PRAKTIKUM VI

PEMERIKSAAN DIREK COOMB’S TEST

Hari,tanggal praktikum : Senin, 20 Mei 2013

Tempat : Unit Transfusi Darah RSUP Sanglah

I. TUJUAN

- Menetapkan ada atau tidak adanya antibodi yang coated atau menempel

pada sel darah merah pasien

II. METODE

Metode yang digunakan pada praktikum ini adalah Aglutinasi langsung

(Direct agutimation)

III. PRINSIP

Anti Human Globulin (AHG) yang diperoleh dari immunized non

human species berikatan dengan IgG atau komplemen yang bebas pada

serum atau yang melekat pada antigen sel darah merah. Antigen yang sudah

coated dengan antibody in vivo + anti human globulin membentuk

aglutinasi.

IV. DASAR TEORI

4.1 Darah

Darah adalah jaringan cair yang terdiri atas dua bagian yaitu plasma

darah dan sel darah. Sel darah terdiri dari tiga jenis yaitu eritrosit, leukosit

dan trombosit. Volume darah secara keseluruhan adalah satu per dua belas

berat badan atau kira-kira lima liter. Sekitar 55% adalah plasma darah,

sedang 45% sisanya terdiri dari sel darah Darah kita mengandung beberapa

jenis sel yang terangkut di dalam cairan kuning yang disebut plasma darah.

Plasma darah tersusun atas 90% air yang mengandung sari makanan,

protein, hormon, dan endapan kotoran selain sel-sel darah. ( Evelyn C.

Pearce, 2006)

Ada tiga jenis sel darah, yaitu sel darah merah (eritrosit), sel darah putih

(leukosit), dan keping darah (trombosit).

4.2 Sel Darah Merah Sel darah merah berbentuk piringan pipih yang

menyerupai donat. 45% darah tersusun atas sel darah merah yang

dihasilkan di sumsum tulang. Dalam setiap 1 cm kubik darah terdapat

5,5 juta sel. Jumlah sel darah merah yang diproduksi setiap hari

mencapai 200.000 biliun, rata-rata umurnya hanya 120 hari. Semakin

tua semakin rapuh, kehilangan bentuk, dan ukurannya menyusut

menjadi sepertiga ukuran mula-mula.Sel darah merah mengandung

hemoglobin yang kaya akan zat besi. Warnanya yang merah cerah

disebabkan oleh oksigen yang diserap dari paru-paru. Pada saat darah

mengalir ke seluruh tubuh, hemoglobin melepaskan oksigen ke sel dan

mengikat karbon dioksida. Sel darah merah yang tua akhirnya akan

pecah menjadi partikel-partikel kecil di dalam hati dan limpa. Sebagian

besar sel yang tua dihancurkan oleh limpa dan yang lolos dihancurkan

oleh hati. Hati menyimpan kandungan zat besi dari hemoglobin yang

kemudian diangkut oleh darah ke sumsum tulang untuk membentuk sel

darah merah yang baru. Persediaan sel darah merah di dalam tubuh

diperbarui setiap empat bulan sekali.4.3 Antiglobulin TestPada tahun

1945 Mourant, Coombs dan Race menemukan pemeriksaan untuk

mendeteksi antibodi yang tidak beraglutinasi atau antibodi yang

menyelimuti sel daah merah dalam serum.Pemeriksaan yang sama

dilakukan juga untuk mendeteksi atau memperlihatkan penyelubungan

(coating) sel darah merah invivo dengan antibodi dan komplemen

dengan melakukan pemeriksaan antiglobulin test.Antiglobulin test ada

dua bentuk, yaitu :Direk antiglobulin Test (DAT) atau disebut juga

Direct Coombs Test (DCT)

- Indirect Antiglobulin Test (IAT) atau disebut Indirect Coombs Test

(ICT)

- Direct Antiglobulin Test

Direk Antiglobulin Test (DAT) untuk mendeteksi antibodi atau

komplemen yang menyelubungi sel darah merah Invivo dengan

menggunakan AHG, terutama IgG dan V3d. Setelah sel darah

merah dicuci dengan saline (NaCl 0,9 %) kemudian

ditambahkan reagen AHG. Pemeriksaan ini berguna untuk

mendeteksi penyakit autoimun Hemolitik Anemia (AIHA),

reaksi imun oleh karena reaksi transfusi.

