteruskan pemanasan sampai mendidih dan cairan sudah menjadi jernih. Pemanasan ditambahkan kurang lebih 30 menit, dimatikan pemanasan dan dibiarkan sampai dingin.Selanjutnya ditambahkan 100 ml aquadest dalam labu kjeldahl yang didinginkan dalam air es dan beberapa lempeng Zn, ditambahkan 15 ml larutan kalium sulfat 4% (dalam air) dan akhirnya ditambahkan perlahan-lahan larutan natrium hidroksida 50% sebanyak 50 ml yang telah didinginkan dalam lemari es.Labu kjeldahl dipasang dengan segera pada alat destilasi. Dipanaskan labu kjeldahl perlahan-lahan sampai dua lapisan cairan tercampur, kemudian dipanaskan dengan cepat sampai mendidih. Destilasi ditampung dalam Erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan baku asam klorida 0,1 N sebanyak 50 ml dan indicator phenolptalein 0,1% b/v (dalam etanol 95%) sebanyak 5 tetes, ujung pipa kaca destilator dipastikan masuk ke dalam larutan asam klorida 0,1 N. Proses destilasi selesai jika destilat yang ditampung lebih kurang 75 ml. sisa larutan asam klorida 0,1 N. titik akhir titrasi tercapai jika terjadi perubahan warna larutan dari merah menjadi kuning. dilakukan titrasi blanko.V. DATA PENGAMATAN & PERHITUNGANData pengamatanGambar

Tahap dekstruksiKacang hijau + Kalium sulfat + Mercuri + Asam sulfat pekat menghasilkan larutan berwarna hijau keruh.Kemudian di lakukan pemanasan dalam lemari asam.Saat di lakukan proses pemanasan, timbul asap.Setelah di lakukan pemanasan larutan menjadi tidak berwarna.Tahap dekstruksi selesai.

Tahap destilasiKalium sulfat 0,6 gram di larutkan kedalam 15 mL aquadest larutan berwarna bening.Natrium hidroksida 25 gram dilarutkan kedalam 50 mL aquadest larutan berwarna bening dan menimbulkan panas.Asam klorida 50 mL Zink

Lalu semua bahan dimasukkan ke labu Kjeldahl kecuali Asam klorida.

Setelah lebih kurang 30 menit, warna larutan menjadi bening .Larutan Asam klorida + indicator phenolptalein yang menampung destilat tetap bening.

Tahap titrasiHasil destilasi + Asam Klorida (HCl) 0,1 N sebanyak 50 ml + 5 tetes indicator phenolphthalein (dalam etanol 95%) + natrium hidroksida 0,1N. terbentuk larutan berwarna merah muda

PerhitunganLarutan Asam oksalat (C2H2O4 . 2H2O)

Massa = 0,6038 gram 0,604 gram

Di peroleh, volume NaOH yang terpakai titrasi adalah 10,6 mL. Maka,Asam Oksalat = Natrium HidroksidaN1 x V1 = N2 x V20,0958 x 10 = N2 x 10,6N2 = N2 = 0,0903 NMaka, di peroleh normalitas larutan NaOH adalah 0,0903 N.

Larutan Asam Klorida (volume 10 mL)Di peroleh, volume NaOH yang terpakai titrasi adalah 11,3 mL. Maka,Asam Klorida = Natrium HidroksidaN1 x V1 = N2 x V2N1 x 10 = 0,0903 x 11,3N1 = = 0,102 NMaka, di peroleh normalitas larutan HCl adalah 0,102 N.

Larutan Asam Klorida (volume 50 mL)Di peroleh, volume NaOH yang terpakai titrasi adalah 52,6 mL. Maka,Asam Klorida = Natrium HidroksidaN1 x V1 = N2 x V2N1 x 50 = 0,0903 x 52,6N1 = N1 = 0,095 NMaka, di peroleh normalitas larutan HCl adalah 0,095 N.

