PENCIRIAN EKSTRAK AKTIF SITOTOKSIK DARI DAUN … · ii. PENCIRIAN EKSTRAK AKTIF SITOTOKSIK DARI...
Transcript of PENCIRIAN EKSTRAK AKTIF SITOTOKSIK DARI DAUN … · ii. PENCIRIAN EKSTRAK AKTIF SITOTOKSIK DARI...
PENCIRIAN EKSTRAK AKTIF SITOTOKSIK DARI DAUN
SIRSAK GUNDUL (Annona glabra) INDONESIA
MUHAMMAD NAZMI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
ABSTRAK
MUHAMMAD NAZMI. Pencirian Ekstrak Aktif Sitotoksik dari Daun Sirsak
Gundul (Annona glabra) Indonesia. Dibimbing oleh GUSTINI SYAHBIRIN dan
BUDI ARIFIN.
Sirsak gundul (Annona glabra) termasuk ke dalam famili Annonaceae.
Tanaman dari famili Annonaceae telah dilaporkan mengandung senyawa alkaloid,
flavonoid, dan asetogenin yang sangat baik sebagai antikanker. Tujuan penelitian
ini adalah melakukan fraksionasi terpandu-uji toksisitas larva udang (BSLT) dan
pencirian ekstrak aktif dari daun A. glabra Indonesia serta mengidentifikasi
kandungan fitokimianya. Fraksionasi ekstrak etanol 95% menggunakan ekstraksi
cair-cair menghasilkan 7 fraksi, yaitu fraksi air kuning, jingga, dan gelap, fraksi
kloroform, fraksi residu, fraksi heksana, dan fraksi metanol. Berdasarkan hasil
BSLT, fraksi kloroform merupakan fraksi teraktif dengan nilai LC50 98 ppm. Uji
fitokimia, fraksi teraktif tersebut menunjukkan golongan alkaloid, flavonoid,
steroid, triterpenoid, dan tanin. Fraksionasi lebih lanjut menggunakan eluen
heksana-CH2Cl2-metanol (90:40:5) menghasilkan 16 noda. Noda dengan
keterpisahan paling baik dianalisis spektrum inframerahnya dan menunjukkan
gugus-gugus fungsi dengan ikatan -OH, C=C aromatik, C-H sp2, dan C-H sp
3.
Kata kunci: Annona glabra, sirsak gundul, uji toksisitas larva udang
ABSTRACT
MUHAMMAD NAZMI. Characterization of The Cytotoxic Active Extract from
Indonesian Pond Apple (Annona glabra) Leaves. Supervised by GUSTINI
SYAHBIRIN and BUDI ARIFIN.
Pond apple (Annona glabra) is a member of Annonaceae. It has been reported that
plants from Annonaceae family contains alkaloid, flavonoid, and acetogenin having
good anticancer potency. The objectives of this research were to fractionate A. glabra
leaves assisted with brine-shrimp lethality test (BSLT), to characterize the active
extract, and to identify the phytochemical constituents. Fractionation of 95% ethanol
extract using liquid-liquid extraction gave 7 fractions, namely yellow, orange, and
dark water, chloroform, residue, hexane, and methanol fractions. Based on the BSLT
results, chloroform fraction showed the highest activity with LC50 of 98 ppm.
Phytochemical test of the most active fraction showed alkaloid, flavonoid, steroid,
triterpenoid, and tanin components. Subsequent fractionation of the chloroform
fraction by using hexane-CH2Cl2-methanol (90:40:5) eluent produced 16 spots. The
infrared spectrum of the best separated spot was analyzed and showed functional
groups with -OH, aromatic C=C, C-H sp2, and C-H sp3 bonds.
Keywords: Annona glabra, brine-shrimp lethality test, pond apple
ii
PENCIRIAN EKSTRAK AKTIF SITOTOKSIK DARI DAUN
SIRSAK GUNDUL (Annona glabra) INDONESIA
MUHAMMAD NAZMI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
iii
Judul Skripsi : Pencirian Ekstrak Aktif Sitotoksik dari Daun Sirsak Gundul
(Annona glabra) Indonesia
Nama : Muhammad Nazmi
NIM : G44096002
Tanggal Lulus:
Disetujui
Pembimbing I
Dr Gustini Syahbirin, MS
NIP 19600819 198903 2 002
Pembimbing II
Budi Arifin, SSi, MSi
NIP 19830109 200604 1 004
Diketahui
Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS
NIP 19501227 197603 2 002
iv
PRAKATA
Alhamdulillah. Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi
yang berjudul “Pencirian Ekstrak Aktif Sitotoksik dari Daun Sirsak Gundul
(Annona glabra) Indonesia”. Salawat serta salam semoga selalu tercurahkan
kepada Nabi Muhammad SAW, keluarga, dan para sahabatnya serta semua
pengikutnya hingga akhir zaman.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Gustini Syahbirin, MS dan
Budi Arifin, SSi, MSi selaku pembimbing yang senantiasa memberikan arahan,
dorongan semangat, dan doa kepada penulis selama melaksanakan penelitian.
