Efek Sitotoksik Protein dari Daun Mirabilis jalapa L. Hasil Pemurniandengan kolom CM Sepharose CL-6B

terhadap Kultur Sel HeLa

Ni Putu Ariantari1*, Zullies Ikawati2, Sudjadi2, Sismindari2

1Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana 2Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada

alamat korespondensi*: ari_dedhika@yahoo.com

PendahuluanKanker merupakan suatu penyakit

sel, dengan ciri adanya gangguan ataukegagalan mekanisme pengatur multiplikasidan fungsi homeostatis lainnya padaorganisme multiseluler. Di negara maju yangtelah berhasil membasmi penyakit infeksi,kanker merupakan penyebab kematiankedua, setelah penyakit kardiovaskuler(Heyzer et al., 1987).

Saat ini, telah banyak dikembangkansenyawa kimia baru yang ditelusuri daribahan alam, yang secara tradisional dikenalberkhasiat sebagai obat. Salah satu senyawabioaktif dari tanaman yang diindikasikansebagai antikanker adalah Ribosome Inacti-vating Proteins (RIPs). Terdapat 2 tipe RIPsyaitu RIPs tipe 1 dan tipe 2. RIPs merupakanprotein toksik dari tanaman dengan aktivitasRNA N-glikosidase yang mampumendepurinasi rRNA sehingga bisa merusakribosom dan menghentikan sintesis protein.Selama ini, RIPs diketahui memilikibeberapa aktivitas biolois antara lainaktivitas imunosupresif, abortifacient, anti-viral, sitotoksisitas pada sel mamalia danaktivitas pemotongan DNA superkoil untaiganda. Ketertarikan pada RIPs dewasa ini

AbstractMirabilis jalapa L. leaves have been known containing Ribosome Inactivating Proteins

(RIPs) base on its N-glycosidase activity and cleavage of supercoiled double stranded DNA.The research aims to investigate cytotoxic activity of protein isolated from Mirabilis jalapa L.leaves against HeLa cell culture. In this research, crude extract of Mirabilis jalapa L. leaveswas separated by gradual precipitation using sulphate ammonium followed by dyalisis. Fur-ther separation of protein fraction with cation exchange chromatography using CM SepharoseCL-6B column and elution with sodium phosphate buffer 5 mM pH 6,5 for 30 minutes contin-ued with sodium phosphate buffer 5 mM pH 6,5 containing 0-0,5 M NaCl by gradient elutionfor 90 minutes. Cytotoxicity activity testing of protein fraction that showed an ability to cleavesupercoiled double stranded DNA revealed that RIPs eluated at NaCl gradient of 0.33-0.37 Mand 0.38-0.41 M, concentration of 0.553 mg/mL rrelatively less toxic against HeLa cell culturewith percentage of cytotoxicity of 29,53%.

Keywords: Mirabilis jalapa L., RIPs, cytotoxicity

meningkat, karena potensinya untuk dirakitmenjadi suatu imunotoksin sehingga dapatdikembangkan sebagai antikanker (Barbieriet al., 1993).

Vivanco et al. (1999) melaporkanbahwa akar dan daun Mirabilis jalapa L yangterdapat di Peru mengandung protein antivi-ral yang aktif melawan transmisi mekanikTobacco Mosaic Virus (TMV) padatembakau, tomat dan lada. Protein tersebuttermasuk RIPs tipe 1 yaitu Mirabilis Antivi-ral Protein (MAP). MAP juga terbuktimampu menghambat sintesis protein Es-cherichia coli sama baiknya sepertihambatannya pada sel eukariota (Habuka etal. , 1999). Berdasarkan penelitiansebelumnya, diketahui bahwa fraksi proteinhasil dialisis dari ekstrak daun Mirabilisjalapa L. mampu memotong DNA superkoiluntai ganda menjadi nicked circular danlinier serta bersifat sitotoksik terhadap kultursel HeLa (Elly, 2000) dan kultur sel Raji(Sari, 2002). Protein murni dari daunMirabilis jalapa L. yang diperoleh melaluipengendapan bertingkat dengan amoniumsulfat dan dilanjutkan dengan kromatografipenukar kation menggunakan kolom CMSepharose Cl-6B diketahui mempunyai