- Indirect Antiglobulin Test

Untuk mendeteksi reaksi antara sel darah merah dengan antibodi

atau komplemen yang melekat/menyelubungi pada sel darah

merah invitro. Serum pasien diinkubasikan pada sel darah merah

lalu sel darah merah dicuci dengan saline dan ditambahkan

AHG. Aglutinasi setelah penambahan AHG memiliki makna

bahwa serum mengandung antibodi yang reaktif dengan antigen

pada sel darah merah. Pemeriksaan ICT dapat digunakan pada

pemeriksaan skrining identifikasi antibodi dan uji silang serasi.

Molekul antibodi dan komponen komplemen adalah globulin. Antibodi

adalah globulin γ, komplemen adalah globulin β. Bila globulin manusia

diinjeksikan ke hewan akan terbentuk antihuman globulin (AHG). AHG

akan bereaksi dg globulin yg terikat pada eritrosit sehingga menghasilkan

aglutinasi eritrosit. Bila AHG bereaksi dg globulin bebas dalam serum maka

tidak terjadi aglutinasi eritrosit. Perlu proses pencucian eritrosit untuk

menghilangkan globulin bebas. Reagen AHG dapat polispesifik atau

monospesifik. Polispesifik AHG mengandung antibodi terhadap human IgG

atau C3d, kadang-kadang juga mengandung anti komplemen lain dan anti

imunoglobulin lain. Monospesifik AHG mengandung hanya satu antibodi

apakah IgG saja atau anti C3b-C3d. Antiglobulin test mampu mendeteksi

150 sampai 500 molekul IgG tiap sel darah merah. Aglutinasi lengkap

terjadi bila sel tersensitisasi oleh 1000 molekul IgG. Pada IAT, hasil reaksi

positif bila terdapat 100 sampai 200 molekul IgG atau C3 pada sel. Bila

pengikatan globulin pada eritrosit (sensitisasi) terjadi in vivo disebut uji

antiglobulin direk (Direct Coomb’s test). Bila sensitisasi dilakukan in-vitro

disebut uji antiglobulin indirek (Indirect Coomb’s test).

DAT digunakan untuk mendeteksi antibodi atau komplemen yang

menyelubungi sel darah merah invivo dengan menggunakan AHG, terutama

IgG dan C3d. Setelah sel darah merah dicuci dengan saline kemudian

ditambahkan reagen AHG. Pemeriksaan ini berguna untuk mendeteksi ,

misalnya penyakit auto immune hemolytic anemia (AIHA), drug induced

hemolisis, allo imun reaksi oleh karena reaksi tranfusi.

Indirect Antiglobulin test (IAT) atau ICT digunakan untuk mendeteksi

reaksi antara sel darah merah dengan antibodi atau komplemen yang

melekat / menyelubungi pada sel darah merah invitro. Serum pasien

diinkubasikan dengan sel darah merah, kemudian sel darah merah dicuci

dengan saline dan ditambah AHG. Adanya aglutinasi setelah penambahan

AHG menandakan, bahwa serum tersebut mengandung antibodi yang reaktif

dengan antigen – antigen yang terdapat pada sel darah merah. Pemeriksaan

ICT dapat digunakan pada pemeriksaan skrining, identifikasi antibody dan

uji silang serasi.