Penulis juga mengucapkan terima kasih atas bantuan serta masukan selama
penelitian berlangsung kepada staf laboran Laboratorium Organik Pak Sabur serta
kepada Dr Bagus Purwanto, MAgr, Farida Laila, MSi, Atep Dian Supardan, SSi,
Ashadi Sasongko, SSi, dan rekan-rekan laboran di Direktorat Program Diploma
Analisis Kimia IPB.
Terima kasih tak terhingga penulis ucapkan kepada kedua orang tua, istri,
kakak, dan adik serta seluruh keluarga, atas doa dan kasih sayangnya. Terima
kasih juga dihaturkan kepada Doni, Nanda, Eris, Zulia, Wahyu, Dwi Utami, Ughi,
Laras, kepada rekan-rekan mahasiswa diploma IPB dan teman-teman
seperjuangan penelitian di Laboratorium Kimia Organik atas kerja samanya, serta
rekan-rekan mahasiswa S1 Kimia Alih Jenis atas kebersamaannya.
Penulis berharap karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Desember 2012
Muhammad Nazmi
v
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Banyumulek pada tanggal 5 Mei 1986 dari pasangan
Bapak H Ahsanul Arifin dan Ibu Nurmah. Penulis adalah putra keempat dari lima
bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari MA Nurul Hakim Kota Kediri dan pada
tahun yang sama diterima di Direktorat Program Diploma IPB Program Keahlian
Analisis Kimia. Tahun 2007_2008 penulis melaksanakan praktik kerja lapangan di
Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong. Tahun 2008_2009 melaksanakan magang kerja
di Shimota Farm Provinsi Ibaraki Jepang. Tahun 2009 penulis melanjutkan
pendidikan S1 pada Program Alih Jenis Departemen Kimia Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB. Tahun 2009_2012 penulis aktif sebagai asisten
dosen pada Direktorat Program Diploma IPB, dan pernah bekerja sebagai staf
Quality Control pada salah satu pabrik farmasi di daerah Bogor, pada tahun
2006_2008 penulis juga aktif di dalam berbagai organisasi. Di antaranya, penulis
pernah menjabat sebagai juru bicara BEM J IPB, anggota komisi disiplin
Direktorat Program Diploma IPB, serta aktif di dalam organisasi BKIM IPB.
vi
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ................................................................................................. vii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... vii
PENDAHULUAN ................................................................................................... 1
METODE ................................................................................................................. 1
Alat dan Bahan........................................................................................................... 1
Lingkup Kerja ............................................................................................................ 1
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................ 3
Kadar Air ................................................................................................................... 3
Ekstrak ....................................................................................................................... 3
Toksisitas dengan Metode BSLT ............................................................................... 3
Fitokimia Fraksi Kloroform ....................................................................................... 4
Hasil Partisi Fraksi Ekstrak Teraktif .......................................................................... 4
Analisis Spektrum FTIR ............................................................................................ 5
SIMPULAN DAN SARAN ..................................................................................... 6
Simpulan .................................................................................................................... 6
Saran .......................................................................................................................... 6
DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................. 6
LAMPIRAN ............................................................................................................. 8
vii
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Nilai LC50 fraksi ekstrak daun sirsak gundul ...................................................... 4
2 Hasil uji fitokimia ekstrak fraksi kloroform daun sirsak gundul ........................ 4
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Ekstrak hasil fraksionasi daun sirsak gundul ...................................................... 3
2 Hasil partisi ekstrak kloroform dengan berbagai campuran eluen ..................... 4
3 Hasil partisi fraksi kloroform dengan heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) pada λ
366 nm. ............................................................................................................... 5
4 Hasil KLT 2 dimensi dengan eluen heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) untuk
elusi pertama dan heksana-metanol (90:10) untuk elusi kedua. ......................... 5
5 Spektrum IR noda teratas fraksi kloroform daun sirsak gundul (warna hitam)
dibandingkan dengan kloroform (warna merah). ............................................... 5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Diagram alir penelitian ........................................................................................ 9
2 Hasil penentuan kadar air daun sirsak gundul................................................... 10
3 Bagan alir ekstraksi dan partisi asetogenin Annonaceae dan rendemen yang
dihasilkan .......................................................................................................... 11
4 Spektrum FTIR hasil pengukuran ..................................................................... 12
5 Spektrum kloroform (Pavia et al. 2009) ........................................................... 13
viii
1
PENDAHULUAN
Salah satu tanaman berkhasiat obat yang
hidup di iklim tropis ialah sirsak gundul
(Annona glabra) yang termasuk famili
Annonaceae. Namun, di Indonesia sirsak
umumnya masih sebatas dimakan buahnya
(Wirakusumah 1995). Padahal, seluruh bagian
tanaman sirsak dapat dimanfaatkan lebih luas,
misalnya sebagai antitumor dan pestisida
(Kintzios dan Barberaki 2004).
Famili Annonaceae, termasuk A. glabra,
banyak dipelajari karena kemampuannya
sebagai antikanker. Senyawa antikanker yang
telah ditemukan meliputi golongan alkaloid,
flavonoid (Kintzios dan Barberaki 2004,
Maria et al. 2007), dan asetogenin.