aktivitas memotong DNA superkoil pUC18(Herawati, 2002) dan aktivitas N-glikosidaseterhadap Saccharomyces cerevisiae (yeast)(Prasetyowati, 2002). Akan tetapi belumdiketahui apakah protein hasil pemurniantersebut mempunyai aktivitas sitotoksikterhadap sel HeLa. Dalam penelitian inidilakukan pemurnian dengan kromatografipenukar kation menggunakan kolom CMSepharose CL-6B untuk menentukan proteinspesifik yang memiliki aktivitas mirip RIPsdan aktivitas sitotoksiknya terhadap selHeLa.

Metode PenelitianBahan Penelitian

Semua bahan kimia yang digunakanmempunyai kualitas pro analisis. Bahantanaman yang digunakan adalah daunMirabilis jalapa L. segar, varietas bungamerah keunguan yang tumbuh di daerahSamirono, Sleman Yogyakarta. Determinasidaun Mirabilis jalapa L. telah dilakukan dilaboratorium Biologi Farmasi FakultasFarmasi UGM Yogyakarta.

Bahan untuk ekstraksi dan pemurnian:natrium fosfat, NaCl, ammonium sulfat danCM Sepharose Cl-6B. Bahan untuk ujiaktivitas pemotongan DNA superkoil untaiganda: Agarosa (Gibco BRL), larutan TBE5X: tris borat 0,445M, asam borat 0,445 M,EDTA 0,01M pH 8,0; ethidium bromida(Sigma); dapar pemuat: silensilanol (Sigma)0,25% v/v, biru brom fenol (Sigma) 0,25%v/v, gliserol 30% v/v; larutan dpar TMN: trisklorida 50 mM pH 8,0, magnesium klorida10 mM dan NaCl 100 mM. Bahan untuk ujisitotoksisitas: kultur sel HeLa diperoleh daristok Laboratorium Ilmu Hayati UGM; mediaRPMI 1640: RPMI 1640 (Sigma), natriumbikarbonat dan hepes; Media kultur sel:media RPMI 1640, Fetal bovine serum(Gibco) 10% v/v, penisilin-streptomisin(Gibco 1% v/v dan fungison (Gibco) 0,5%(v/v); MTT; reagen stopper: natrium dodesilsulfat 10% v/v dalam HCl 0,01 N.

Alat PenelitianAlat-alat gelas, bejana elektroforesis i-Mupid.J, incubator orbital shaker (LM-510R), vortex (Genie-2), pH meter (TOA),kolom (tipe C dimensi 1x20 cm, PharmaciaLKB Biotech), pompa (Perkin Elmer seri 200LC Pump), detektor (Perkin Elemer UV LV295), integrator (Perkin Elmer Nelson LCmodel 1022), ijektor (perkin Elmer oven

101), 96-well plate, ELISA Reader SLT 340ATC.