Direct Antoglobulin Test (DAT) merupakan suatu test yang digunakan

untuk mencari adanya globulin manusia pada permukaan sel-sel yang telah

disensitasi.Sel yang tersensitasi merupakan sel yang diselubungi oleh

antibodi tetapi bukan teraglutinasi.Antibodi IgG tidak mengakibatkan

aglutinasi sel-sel darah merah yang mempunyai antigen pasangannya bila

berada dalam larutan fisiologis NaCl . akan tetapi hanya mampu

menyelubungi atau mensensitasi . Masa hidup immunoglobulin IgG sekitar

60-70 hari. DAT(Direct Antiglobulin Test) digunakan untuk mendeteksi

antibodi atau komplemen yang menyelubungi pada sel darah merah invivo

dengan menggunakan AHG terutama IgG dan C3d . Setelah sel darah merah

dicuci dengan saline kemudian ditambahkan dengan reagen AHG . Anti

Human Globulin (Bovine Albumin22%) digunakan sebagai reagen untuk

mereaksikan kelompok darah yang secara spesifik bereaksi dengan globulin

manusia.Bila AHG bereaksi dengan globulin bebas dalam serum maka tidak

menimbulkan aglutinasi eritrosit .Perlu proses pencucian eritrosit untuk

menghilangkan globulin bebas. Antiglobulin test mampu mendeteksi 150

sampai 500 molekul IgG tiap sel darah merah .Aglutinasi lengkap terjadi

bila sel tersensitisasi oleh 1000 molekul IgG. Pada DAT deteksi globulin

sampai terikat, komponen darah yang diuji adalah eritrosit, sensitisasi terjadi

didalam in-vivo, inkubasi dengan suspensi eritrosit menghasilkan nilai

negatif, hasil positif ditunjukkan dengan aglutinasi .

Pemeriksaan ini berguna untuk mendeteksi misalnya penyakit Auto

Immune Hemolytic Anemia (AIHA),drug induced hemolysis, allo imun

reaksi oleh karena reaksi tranfusi.Jenis reagen yang digunakan dalam

pemeriksaan ini adalah polyspesifik AHG yang mengandung antibodi

terhadap IgG manusia dan anti komplemen C3d dari komplemen

manusia .Selain mengandung anti-IgG dan anti-C4d.Anti bodi yang

mempunyai arti klinis yang terpenting adalah dari AHG yang mendeteksi

adanya IgG. Reagen ini disiapkan dan distandarisasi untuk mendeteksi

berbagai macam IgG antibodi. Aktivitas Anti-C3d sangat penting artinya

untuk pemeriksaan DCT pada pemeriksaan AIHA karena kemungkinan C3d

merupakan globulin satu-satunya yang dapat dideteksi pada sel darah merah

penderita AIHA.(Anonim,2011)

V. ALAT DAN BAHAN

A. Alat

1. Centrifuge

2. Rak tabung

3. Tabung reaksi uk. 12 x 75 mm

4. Pipet pasteur 1ml

5. Labu semprot

6. Gelas pembilas

B. Bahan

1. Suspensi cell 5 %

C. Reagensia

1. Anti human globulin/coombs serum

2. Coombs control cells

VI. CARA KERJA

A. Persiapan reagensia

1. Reagen dibiarkan pada suhu kamar

2. Tanggal kadaluarsa dan bantch no (lot. No) dicatat

B. Pemeriksaan Direk Coomb’s tes

1. Alat dan bahan disiapkan

2. Tabung reaksi diberi identitas tabung I dan tabung II

3. Masing-masing tabung ditambahkan 1 tetes suspensi sel 5 % darah

pasien

4. Dicuci 3 kali lalu dicentrifuge pada kecepatan 3000 rpm selama 1

menit

5. Supernatannya dibuang

6. Kedalam tabung I ditambahkan 2 tetes coomb’s serum

7. Ke dalam tabung II ditambahkan 2 tetes saline

8. Diputar pada kecepatan 3000 rpm selama 15 detik

9. Hasilnya dibaca terhadap adanya aglutinasi

C. Uji validitas

Bila hasil drect coomb’s test negatif, dilakukan uji validitas

1. Tabung yang memberi hasil negatif, ditambahkan 2 tetes coomb’s

control cell

2. Dicentrifuge pada kecepatan 3000 rpm selama 15 detik

3. Bila terjadi aglutinasi hasil yang diperoleh berarti valid.

No Gambar Keterangan

1 Bahan yang digunakan dalam uji Coomb tesUrutan bahan →1 : Coomb’s Serum2 : Suspensi sel 5% pasien 3 : Coomb’s Control Cell (CCC)4 : Saline dalam tabung reaksi