Asetogenin merupakan senyawa antikanker
yang paling banyak ditemukan. Terdapat 2100
spesies di dalam famili Annonaceae, dan
senyawa asetogenin telah ditemukan pada
beberapa spesies antara lain A. squamosa
(serikaya), A. muricata (sirsak), A. bullata, A.
longifolia, A. reticulata, A. glabra, A. jahnii,
A. cherimolia, Asimina triloba, Asimina
pariflora, Goniothalamus giganteus, Xylopia
aromatica, Rollinia mucosa, dan R.
emarginata (McLaughlin 2008).
Khasiat atau manfaat tanaman famili
Annonaceae di antaranya dapat menurunkan
kadar darah dari antigen tumor, memperkecil
ukuran tumor, dan menghambat pembelahan
sel tumor. Selain itu, dapat meningkatkan
pergerakan tubuh, menambah energi, dan
memperpanjang waktu hidup (McLaughlin
2008).
Sebelum digunakan untuk produk
antikanker, senyawa antikanker harus diuji
sitotoksisitas terlebih dahulu. Uji ini
digunakan untuk memprediksi keberadaan
senyawa yang bersifat toksik terhadap sel
(Kurnijasanti et al. 2008).
Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan
untuk mengetahui aktivitas farmakologi suatu
senyawa. Prinsipnya, komponen bioaktif
bersifat toksik jika diberikan dengan dosis
tinggi dan menjadi obat pada dosis rendah. Uji
toksisitas antara lain dilakukan dengan
menggunakan metode uji kematian larva
udang (BSLT) dengan larva Artemia salina
Leach sebagai hewan uji (Zebua 2011). Pada
metode BSLT, sifat toksik ekstrak ditentukan
dengan menghitung jumlah kematian larva
udang pada setiap konsentrasi yang diujikan.
Suatu ekstrak dikatakan toksik jika memiliki
nilai LC50 kurang dari 1000 ppm setelah
waktu kontak 24 jam (Meyer et al. 1982).
Kandungan metabolit sekunder tanaman
beragam bergantung pada tempat tumbuhnya.
Hal ini mendorong pentingnya penelitian
kandungan dan khasiat tanaman A. glabra
Indonesia. Pada penelitian ini, dilakukan
fraksionasi-terpandu uji toksisitas terhadap
ekstrak etanol dari daun A. glabra. Salah satu
noda dengan keterpisahan yang baik dari
fraksi teraktif yang didapat dicirikan
kelompok senyawanya dengan
spektrofotometer inframerah transformasi
Fourier (FTIR).
METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan selama
penelitian ini ialah alat-alat kaca, mikropipet,
neraca analitik, oven, penguap putar,
multiwell 24 sumur, dan alat FTIR Perkin
Elmer seri SpectrumOne Universitas Islam
Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Bahan-
bahan yang digunakan ialah daun sirsak
gundul dari kawasan Kampus IPB Dramaga,
etanol 95%, larva A. salina Leach, heksana,
kloroform, pelat kromatografi lapis tipis
(KLT) aluminium, silika gel G60F254 dari
Merck, diklorometana, metanol, dan air
suling.
Lingkup Kerja
Metode penelitian yang dilakukan
mengikuti diagram alir pada Lampiran 1 yang
meliputi preparasi sampel daun sirsak gundul,
penentuan kadar air, ekstraksi daun sirsak,
partisi ekstrak etanol, uji toksisitas fraksi-
fraksi ekstrak, serta uji fitokimia dan pencirian
gugus fungsi dari salah satu komponen fraksi
teraktif.
Penentuan Kadar Air
Cawan porselen dikeringkan di dalam
oven bersuhu 105 °C selama 60 menit.
Selanjutnya cawan didinginkan dalam
eksikator selama 30 menit, dan ditimbang
bobot kosongnya. Sebanyak 3 g sampel
dimasukkan ke dalam cawan tersebut dan
dikeringkan di dalam oven selama 24 jam
pada suhu 105 °C. Setelah didinginkan dalam
eksikator sekitar 30 menit, cawan ditimbang
sampai diperoleh bobot tetap. Penentuan
kadar air dilakukan sebanyak 3 kali ulangan
(triplo) dan ditentukan dengan persamaan
berikut (AOAC 1984):
Kadar air (%) = 100%A
B
2
Keterangan:
A = bobot bahan sebelum dikeringkan (g)
B = bobot bahan setelah dikeringkan (g)
Preparasi dan Ekstraksi Daun Sirsak
Gundul
Daun sirsak gundul segar dipotong kecil-
kecil kemudian dicuci dengan air dan
dikering-udarakan. Sebanyak kira-kira 1 kg
sampel yang sudah kering dimaserasi dengan
etanol 95% dengan nisbah 1:8 selama 3×24
jam. Ekstrak dipekatkan dengan penguap
putar. Ekstrak pekat yang diperoleh ditimbang
dan dihitung rendemennya dengan persamaan
berikut:
Keterangan:
a = bobot ekstrak (g)
b = bobot contoh awal (g)
fk = faktor koreksi [(100+kadar air) /100]
Partisi Ekstrak (Rupprecht et al. 1990)
Ekstrak pekat etanol dipartisi dengan
pelarut kloroform-air 1:1. Mula-mula ekstrak
dilarutkan dengan kloroform, dimasukkan ke
corong pisah, lalu diekstraksi dengan air. Fase
organik dan fase residu dipisahkan dari fase
air. Fase air hasil ekstraksi dibagi jadi 3
bagian, yaitu fase air dengan wadah gelap,
fase air berwarna jingga, dan fase air
berwarna kuning. Masing-masing dipekatkan
dengan penguap putar dan freeze dry.