Langkah PenelitianIsolasi DNA plasmid pUC18

Seratus ìl bakteri Escherichia coliDH5á yang membawa plasmid pUC18 dalamgliserol 50% ditumbuhkan ke dalam 50 mlmedia LB cair yang mengandung ampisilin100 ìg/ml media kemudian diinkubasi dalamincubator orbital shaker pada suhu 37ºCselama semalam. Kultur hasil inkubasidisentrifugasi dengan kecepatan 2500xgselama 10 menit. Supernatan dibuang, pel-let disuspensikan dalam 1,25 ml larutan LisisI dingin dan digojog, didiamkan dalam esselama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 2,5ml larutan Lisis II yang dibuat baru(campuran NaOH 0,2 N dan SDS 2% samabanyak) dan digojog perlahan, didiamkandalam es selama 5 menit. Setelah ituditambahkan 1,875 ml larutan Lisis III dingindan digojog, didiamkan dalam es selama 5menit. Kemudian disentrifugasi dengankecepatan 3500xg selama 10 menit.Supernatan diambil, dipindahkan ke dalamtabung konikal steril, kedalamnyaditambahkan larutan pengekstraksi (terdiridari campuran fenol : kloroform :isoamilalkohol = 25:24:1) sama banyakdengan volume supernatan. Selanjutnyadivortex selama 1 menit kemudiandisentrigugasi dengan kecepatan 3500xgselama 10 menit. Fase cair paling atasdiambil, dipindahkan ke dalam tabungkonikal baru dan ditambah dengan kloroformsama banyak dengan volume supernatant,lalu divortex selama 1 menit dandisentrigugasi dengan kecepatan 3500xgselama 10 menit maka akan terbentuk duafase yaitu fase air dan fase kloroform. Faseair dipisahkan dan dipindahkan ke dalmeppendorf masing-masing 500 ìl. Kemudianmasing-masing eppendorf ditambahkan 50ìl natrium asetat 3M pH 4,8 (1/10 x volume)dan etanol absolute sebanyak 1,0 ml(2xvolume). Kemudian didiamkan pada suhu-20ºC. Setelah 1 jam disentrifugasi dengankecepatan 12.000xg selama 10 menit.Supernatan dibuang dan pelet dikeringkandalam blower suhu 37ºC selama 15 menit.Pelet yang telah dikeringkan dilarutkandalam larutan TE pH 7,4 dan disimpan padasuhu 4ºC semalam. Setelah itu dipindahkandan disimpan pada suhu -20ºC. DNA plas-mid yang diperoleh dicek dengan

elektroforesis dalam agarosa 0,8% b/v.Delapan ìl (16,8 ìg) DNA plasmid pUC18dan 2,0 ìl loading buffer dicampur dandimasukkan ke dalam sumuran agarosa.Elektroforesis dilakukan dengan kekuatan 50Volt selama 60 menit dengan menggunakanlarutan dapar TBE 0,5x. RNA dihilangkandengan cara ditambah RNAse 10 ìg/mlsebanyak 1/10 x volume DNA plasmidpUC18 dan diinkubasi pada 37ºC selama 1jam.

Ekstraksi dan fraksinasi protein daridaun Mirabilis jalapa L.

Daun Mirabilis jalapa L. dikumpulkansegar, dicuci bersih dengan air mengalir, laludipotong kecil-kecil. Sebanyak 60 gramditempatkan pada mortar steril, ditumbukhalus dengan penambahan 130 ml daparnatrium fosfat 5 mM pH 7,2 yangmengandung 0,14 M natrium klorida padasuhu 4ºC. Supernatan pada suhu 4ºCditambah ammonium sulfat dengankejenuhan 40% sambil diaduk dandidiamkan pada suhu 4ºC selama 2 jam.Larutan disentrifugasi 3500xg selama 10menit pada suhu 4ºC. Supernatan kemudianditambah lagi ammonium sulfat sehinggamencapai kejenuhan 80%, didiamkan selamasatu malam pada suhu 4ºC. Larutan itukemudian disentrifugasi pada 3500xg selama10 menit pada suhu 4ºC. Supernatan dibuangdan endapan dilarutkan dalam sedikitmungkin dapar natrium fosfat 5 mM pH 6,5.Selanjutnya dilakukan dialisis semalammenggunakan dapar natrium fosfat 5 mM pH6,5. Cairan dialisis diganti 3-4 kali kemudianhasil dialisis disentrifugasi 3500xg selama10 menit pada suhu 4ºC. Endapan dibuangdan supernatan merupakan sampel fraksiprotein.

