PEMISAHAN ASAM AMINO

Asam amino merupakan bagian stuktur protein dan menentukan banyak sifat

yang penting. Glisin mereupakan asam amino pertama yang telah diisolasi dari

hidrosilat protein, sedangkan treonin merupakan asam amino pembentuk potein yang

dapat diisolasi paling akhir yang berasal dari hidrosilat fibrin (Wirahadikusumah,

1989).

Pada asam amino terdapat tiga gugus yang reaktif yaitu gugus α-karboksil,

gugus α-amino, dan gugus rantai samping (R). Ketiga gugus ini dapat diidentifikasi

melalui uji spesifik, diantaranya adalah dengan uji ninhidrin, uji Edman, uji Sanger,

dan sebagainya. Selain menggunakan uji spesifik yang berdasarkan ciri khas reaksi

kimia asam amino, asam amino juga dapat diidentifikasi bahkan dapat dipisahkan

dengan menggunakan metode tertentu.

Beberapa metode analisis asam amino yang dapat digunakan untuk

identifikasi dan pemisahan asam amino adalah metode gravimetric, kalorimetri,

mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis. Salah satu metode yang banyak

memperoleh pengembangan ialah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi

ialah kromatografi kertas, krometografi lapis tipis dan kromatografi penukar ion

(Poedjiadi, 1994).

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan

distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase

diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Dari pengertian tersebut dapat

diketahui bahwa terdapat dua komponen penting dalam kromatografi yaitu fase diam

(padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).

Kromatografi melibatkan pemisahan terhadap campuran berdasarkan

perbedaan-perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawanya. Perbedaan yang dapat

dimanfaatkan meliputi kelarutan dalam berbagai pelarut serta sifat polar.

Kromatografi biasanya terdiri dari fase diam (fase stasioner) dan fase gerak (fase

mobile). Fase gerak membawa komponen suatu campuran melalui fase diam, dan fase

diam akan berikatan dengan komponen tersebut dengan afinitas yang berbeda-beda.

Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada perbedaan jenis fase, namun

semua jenis kromatografi tersebut berdasar pada asas yang sama. (Bresnick, 2004).

Fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting

dalam proses pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan

fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu

senyawa analit termasuk asam amino. Fase diam dapat berupa bahan padat atau

porous (berpori) dalam bentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan

pada padatan pendukung.

Fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit (asam amino), dapat

bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa

bahan cair dan dapat juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai

sebagai carrier gas senyawa mudah menguap (volatil).

Jenis kromatografi yang dapat digunakan untuk menganalisi asam amino

diantaranya adalah sebagai berikut:

a. Kromatografi partisi

Bila suatu zat terlarut didistribusi antara dua pelarut dengan volume

sama yang tidak dapat bercampur (immiscible), maka perbandingan

konsentrasi zat terlarut di dalam kedua pelarut tersebut dalam keadaan

keseimbangan. Perbandingan tersebut disebut koefisien partisi. Asam amino

dapat dipisahkan dengan cara partisi dengan menggunakan dua fase terlarut,

misalnya pasangan fenol-air atau n-butanol-air. Tiap asam amino mempunyai

koefisien partisi tertentu untuk pasangan terlarut tersebut (Wirahadikusumah,

1989).

Contoh kromatografi partisi adalah kromatografi kolom. Pada

kromatografi kolom, kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti pati

yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom.

Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel

diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fase gerak) ditambahkan tetes

demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang

turun ke bawah (fasa gerak) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fase

diam).

Berdasarkan koefisian partisinya, asam amino yang terdapat dalam

campuran bergerak melalui pipa kolom (tabung gela) ke bawah dengan

kecepatan yang berbeda-beda. Larutan yang keluar dari bagian bawah pipa

kolom disebut eluat. Larutan ini selanjutnya ditampung dalam fraksi-fraksi

kecil dengan alat pengumpul fraksi otomatik dan kemudian dianalisa dengan

menggunakan periaksi ninhidrin secara kuantitatif (Wirahadikusumah, 1989).