Selanjutnya ekstrak pekat kloroform dipartisi
dengan pelarut heksana-metanol dengan
nisbah 1:1, dan setiap fraksi yang didapat juga
dipekatkan dengan penguap putar.
Uji Toksisitas Fraksi-Fraksi Ekstrak
Penetasan Kista A. salina. Sebanyak 50
mg kista A. salina dimasukkan ke dalam
wadah berisi air laut yang sudah disaring dan
diaerasi. Kista dibiarkan selama 48 jam di
bawah pencahayaan lampu agar menetas
sempurna. Larva yang sudah menetas
digunakan untuk uji toksisitas.
Uji Toksisitas terhadap A. salina. Larutan stok ekstrak kloroform, ekstrak air,
residu, ekstrak heksana, dan ekstrak metanol
dibuat dalam konsentrasi 2000 ppm dengan
pelarut air laut kemudian diencerkan hingga
diperoleh konsentrasi 10, 100, 500, dan 1000
ppm. Ke dalam multiwell dimasukkan 400 μL
air laut, 10 ekor larva udang dalam 600 μL air
laut, dan 1 mL ekstrak. Ulangan dilakukan
sebanyak 3 kali. Multiwell ditutup dengan
aluminium foil dan diinkubasi selama 24 jam.
Nilai LC50 ditentukan dengan menggunakan
perangkat lunak SPSS.
Uji Fitokimia Fraksi Teraktif (Harborne
1987)
Alkaloid. Sebanyak 0.1 g fraksi ekstrak
teraktif dilarutkan dalam 10 mL kloroform
lalu ditambahkan 4 tetes NH4OH dan disaring.
Filtrat yang diperoleh ditambahkan 10 tetes
H2SO4 2 M, kemudian dikocok hingga
terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam diteteskan
pada lempeng tetes dan ditambahkan pereaksi
Dragendorf, Mayer, dan Wagner. Uji positif
jika berturut-turut didapatkan endapan
berwarna jingga, putih, dan cokelat.
Saponin. Sebanyak 0.1 g fraksi ekstrak
teraktif dilarutkan dalam 10 mL air suling
panas dan dididihkan selama 5 menit.
Campuran disaring dan dikocok kuat selama
10 menit hingga timbul busa. Apabila busa
stabil selama 10 menit, maka filtrat positif
mengandung saponin.
Steroid dan Triterpenoid. Sebanyak 0.1
g fraksi ekstrak teraktif dilarutkan dalam 25
mL etanol panas (50 ⁰C), kemudian disaring
ke atas kaca arloji dan diuapkan sampai
kering. Residu dilarutkan dalam eter dan
ditambahkan 3 tetes pereaksi Lieberman-
Buchard (3 tetes anhidrida asam asetat dan 1
tetes H2SO4). Uji positif triterpenoid ditandai
dengan terbentuknya warna merah atau ungu,
sedangkan uji positif steroid ditandai dengan
terbentuknya warna hijau atau biru.
Tanin. Sebanyak 0.1 g fraksi ekstrak
teraktif dilarutkan dalam 10 mL akuades
panas kemudian disaring. Filtrat ditambahkan
dengan FeCl3 1%. Bila dihasilkan warna
hijau, biru, atau hitam, maka filtrat positif
mengandung tanin.
Flavonoid. Sebanyak 0.1 g fraksi ekstrak
teraktif dilarutkan dalam 10 mL akuades
panas kemudian disaring. Sebanyak 5 mL
filtrat ditambahkan 0.05 g serbuk Mg, 1 mL
HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol, kemudian
dikocok kuat. Adanya flavonoid ditunjukkan
dengan terbentuknya warna merah, jingga,
atau kuning pada lapisan amil alkohol.
Partisi Fraksi Ekstrak Teraktif Fraksi ekstrak teraktif ditotolkan pada
pelat KLT sebanyak 5 kali totolan. Setelah
kering, langsung dielusi dalam bejana
kromatografi yang telah dijenuhkan oleh uap
eluen pengembang. Eluen yang digunakan
ialah campuran CHCl3-MeOH (9:1), CH2Cl2-
MeOH (19:1), C6H6-EtOAc-MeOH (5:4:1)
(Rupprecht et al. 1990), CH2Cl2-MeOH (2:1),
heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) (Gleye et
3
al. 2000), dan heksana-metanol (90:1) (Wu et
al. 1995). Noda yang dihasilkan dari proses
elusi diamati di bawah lampu UV pada
panjang gelombang 254 dan 366 nm. Eluen
yang menghasilkan noda paling banyak
dengan keterpisahan baik dipilih sebagai eluen
pada proses pemisahan dengan KLT
preparatif.