Pemurnian protein dengan kolom CMSepharose CL-6B

Satu ml fraksi protein hasil dialisis(21,51 mg) diinjeksikan ke dalam kolomyang telah diekuilibrasi dan dielusi dengandapar natrium fosfat 5 mM pH 6,5 selama30 menit dengan kecepatan alir 0,8 ml/menit.Fraksi protein dikoleksi setiap 2 menit danditampung ke dalam eppendorf. Protein yangterikat pada fase diam dielusi dengan daparnatrium fosfat 5 mM pH 6,5 yangmengandung natrium klorida 0,5 M secarabergradien selama 90 menit. Fraksi-fraksiprotein yang ditampung diuji aktivitas

pemotongan DNA superkoil. Pengukurankadar protein total dilakukan dengan caramengambil sebanyak 20,0 ìl ekstrak gubal,fraksi protein 40% dan 80%, protein hasildialisis dan fraksi protein hasil kolom, danditambahkan dapar natrium fosfat 5 mM pH6,5 sampai volume 1,0 ml, kemudian diukurserapannya dengan spektrofotometer UVpada panjang gelombang 280 dan 260 nmmenggunakan blanko dapar natrium fosfat 5mM pH 6,5. Selanjutnya harga R280/260diekstrapolasikan pada tabel untukmengetahui besarnya faktor koreksi.Kadar protein total (mg/ml) = A280 x faktorkoreksi x faktor pengenceran

Uji aktivitas pemotongan DNA superkoilTiga ìl (6,3 ìg) DNA plasmid pUC18

dicampur dengan 2,5 ìl dapar TMN 10x pH8,0 dan fraksi protein dengan kadar tertentu,ditambahkan aqua destilata hingga volumeakhir 25,0 ìl, diinkubasi pada suhu 30ºCselama satu jam. Kemudian ditambahkan 2,0ìl dapar pemuat (loading buffer) dandielektroforesis menggunakan gel agarosa0,8% yang mengandung pewarna ethidiumbromida dengan kekuatan 50 Volt selama 80menit menggunakan dapar TBE 0,5x.Pengamatan dilakukan dibawah sinar UV.Uji sitotoksisitas menggunakan metodeMTT

Sel HeLa didistribusikan ke dalamsumuran dan diinkubasikan bersama fraksiprotein dengan satu seri kadar selama 24 jam.Pada akhir inkubasi, kepada masing-masingsumuran ditambahkan 10 ìl MTT 5 mg/mldalam medium RPMI. Kemudian diinkubasilagi selama 4 jam pada suhu 37ºC. Sel yanghidup akan bereaksi dengan MTTmembentuk warna ungu. Reaksi MTTdihentikan dengan pereaksi penghenti(stopper) sebanyak 100 ìl dan diinkubasikansemalam pada suhu kamar. Serapan dibacadengan ELISA reader pada panjanggelombang 550 nm.

Analisis DataPersentase kematian sel merupakan

selisih jumlah sel kontrol dengan jumlah selperlakuan dibagi dengan jumlah sel kontroldikalikan 100%

Hasil PenelitianProses ekstraksi daun segar L. dengan

natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yangmengandung 0,14 M natrium klorida pada

suhu 4ºC menghasilkan sekitar 155,5 mlekstrak gubal. Berdasarkan perhitungan,kadar protein ekstrak gubal yang diperolehsebesar 76,26 mg/ml sehingga jumlah proteintotal ekstrak gubal sebesar 11858,43 mg(19,76% protein dari 60 gram daun). Kadarprotein hasil pengendapan denganammonium sulfat sampai kejenuhan 40%sebesar 44,91 mg/ml sedangkan kadarprotein pada supernatan setelah penambahanammonium sulfat sampai kejenuhan 80%sebesar 8,9 mg/ml.