Reaksi ninhidrin digunakan untuk mendeteksi dan menduga asam

amino secara kuantitatif dalam jumlah kecil. Pemanasan dengan ninhidrin

berlebih menghasilkan produk berwarna ungu pada semua asam amino yang

mempunyai gugus α-amino bebas, sedangkan produk yang dihasilkan oleh

protein berwarna kuning, karena pada molekul ini terjadi substitusi gugus α-

amino. Pada kondisi yang sesuai intensits warna yang dihasilkan dapat

dipergunakan untuk mengukur asam amino secara kolorimetrik. Metode ini

amat sensitif bagi pengukuran konsentrasi asam amino (Lehninger, 1982).

Jumlah asam amino dalam setiap tabung fraksi akan memperlihatkan

suatu deret puncak-puncak (peaks) yang masing-masing sesuai dengan jenis

asam amino yang terdapat dalam campuran tersebut.

Penentuan macam asam amino dapat pula dilakukan dengan

menghitun harga Rf asam amino yang terdapat pada tabel yang ada (Poedjiadi,

1994).

b. Kromatografi kertas

Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama

dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi

kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis

dioleskan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian

dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut (fase gerak) yang dapat berupa

air, etanol, atau asam asetat.

Pengguaan kromatografi kertas dalam analisa asam amino dapat

memperoleh hasil yang akurat karena asam amino memiliki sifat yang sangat

mirip dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak

mungkin didistilasi). Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas

secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa

mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung

berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan.

Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai

R, masing-masing asam amino diidentifikasi.

c. Kromatografi HPLC (High Precision Liquid Chromatography Atau High

Performance Liquid Chromatography)

Prinsip dari kerja HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam

sampel berdasarkan kepolarannya, untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif)

dan di hitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut

(kuntitatif). Alatnya terdiri dari kolom sebagai fase diam dan larutan tertentu

sebagai fase geraknya.  Luas puncak kromatografi pada kurva elusi

dipengaruhi oleh tiga proses perpindahan massa yaitu difusi Eddy, difusi

longitudinal, dan transfer massa tidak seimbang. Sedangakan parameter-

parameter yang menentukan berlangsungnya proses-proses tersebut adalah:

laju aliran, ukuran partikel, laju difusi, dan ketebalan stasioner.

d. Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapis tipis mengggunakan cara tetesan campuran asam

amino diibaratkan bergerak melalui suatu lapisan tipis zat penyerap yang

didekatkan pada suatu kaca. Pemisahan didasarkan padaperbedaan kecepatan

gerakan masing-masing asam amino dalam larutan dapat (buffer) dengan pH

tertentu (Wirahadikusumah, 1989).

Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan olen Egan Stahl

dengan menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan

lapisan tipis. KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat juga

merupakan kromatografi partisi karena bahan penyerap telah dilapisi air dari

udara. Sebagian besar dasar teori kromatografi kolom juga dapat diterapkan

pada KLT. Teknik kromatografi lapis tipis mempunyai kelebihan, yaitu dapat

dilakukan proses identifikasi lebih lanjut, dengan mengeruk silika gel (noda

larutan contoh), kemudian dilanjutkan dengan identifikasi menggunakan

teknik kromatografi kolom.

METODE PERCOBAAN

Bahan

Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah  Eluen (n-butanol : asam

asetat : air = 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v, larutan penyemprot ninhidrin  2%, aseton, dan larutan

asam amino (arginin, glisin, histidin, dan sampel x yaitu campuran dari arginin, glisin

dan alanin).

Alat

Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah palat kromatografi lapis tipis

(KLT), chamber, botol semprot, pipa kapiler, pipet skala, oven, penggaris, pensil, dan

pinset.