Analisis Spektrum FTIR
Salah satu noda dengan keterpisahan
paling baik hasil pemisahan dengan KLT
preparatif diukur dengan spektrofotometer
FTIR. Spektrum yang dihasilkan dianalisis
untuk menentukan golongan senyawanya.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Air
Kadar air dapat digunakan untuk
menentukan jumlah sampel awal yang harus
disediakan sampai keseluruhan proses isolasi
berakhir. Selain itu, kadar air dapat digunakan
untuk mengukur ketahanan sampel terhadap
kontaminan jamur atau mikrob. Menurut
Winarno (1992), suatu sampel dapat disimpan
dalam jangka waktu yang lama jika memiliki
kadar air di bawah 10%. Sampel daun sirsak
gundul segar yang digunakan pada penelitian
ini mengandung air yang cukup banyak, yaitu
75.45%, sedangkan sampel yang sudah
dikeringudarakan (serbuk) mengandung air
9.64% (Lampiran 2).
Berdasarkan hasil di atas, sampel daun
yang masih basah tidak boleh dibiarkan dalam
jangka waktu lama karena dapat menyebabkan
tumbuhnya jamur atau mikrob. Sampel dapat
disimpan dalam jangka waktu lama jika sudah
dikeringudarakan. Selain itu, diperlukan
sampel daun segar dalam jumlah banyak
karena sebagian besar komponen yang
terkandung merupakan air yang terikat secara
fisik.
Ekstrak
Proses ekstraksi pada penelitian ini
dilakukan dengan metode maserasi atau
perendaman dengan pelarut etanol 95%.
Metode ini dipilih untuk mengurangi
kemungkinan hilangnya komponen-komponen
yang tidak tahan terhadap proses pemanasan.
Perendaman sampel pada pelarut organik akan
memecah dinding sel tumbuhan akibat
perbedaan tekanan di dalam dan luar sel
sehingga metabolit sekunder yang ada dalam
sitoplasma akan terlarut pada pelarut organik
(Darwis 2000).
Pelarut alkohol lazim digunakan dalam
proses ekstraksi awal karena kemampuannya
melarutkan komponen polar maupun nonpolar
(Harbone 1987). Selain itu, penggunaan
alkohol pada ekstraksi awal dapat menambah
rendemen senyawa asetogenin (Rupprecht et
al. 1990). Penelitian senyawa asetogenin
sebelumnya juga banyak melakukan ekstraksi
awal dengan pelarut alkohol seperti metanol
(Gleye et al. 1998; Chang dan Wu 2001) dan
etanol (Wu et al. 1995; Zang et al. 1996; Kim
et al. 1998). Etanol digunakan karena lebih
aman dibandingkan dengan metanol. Bagan
alir proses ekstraksi dan partisi yang
dilakukan dapat dilihat pada Lampiran 3.
Partisi ekstrak pekat etanol 95% hasil
maserasi menghasilkan 7 fraksi, yaitu fraksi
air kuning, fraksi air jingga, fraksi air gelap,
fraksi kloroform, fraksi residu, fraksi heksana,
dan fraksi metanol (Gambar 1). Rendemen
setiap fraksi yang dihasilkan dapat dilihat
pada Lampiran 3.
Gambar 1 Ekstrak hasil fraksionasi daun
sirsak gundul: fraksi etanol 95%
(a), fraksi air gelap (b), fraksi
air jingga (c), fraksi air kuning
(d), fraksi kloroform (e), fraksi
heksana (f), fraksi residu (g),
dan fraksi metanol (h).
Toksisitas dengan Metode BSLT
Uji toksisitas dilakukan untuk menguji
potensi sitotoksik dari keseluruhan fraksi hasil
partisi ekstrak etanol 95% dengan parameter
nilai LC50 yang diperoleh dengan metode
BSLT. LC50 merupakan konsentrasi senyawa
bioaktif yang dapat menyebabkan kematian
50% populasi hewan uji.
Hasil uji BSLT menunjukkan bahwa
semua fraksi memiliki nilai LC50 di bawah
1000 ppm (Tabel 1). Menurut Krisnaraju et al.
(2005), suatu fraksi dikatakan aktif dan
berpotensi sebagai antikanker jika nilai LC50
kurang dari 1000 ppm. Oleh karena itu, dapat
disimpulkan bahwa keseluruhan fraksi aktif
dan berpotensi sebagai antikanker.
4
Perhitungan LC50 dilakukan dengan metode
SPSS pada selang kepercayaan 95%.
Tabel 1 Nilai LC50 fraksi ekstrak daun sirsak
gundul
Fraksi kloroform merupakan fraksi teraktif
dengan nilai LC50 paling rendah, yaitu 98
ppm. Oleh karena itu, fraksi tersebut
difraksionasi lebih lanjut. Uji fitokimia
dilakukan terhadap fraksi kloroform untuk
memastikan golongan senyawa yang ada.
Fitokimia Fraksi Kloroform
Pengujian fitokimia bertujuan menentukan
golongan metabolit sekunder yang terdapat di
dalam tanaman. Uji fitokimia fraksi kloroform
menunjukkan kandungan alkaloid, flavonoid,
triterpenoid, steroid, dan tanin (Tabel 2).
Rahayu et al. (1993) telah meneliti kandungan
senyawa metabolit sekunder bagian daun
tumbuhan A. squamosa. Fraksi kloroform
daun didapat mengandung senyawa alkaloid,
flavonoid, steroid, triterpenoid, dan tanin.
Hasil tersebut sama dengan yang diperoleh
pada penelitian ini. Senyawa alkaloid dalam
fraksi kloroform diduga terkandung paling
banyak, berdasarkan intensitas warna yang
dihasilkan dari uji fitokimia.