Kadar protein hasil dialisis sebesar12,51 mg/ml, volume sekitar 14 ml sehinggajumlah protein total sebesar 301,14 mg.Fraksi protein hasil dialisis selanjutnyadimurnikan dengan kromatografi penukar

7 8

Gambar 1. Profil elusi kromatografi dengan kolom CM Sepharose CL-6B, fraksi dikoleksi setiap 2menit. Daerah yang diarsir (fraksi 46-48) dan fraksi 50-52) menunjukkan aktivitas pemotongan DNAsuperkoil

kation menggunakan kolom CM SepharoseCL-6B dan fase gerak dapar natrium fosfat5 mM pH 6,5 selama 30 menit dengankecepatan alir 0,8 ml/menit dilanjutkan elusidengan dapar natrium fosfat 5 mM pH 6,5yang mengandung natrium klorida 0,5 Msecara bergradien selama 90 menit. Profilkromatogram ditunjukkan pada gambar 1.Fraksi protein yang terelusi dengan fasegerak dapar natrium fosfat 5 mM pH 6,5

selanjutnya disebut fraksi protein tidakterikat fase diam dan fraksi protein yangterelusi dengan fase gerak dapar natriumfosfat 5 mM pH 6,5 yang mengandungnatrium klorida 0,5 M secara bergradiendisebut fraksi protein terikat fase diam.

Fraksi protein yang keluar pada puncak yangsama pada kromatogram digabungkan. Darihasil penggabungan, diperoleh 3 fraksimayor yang tidak terikat fase diam dan 8fraksi mayor yang terikat fase diam.Terhadap fraksi-fraksi yang ditampungselanjutnya dilakukan uji aktivitaspemotongan DNA superkoil.

Berdasarkan hasil uji aktivitaspemotongan DNA superkoil, diperoleh 2fraksi mayor yang terikat pada fase diamyang menunjukkan aktivitas pemotonganDNA superkoil yaitu fraksi 7 dan fraksi 8seperti ditunjukkan pada gambar 2. Fraksi

Gambar 2. Elektroforegram hasil uji aktivitas pemotongan DNA superkoil fraksi protein hasil pemurniandengan kolom CM Sepharose CL-6B yang terikat fase diam. Pita 1: pita DNA superkoil, pita 2: pita DNAlinier, pita 3: pita DNA nicked circular, pita 4: pengotor. Lajur a: DNA plasmid pUC18 utuh (kontrolnegatif), b dan d: fraksi 7 (72 ģg), c dan e: fraksi 8 (72 ģg).

(A) (B) (C)

(i) (ii)

Gambar 3. Gambaran perubahan morfologi sel HeLa setelah diberi perlakuan dengan fraksi protein hasilpemurnian dengan kolom CM Sepharose CL-6B terikat fase diam yang memiliki aktivitas pemotonganDNA superkoil pada kultur sel HeLa dengan waktu inkubasi selama 24 jam (A) kontrol negatif, (B) kadarprotein 0,553 mg/mL, dan (C) kadar protein 0,004 mg/mL. (i) Sel mati, (ii) Sel hidup

protein tersebut terelusi dengan daparnatrium fosfat 5 mM pH 6,5 pada gradienNaCl 0,33-0,37 M. Selain itu juga diperoleh2 fraksi mayor yang tidak terikat pada fasediam yang menunjukkan aktivitaspemotongan DNA superkoil yaitu fraksi 2dan fraksi 3 (gambar tidak ditampilkan).

Selanjutnya dilakukan uji sitotoksisitasfraksi-fraksi protein yang diperoleh padakultur sel HeLa. Hasil uji sitotoksisitas fraksiprotein tersebut ditunjukkan pada Tabel 1.