Kadar protein yang terkandung dalam sampel : Volume blanko adalah 52,6 ml ; Volume titran adalah 41,6 ml ; Berat sampel adalah 1 gram%N = x 100%%N = x 100%%N = x 100%%N = 1,39 %%protein = x %N%protein = 6,25 x %N%protein = 6,25 x 1, 39 %%protein = 8,7%Maka, di peroleh kadar protein yang terdapat dalam sampel yaitu kacang hijau adalah 8,7%VI. PEMBAHASANPrinsip kerja dari metode Kjeldahl adalah protein dan komponen organik dalam sampel didestruksi dengan menggunakan asam sulfat dan katalis. Hasil destruksi dinetralkan dengan menggunakan larutan alkali dan melalui destilasi. Destilat ditampung dalam larutan asam . Selanjutnya ion- ion borat yang terbentuk dititrasi dengan menggunakan larutan HCl.Pada proses destruksi, sample dipanaskan dalam H2SO4 pekat sehingga terjadi penguraian sample menjadi unsur-unsurnya. Unsur N yang dihasilkan akan dipakai untuk menentukan kadar protein. Untuk mempercepat proses destruksi, perlu ditambahkan katalis. Katalis yang digunakan terdiri dari campuran K2SO4 dan HgO yang mempercepat reaksi dengan meningkatkan titk didih dari H2SO4 pekat, peningkatan titik didih akan mengefektifkan reaksi antara asam sulfat dengan sampel (destruksi berjalan efektif). Hal tersebut disebabkan oleh lamanya waktu yang dibutuhkan oleh asam sulfat untuk menguap (semakin tinggi titik didih, maka waktu yang dibutuhkan asam sulfat untuk menguap akan semakin lama), selain itu H2SO4 juga dapat memutuskan ikatan pepetida dari protein yang ada disampel, karena H2SO4 untuk bereaksi dengan Asam amino dari sampel harus mempunyai titik didih yang tinggi sehingga menyebabkan putusnya ikatan C dan N dan menghasilkan NH4,Setelah pencampuran larutan yang diperoleh kuning kecoklatan hal ini diduga adanya air yang tersisa diawal pada saat pencucian alat sehingga air ikut tercampur, tapi seharusnya berwarna hitam dan kemudian saat pemanasan berjalan menjadi tidak berwarna hal ini karena adanya pelepasan gas CO2 dan H2O, dan setelah pelepasan gas CO2 dan H2O akan menghasilkan senyawa amonium sulfat. Asam amino+ H2SO4 (NH4)2SO4(liq)+ H2O (g)+ CO2 (g)Setelah tahap dekstruksi dilanjutkan dengan tahap destilasi Tujuan dari proses destilasi adalah memisahkan zat yang akan dianalisa dengan cara memecah ammonium sulfat menjadi ammonia (NH3), dengan penambahan aquadest sebanyak 100 ml yang bertujuan untuk pengenceran/sebagai pelarut, sehingga luas permukaan semakin besar dan mempermudah berjalannya suatu reaksi kimia, dan kemudian dengan penambahan lempeng Zn bertujuan untuk mencegah adanya letupan saat pemanasan, dan kemudian ditambahkan NaOH 50% bertujuan agar NaOH mengikat H2SO4, dan H2SO4, untuk mempercepat pelepasan ammonia dengan cara menciptakan suasana basa (reaksi tidak dapat berlangsung dalam kondisi asam). Setelah itu dilakukan distilasi dengan pemanasan sampai larutan dalam tabung destilasi tercampur, dan destilat yang diperoleh ditampung dalam erlenmeyer dan ujung pipa kaca destilator tepat masuk kedalam erlenmeyer agar destilat berikatan dengan HCl dan membentuk NH4Cl.Setelah itu dilanjutkan dengan proses titrasi dengan larutan baku HCl 0.1 N dan indikator pp yang berfungsi untuk memepercepat reaksi. Titrasi asam-basa digunakan untuk menentukan kadar protein dalam sampel. Karena NH3 yang terbentuk adalah asam lemah, digunakan HCl baku 0,1 N untuk menitrasi hasil destilasi, titik akhir di tandai dengan perubahan warna menjadi merah muda karena adanya indicator Phenolptalein pada kondisi sedikit basa (mendekati netral), dan titran yang dipergunakan untuk larutan sampel sebanyak 41,6 ml dan titran untuk larutan Blanko sebanyak 50 ml.

VII. KESIMPULAN1. Analisis protein dengan Metode Kjeldahl terdiri dari beberapa tahapan yaitu: destruksi, destilasi, dan titrasi.2. Di peroleh kadar protein yang terdapat dalam sampel yaitu Kacang hijau adalah 8,7%.VIII. DAFTAR PUSTAKA1. Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Penerbit UI-Press.Jakarta.2. Lehninger. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid 1. Jakarta : Erlangga3. Hamid,Abdul.2001.Biokimia Metabolisme Biomolekul. Jakarta: Penerbit Alfabeta