Tabel 2 Hasil uji fitokimia ekstrak fraksi
kloroform daun sirsak gundul
Golongan senyawa Hasil Keterangan
Alkaloid (++) terjadi endapan
Flavonoid (+) berwarna kuning
Triterpenoid (+) berwarna merah
Steroid (+) berwarna hijau
Saponin (-) tidak berbusa
Tanin (+) berwarna cokelat
Keterangan: (++) terdeteksi banyak, (+) terdeteksi sedikit, (-)
(-) tidak terdeteksi
Hasil Partisi Fraksi Ekstrak Teraktif
Partisi fraksi ekstrak teraktif diawali
dengan menguji beberapa eluen campuran
yang lazim digunakan untuk isolasi
asetogenin. Eluen CHCl3-MeOH (9:1)
(Gambar 2a) dan CH2Cl2-MeOH (19:1)
(Gambar 2b) menghasilkan 2 noda dengan
keterpisahan yang tidak baik. Eluen C6H6-
EtOAc-MeOH (5:4:1) (Gambar 2c)
menghasilkan 7 noda dengan keterpisahan
yang kurang baik. Campuran CH2Cl2-MeOH
(2:1) (Gambar 2d) tidak menghasilkan
keterpisahan yang baik, semua noda melebar
dan memanjang. Eluen heksana-CH2Cl2-
MeOH (90:40:5) (Gambar 2e) menghasilkan
16 noda dengan keterpisahan yang relatif baik
dibandingkan dengan eluen-eluen
sebelumnya. Eluen heksana-metanol (90:1)
(Gambar 2f) menghasilkan 6 noda dengan
keterpisahan yang baik, tetapi totolan noda
masih terlihat pekat yang menunjukkan bahwa
masih banyak komponen belum terpisahkan
(Gambar 2).
a b c d e f
Gambar 2 Hasil partisi ekstrak kloroform
dengan campuran eluen CHCl3-
MeOH (9:1) (a), CH2Cl2-MeOH
(19:1) (b), C6H6-EtOAc-MeOH
(5:4:1) (c), CH2Cl2-MeOH (2:1)
(d), heksana-CH2Cl2-MeOH
(90:40:5) (e), dan heksana-
metanol (90:1) (f).
Campuran eluen heksana-CH2Cl2-MeOH
(90:40:5) memberikan noda paling banyak
dengan keterpisahan relatif baik dibandingkan
dengan eluen lainnya. Eluen ini kemudian
digunakan dalam KLT preparatif. Didapatkan
noda dengan keterpisahan yang paling baik
berwarna merah dengan nilai retardation
factor (Rf) 0.66 (Gambar 3). Pemilihan noda
tersebut didasarkan sifat nonpolar dari
asetogenin yang aktif sebagai antikanker.
Oleh karena itu, penggunaan eluen yang
nonpolar akan memisahkan senyawa tersebut
paling jauh.
Ekstrak LC50 (ppm)
Fraksi air kuning 828
Fraksi air jingga 297
Fraksi air gelap 304
Fraksi residu 884
Fraksi kloroform 98
Fraksi methanol 350
Fraksi heksana 377
5
Gambar 3 Hasil partisi fraksi kloroform
dengan heksana-CH2Cl2-MeOH
(90:40:5) pada λ 366 nm.
Analisis Spektrum FTIR
Noda dengan keterpisahan paling baik
hasil KLT preparatif diperiksa lebih lanjut
kemurniannya dengan KLT analitik 2
dimensi. Elusi pertama menggunakan
campuran eluen heksana-CH2Cl2-MeOH
(90:40:5), dilanjutkan elusi kedua dengan
campuran heksana-metanol (90:10). Proses
elusi pertama dan kedua menghasilkan noda
tunggal (Gambar 4).
E1
E2
Gambar 4 Hasil KLT 2 dimensi dengan eluen
heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5)
untuk elusi pertama dan heksana-
metanol (90:10) untuk elusi
kedua.
Noda hasil KLT preparatif selanjutnya
dilarutkan dengan kloroform dan diukur
spektrumnya, dibandingkan dengan spektrum
kloroform p.a. Spektrum masing-masing dapat
dilihat pada Lampiran 4, sedangkan spektrum
gabungan ditunjukkan pada Gambar 5.
Spektrum IR kloroform dicirikan oleh
bilangan gelombang ( ) 757.9 cm-1
yang
merupakan daerah vibrasi ulur C-Cl. Selain
itu, terdapat vibrasi ulur C-H di 3019.20 cm
-1. Spektrum kloroform tersebut sama
dengan spektrum kloroform yang dirujuk dari
Pavia et al. (2009) (Lampiran 5). Menurut
Mistry (2009), puncak khas untuk pelarut
kloroform berada pada kisaran 3060_2960,
1250_1180, 945
_935, dan 830
_600 cm
-1. Oleh
karena itu, serapan dalam spektrum noda
teratas hasil KLT preparatif di 626.97,
669.35, 849.42, 877.38, 928.66, 1216.01,
1421.00, 1475.11, 1522.74, dan 2400.11 cm-1
juga berasal dari pelarut kloroform.
Gambar 5 Spektrum IR noda teratas fraksi
kloroform daun sirsak gundul
(warna hitam) dibandingkan
dengan kloroform (warna
merah).