Berdasarkan hasil uji sitotoksisitas

fraksi protein dari daun M. jalapa L padakultur sel HeLa dengan waktu inkubasi 24jam seperti ditunjukkan pada tabel 1, dapatdilihat bahwa persentase kematian sel HeLabaik pada fraksi protein dialysis, fraksiprotein tidak terikat fase diam dan fraksiprotein yang terikat pada fase diam yangterelusi dengan dapar natrium fosfat 5 mMpH 6,5 pada gradien NaCl 0,33-0,37 M tidakterlalu besar (kurang dari 50% kematian sel).

PembahasanBerdasarkan data hasil penelitian ini,

kadar protein tertinggi adalah pada ekstrakgubal yang disebabkan karena proteinnyamasih bercampur dan belum dipisah-pisahkan. Protein pada ekstrak gubaldipisahkan lebih lanjut dengan pengendapanmenggunakan ammonium sulfat, dilanjutkandengan dialysis dan pemisahan dengankromatografi penukar kation menggunakankolom CM Sepharose CL-6B dan fase gerakdapar natrium fosfat 5 mM pH 6,5 selama30 menit dengan kecepatan alir 0,8 ml/menitdilanjutkan elusi dengan dapar natrium fosfat5 mM pH 6,5 yang mengandung natriumklorida 0,5 M secara bergradien selama 90menit. Dari hasil uji aktivitas pemotonganDNA superkoil diketahui bahwa fraksi pro-tein terikat fase diam yang terelusi dengandapar natrium fosfat 5 mM pH 6,5 padagradien NaCl 0,33-0,37 M (fraksi 7 dan 8)menunjukkan aktivitas pemotongan DNAsuperkoil secara sempurna, dimana DNAsuperkoil berubah menjadi bentuk DNAlinier dan nicked circular. Data tersebutmenunjukkan bahwa fraksi protein 7 dan 8yang terikat fase diam memiliki aktivitasbiologis sejenis RIPs karena mampumemotong DNA superkoil untai gandamenjadi bentuk nicked circular dan linier.Barbieri et al. (1993) melaporkan bahwaRIPs tipe 1 dimurnikan dengan kromatografipenukar kation dengan fase diam derivateCM (carboxymethyl) atau sulfopropil karenaRIPs tipe 1 mempunyai titik isoelektrik (pI)pada daerah alkali, biasanya = 9,5. MAPyang merupakan RIPs tipe 1 memiliki titikisoelektrik 9,8 (Kubo et al., 1990). Olehkarena itu, pada pemurnian fraksi protein daridaun M. jalapa L. Menggunakan fase diamCM Sepharose CL-6B dan fase gerak daparnatrium fosfat 5 mM pH 6,5, protein-proteinyang mempunyai pI lebih besar daripada pHlarutan akan bermuatan positif. Denganadanya gugus karboksil pada CM Sepharose

CL-6B maka semua protein yang bermuatanpositif akan terikat pada fase diam yangbermuatan negatif tersebut. Sedangkan pro-tein-protein yang bermuatan negatif tidakakan berikatan dengan fase diam danlangsung terelusi keluar dari kolom.

Fraksi protein hasil pemurniantersebut selanjutnya diuji aktivitassitotoksiknya pada kultur sel HeLa denganwaktu inkubasi 24 jam. Data hasil ujisitotoksisitas pada sel HeLa sepertitercantum pada tabel 1 menunjukkan bahwapersentase kematian sel HeLa setelahpemberian fraksi protein relatif kecil yangmenunjukkan bahwa fraksi protein dialisis,fraksi protein tidak terikat fase diam danfraksi protein terikat fase diam dengan kadar0,553 mg/mL relatif tidak toksik terhadap selHeLa pada waktu inkubasi 24 jam. Diantaraketiga fraksi protein tersebut, fraksi proteinhasil pemurnian yang terikat pada fase diamdan terelusi pada gradien NaCl 0,33-0,37 Mdan 0,38-0,41 M menunjukkan aktivitassitotoksik paling tinggi dengan persentasekematian sel HeLa sebesar 29,23%. Hal inikemungkinan disebabkan karena fraksi inihanya mengandung protein yang benar-benaraktif. Gambaran morfologi sel Hela setelahpemberian fraksi protein terikat fase diamyang terelusi pada gradien NaCl 0,33-0,37M dan 0,38-0,41 M (gambar 3) menunjukkanbahwa pada pemberian protein dengan kadar0,553 dan 0,004 mg/mL populasi sel HeLayang hidup lebih sedikit dibandingkandengan kontrol negatif. Hal ini menunjukkanbahwa meskipun fraksi protein tersebutdengan kadar tertinggi 0,553 mg/mL relatiftidak toksik terhadap sel HeLa, tetapi terjadipenghambatan proliferasi sel HeLa.