Prosedur kerja

            Larutan eulen disiapkan dengan cara mencampurkan n-butanol, asam asetat,

air dengan perbandingan 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v yang kemudian dimasukkan ke dalam

chamber. Chamber yang telah diisi dengan larutan eulen kemudian ditutup rapat

dengan plaster bening. Sementara chamber dibiarkan sampai jenuh dengan eulen,

kertas kromatografi disiapkan, digunting sesuai dengan keperluan. Kertas

kromatografi diberi garis dengan menggunakan pensil dengan jarak 1 cm dari atas

dan bawah garis, kemudian pada garis bagian bawah, dibuat titik sebanyak 4. Setelah

itu, kertas kromatografi dimasukkan ke dalam oven.

            Kertas yang telah dipanaskan kemudian diberi totolan larutan asam amino

(arginin, lisin, histidin, dan sampel x). Pentotolan dilakukan dengan menggunakan

pipa kapiler yang dicelupkan ke dalam larutan asam amino kemudian ditandai pada

bagian yang telah diberi titik, setelah itu pipa kapiler tersebut dicuci dengan

menggunakan larutan aseton untuk kemudian digunakan kembali. Setelah semua titik

telah di totol dengan asam amino, kertas kromatografi dimasukkan ke dalam chamber

yang sudah jenuh dengan eulen. Totolan contoh tidak boleh tercelup dalam eulen.

Elusi dihentikan setelah eulen menempuh jarak yang telah ditentukan sebelumnya

dengan menggunakan pensil. Kemudian plat dikeluarkan dan dikeringkan pada suhu

kamar. Setelah itu, dengan hati-hati kertas disemprot dengan larutan ninhidrin,

kemudian kertas dikeringkan dengan dimasukkan ke dalam oven. Setelah kering akan

muncul noda dan pada noda yang timbul diberi lingkaran pensil lalu diukur jaraknya

dengan menggunakan penggaris.

CARA MEMPEROLEH UNSUR LOGAM

Secara umum menurut cara yang di lakukan pada waktu ini , ada 4 (empat)

tahap pengerjaan untuk menghasilkan sebagian besar jenis logam yaitu :

1. Penggalian bijih logam.

Pada penggalian bijih, umumnya ada dua cara yaitu: Penambangan

terbuka dan Penambangan tertutup / penambangan di bawah permukaan

tanah.

2. penyiapan bijih, untuk diambil logam dari bijih.

Pada proses penyiapan bijih besi/logam, bijih dihancurkan, sebagian

kotoran yang terdapat pada bijih dibuang dengan menggunakan cara

pemisahan memakai alat-alat berat . Penyiapan bijih juga mencakup proses

pembakaran atau kalsinasi, misalnya pada bijih yang mengandung senyawa

sulfide, pembakaran untuk menghilangkan belerang dari bijih besi yang

mengandung senyawa karbonat.

3. Ektraksi atau mengeluarkan / memisahkan logam dari bijih.

Pemisahan dilakukan dengan ekstraksi, yaitu dengan melalui proses

proses kimia sehingga diperoleh logamnya. Proses ekstraksi ada 2 macam,

yaitu:

1. Proses Pirometalurgy. Bijih dipanaskan di dalam tungku tiup (blast

furnace) atau tungku gema sehingga meleleh, kemudian dilakukan

pemisahan untuk mendapatkan logam dari lelehan tersebut.

2. Proses Elektrometalurgy. Bijih dipisahkan logamnya dengan cara

meleburnya di dalam tungku listrik atau dengan proses elektrolistrik.

4. Pemurnian dan pengolahan logam.

Pemurnian dan pengolahan logam. Logam hasil ekstraksi umumnya

masih mengandung benda atau elemen lain, sehingga perlu dilakukan

pemisahan lebih lanjut. Proses pemurnian dan pengolahan dilakukan dengan

cara oksidasi dengan proses panas dalam tungku, pencairan, destilasi (seng),

elektrolisa (tembaga) atau dengan memakai bahan pengikat kimia

( menambah Mn ke dalam baja cair)