Spektrum FTIR noda setelah dikoreksi
dengan spektrum kloroform memberikan
pendugaan bahwa terdapat gugus fungsi
alkohol (-OH) pada 3433.57 (ulur O-H
berikatan hidrogen), 3630.31, dan 3682.01
cm-1
(ulur O-H bebas). Kemunculan pita
serapan tajam O-H bebas di 3650_3600 cm
-1
bersamaan dengan pita serapan lebar O-H
berikatan hidrogen di 3400_3300 cm
-1 lazim
dijumpai ketika spektrum senyawa ditentukan
dalam pelarut (Pavia et al. 2009). Hal tersebut
diperkuat dengan adanya puncak pada
1016.70 cm-1
yang menunjukkan vibrasi ulur
C-O untuk alkohol primer (Mistry 2009).
Selain gugus tersebut, diduga terdapat C=C
aromatik berdasarkan serapan pada 1475.11 dan 1602.36 cm
-1. Serapan kuat pada
3019.20 cm-1
diperkirakan berasal dari C-H
sp2 (alkena atau aromatik). Terdapat beberapa
serapan gugus C-H, yaitu pada 2837.86
(ulur C-H alifatik alkana), 2944.84 (ulur C-H
alifatik alkana), dan 928.66 (tekuk C-H
alkena) cm-1
.
Spektrum FTIR tersebut tidak memberikan
puncak pada 1770 dan 1745 cm-1
yang
merupakan ciri khas lakton jenuh dan
takjenuh dari asetogenin (Rupprecht et al.
1990). Oleh sebab itu, dapat disimpulkan
bahwa noda yang diisolasi tersebut bukan
golongan asetogenin. Selain itu, tidak terdapat
serapan (puncak) untuk gugus karbonil (C=O)
4000.0 3000 2000 1500 1000 450.0
-2.0
10
20
30
40
50
60
70
80.0
cm-1
%T
C HC l3 pa
spot merah teratas
C HC L3 pa
Laborato ry T es t Result
6
sebagai ciri umum kebanyakan flavonoid
(Sukadana 2010). Oleh sebab itu, noda
tersebut juga bukan termasuk golongan
flavon, flavonol, atau golongan flavonoid lain
dengan gugus karbonil di C-4.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Uji toksisitas BSLT menghasilkan fraksi
kloroform sebagai fraksi teraktif dari ekstrak
daun sirsak gundul (A. glabra) dengan nilai
LC50 98 ppm. Berdasarkan hasil uji fitokimia,
fraksi tersebut mengandung golongan
senyawa alkaloid, flavonoid, steroid,
triterpenoid, dan tanin.
Eluen campuran heksana-CH2Cl2-MeOH
(90:40:5) menghasilkan noda paling banyak
dengan keterpisahan yang baik. Spektrum
FTIR dari salah satu noda dengan
keterpisahan yang paling baik menunjukkan
keberadaan gugus alkohol (-OH), C=C
aromatik, serta C-H sp2 dan sp
3.
Saran
Semua noda hasil KLT preparatif harus
diuji dengan BSLT untuk menentukan noda
teraktif. Penentuan struktur noda teraktif
dilanjutkan dengan spektometer resonans
magnet inti dan spektometer massa.
DAFTAR PUSTAKA [AOAC] Association of Official Analytical
Chemists. 1984. Official Methods of
Analysis. Ed ke-14. Arlington: AOAC.
Chang FR, Wu YC. 2001. Novel cytotoxic
Annonaceous acetogenins from Annona
muricata. J Nat Prod. 64:925-931.
Darwis D. 2000. Teknik Dasar Laboratorium
dalam Penelitian Senyawa Bahan Hayati.
Padang: FMIPA Universitas Andalas.
Gleye C, Duret P, Laurens A, Hocquemiller
R, Cave A. 1998. cis-Monotetrahydrofuran
acetogenins from the roots of Annona
muricata. J Nat Prod. 61:576-579.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia.
Padmawinata K, penerjemah. Bandung:
ITB. Terjemahan dari: Phytocemical
Methods.
Kim G et al. 1998. Two new mono-
tetrahydrofuran ring acetogenins,
annomuricin E and muricapentocin, from
the leaves of Annona muricata. J Nat
Prod. 61:432-436.
Kintzios SE, Barberaki MG, editor. 2004.
Plants That Fight Cancer. New York:
CRC Pr.
Krishnaraju AV et al. 2005. Assessment of
bioactivity of Indian medicinal plants
using brine shrimp (A. salina) lethality
assay. Int J Appl Sci Eng. 3:125-134.
Kurnijasanti R, Hamid IS, Rahmawati K.
2008. Efek sitotoksik in vitro dari ekstrak
buah mahkota dewa (Phaleria
marcocapra) terhadap kultur sel kanker
mienoma. J Penel Med Eksakta. 7(1):48-
54.
Maria RGV et al. 2007. Flavonoids from
Annona dioica leaves and their effects in
Ehrlich carcinoma cells, DNA-
topoisomerase I and II. J Braz Chem Soc.
18:1554-1559.
McLaughlin JL. 2008. Paw Paw and cancer:
Annonaceous acetogenins from discovery
to commercial products. J Nat Prod.