Kesimpulan1. Fraksi protein yang memiliki aktivitas

sejenis RIPs, yang dimurnikan dari daunMirabilis jalapa L. dengan kromatografipenukar kation menggunakan kolom CMSepharose CL-6B, menggunakan fasegerak dapar natrium fosfat 5 mM pH 6,5selama 30 menit dengan kecepatan alir0,8 ml/menit dilanjutkan elusi dengandapar natrium fosfat 5 mM pH 6,5 yangmengandung natrium klorida 0,5 Msecara bergradien selama 90 menit,terelusi pada gradien natrium klorida0,33 - 0,37 M dan 0,38 - 0,41 M

2. Fraksi protein aktif sejenis RIPs hasilpemurnian dengan kolom CM Sepharose

CL-6B pada kadar 0,553 mg/ml, bersifatrelatif tidak toksik terhadap kultur selHeLa dengan persentase kematian selHeLa sebesar 29, 53%.

Pustaka

Barbieri, L., Batteli, M.G., Stirpe, F. (1993)Ribosome Inactivating Protein fromPlants, Biochem et Biophysica Acta,405-410

Elly, W. (2002) Efek Fraksi Protein yangDiisolasi dari Daun Mirabilis jalapaL. terhadap Proses Apoptosis padaSel HeLa, Skripsi, Fakultas FarmasiUniversitas Gadjah Mada,Yogyakarta

Habuka, N., Murakami (1991) Amino AcidSequence of MAP, Total Synthesisof Gene an Expressionin E. coli,Journal Biol. Chem, 264

Herawati, T. (2002) Pemurnian RibosomeInactivating Protein (RIP) dari DaunMirabilis jalapa L. Bunga Merahmenggunakan Kolom Sephacryl S-300 HR. Skripsi. Fakultas FarmasiUniversitas Gadjah Mada,Yogyakarta

Heyzer, E.G., Gan, Sulistia, Nafrialdi (1987)Antikanker, in Sulistia Gan et al.,Farmakologi dan Terapi, Edisi III,Fakultas Kedokteran UmumUniversitas Indonesia, Jakarta, 624-625

Kubo, S., Ikeda, T., Imaizumi, S., Takanami,Y., Mikami, Y., 1990, A Potent PlantVirus Inhibitor Found in Mirabilisjalapa L., Ann Phytopathol Soc Jpn,56, 481-487

Prasetyowati, A.T., 2002, Uji Aktivitas N-Glikosidase Daun Bunga PukulEmpat (Mirabilis jalapa L.) BungaMerah dari Hasil Pemurniandenagn Kromatografi Kolom CMSepharose, Skripsi, FakultasFarmasi Universitas Gadjah Mada,Yogyakarta

Sari, R.P., 2002, Efek Fraksi Protein SejenisRibosome Inactivating Proteins(RIP) yang Diisolasi dari AkarMirabilis jalapa L. terhadap ProsesKematian Sel Raji, Skripsi, FakultasFarmasi Universitas Gadjah Mada,Yogyakarta

Vivanco, J.M., Qurci, M., Salazai, L.F.,1999, Antiviral and Antiviroid

Activity of MAP-ContainingExtract from Mirabilis jalapa L.roots, Plant Dis, 83, 1116-1121