71:1311-1321.
Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE. 1982.
Brine shrimp: a convenient general
bioassay for active plant constituent.
Planta Medica. 45:31-34.
Mistry BD. 2009. A Handbook of
Spectroscopic Data Chemistry (UV, IR,
PMR, 13
C NMR, and Mass Spectroscopy).
Jaipur: Oxford.
Pavia DL, Lampman GM, Kriz GS, Vyvyan
JR. 2009. Introduction to Spectroscopy.
Ed ke-4. Belmont: Brooks/Cole.
Rahayu RD, Chairul, Harapini M. 1993.
Penelitian fitokimia dan efek mikrobial
ekstrak serikaya terhadap E. coli. Di
dalam: Proyek Litbang Sumber Daya
Hayati. Prosiding Seminar Hasil
Penelitian dan Pengembangan; Bogor, 14
Jun 1993. Bogor: Puslitbang Biologi-LIPI;
1993. hlm 154-164.
7
Rupprecht JK, Hui YH, McLaughlin JL. 1990.
Annonaceous acetogenin: a review. J Nat
Prod. 53:237-278.
Sukadana IM. 2010. Aktivitas antibakteri
senyawa flavonoid dari kulit akar Awar-
Awar (F. septica). J Kim. 4:63-70.
Winarno FG. 1992. Kimia Pangan dan Gizi.
Jakarta: Gramedia.
Wirakusumah ES. 1995. Buah dan Sayur
untuk Terapi. Jakarta: Swadaya.
Wu FE et al. 1995. Two new cytotoxic
monotetrahydrofuran Annonaceous
acetogenins, annomuricins A and B, from
the leaves of Annona muricata. J Nat
Prod. 58:830-836.
Zebua NI. 2011. Aktivitas hambatan
gabungan ekstrak kunyit (Curcuma
domestica Va), temulawak (Curcuma
xanthorriza Roxb), dan lempuyang
(Zingiber zerumbet) terhadap poliferasi sel
kanker usus besar HCT (ATCC-CCL 116)
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
7
LAMPIRAN
9
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
KLT analitik
KLT preparatif
Uji fitokimia
Uji toksisitas (BSLT)
Ekstrak H2O Ekstrak CHCl3
Ekstrak etanol
Penentuan kadar air Daun sirsak
Pengeringan sampel
Maserasi dengan etanol
95%
Ekstrak teraktif
Noda dengan keterpisahan paling baik
Spektrofotometer FTIR
Partisi dengan heksana-
metanol
Ekstrak metanol Ekstrak heksana
Ekstrak residu
Partisi dengan CHCl3-H2O
10
Segar
Lampiran 2 Hasil penentuan kadar air daun sirsak gundul
Setelah dikeringkan
Ulangan Massa awal (g) Massa akhir (g) Bobot sampel
kering (g)
Kadar air
(%) cawan sampel cawan + sampel
1 3.4490 1.9508 5.2052 1.7562 9.98
2 3.3200 1.5594 4.7320 1.4120 9.45
3 3.1550 1.7661 4.7536 1.5986 9.48
Rerata 9.64
Ulangan Massa awal (g) Massa akhir (g)
cawan + sampel
Bobot sampel
kering (g)
Kadar air
(%) Cawan sampel
1 6.5050 3.0034 7.2456 0.7406 75.34
2 6.4353 2.9670 7.1482 0.7129 75.97
3 6.1543 3.0750 6.9217 0.7674 75.04
Rerata 75.45
11
Lampiran 3 Bagan alir ekstraksi dan partisi asetogenin Annonaceae dan
rendemen yang dihasilkan
Serbuk daun A. glabra (505.52 g)
Partisi heksana-
MeOH 90%
(1:1)
Zat larut etanol 95% (5.07%) Ampas/sisa (94.93%)
Partisi CHCl3-H2O (1:1)
Zat larut H2O (22.50%) Residu (5.04%) Zat larut CHCl3 (72.46%)
Zat larut heksana
(13.60%)
Zat larut MeOH 90%
(86.40%)
Air kuning
(21.62%)
Air gelap
(32.44%)
Air jingga
(45.94%)
12
Lampiran 4 Spektrum FTIR hasil pengukuran
4000.0 3000 2000 1500 1000 450.0
-2.0
10
20
30
40
50
60
70
83.0
cm-1
%T
C HC l3 pa
spot merah teratas
C HC L3 pa
Laborato ry T es t Result
3689.00
3621.12
3019.65
2399.79
1522.76
1475.62
1420.48
1215.63
1045.98
928.69
757.55
669.24
626.96
4000.0 3000 2000 1500 1000 450.0
-3.0
10
20
30
40
50
60
70
80
85.0
cm-1
%T
C HC l3 pa
spot merah teratas
Laborato ry T es t Result
3682.01
3630.32
3433.57
3019.20
2944.84
2837.86
2400.11
1602.36
1522.74
1475.11
1421.00
1333.68
1216.01
1016.70
928.66
877.38
849.42
757.95
669.35
626.97
495.17
Spektrum FTIR kloroform p.a
Spektrum FTIR noda teratas dari fraksi kloroform A. glabra dengan pelarut kloroform p.a
13
Lampiran 5 Spektrum kloroform (Pavia et al. 2009)