2

Hasil aglutinasi pada tabung I dan II. Tabung I- Berisi suspensi sel 5% pasien +

Coomb’s serum- Tidak tampak adanya aglutinasi

pada tabung- Maka dilanjutkan dengan

penambahan CCCTabung II- Berisi suspensi sel 5% pasien +

saline- Tidak tampak adanya aglutinasi

pada tabung

VII. HASIL PENGAMATAN

VIII. PEMBAHASAN

1 2 3 4

Tabung II

Tidak ada aglutinasi

Tabung I

Tidak ada aglutinasi

Transfusi darah merupakan tindakan medis yang beresiko, karena

itu pengelolaannya harus profesional dan sesuai standar. Melakukan

transfusi bukannya tanpa resiko. Pasien dapat tertular penyakit infeksi

yang mungkin terdapat pada darah donor, karena itu darah yang akan

digunakan untuk transfusi haruslah aman.

Darah aman apabila disumbangkan oleh donor yang sehat melalui

seleksi donor yang seksama, Bebas dari agent yang dapat

membahayakan pasien, Ditransfusikan hanya jika dibutuhkan dan

ditujukan untuk kesehatan dan kebaikan pasien. Keamanan darah

adalah dari vena ke vena

Antihuman globulin test suatu tes in vitro untuk menetapkan ada

atau tidaknya eritrosit yang coated oleh antibodi. Coomb’s serum atau

antihuman globulin serum, sesuai dengan namanya akan bereaksi

dengan globulin manusia (human globulin). antihuman globulin

(AHG) yang diperoleh dari immunized nonhuman species berikatan

dengan IgG atau komplemen yang bebas pada serum atau yang

melekat pada antigen sel darah merah.

Direct Coomb’s Test bertujuan untuk mendeteksi sel darah merah

yang tersensitisasi dengan antibodi / komplemen in vivo (dalam tubuh

pasien ). Kegunaan : pada kasus AIHA ( Auto Immune Hemolytic

Anemia), Drug induced hemolysis, HDN ( Hemolytic Disease of the

Newborn), Alloimmunisasi akibat transfusi / hemolytic transfusion

reaction (HTR). Prinsipnya yaitu antigen yang sudah coated dengan

antibodi in vivo ditambahkan dengan anti human globulin akan

menghasilkan aglutinasi. Metoda yang digunakan adalah metode

aglutinasi langsung. Sampel yang digunakan sampel darah dengan

antikoagulan lebih disukai karena mudah mendapatkan sel bebas,

mencegah sensitisasi invitro oleh komplemen. Reagensia yang

digunakan yaitu Antihuman globulin (coomb’s serum), anti-IgG, anti-

C3d, saline, dan CCC.

Pada praktikum kali ini menggunakan sel darah merah pasien,

didapatkan hasil negatif ditandai dengan tidak adanya aglutinasi, ini

menunjukkan tidak ada antibodi yang menempel pada sel darah merah.

Pencucian dengan salin volume 20 kali, min 3 kali untuk

membersihkan sisa antibodi yang dapat menetralisasi serum antihuman

globulin sehingga dapat menimbulkan reaksi negatif palsu.

Karena hasil direct coomb test menghasilkan hasil negatif, maka

perlu dilakukan uji validasi dengan menggunakan CCC. Coomb’s

Control Cell merupakan eritrosit normal (O Rh+) yang sengaja dibuat

coated dengan incomplete antibodi. Dibuat sedemikian rupa coatednya

dan memberikan hasil 1+ sampai 2+ bila CCC direaksikan dengan

Coomb’s serum yang dipakai sehingga pada uji validasi dengan CCC

harus didapatkan hasil positif aglutinasi jika didapatkan hasil negatif

berarti coomb serum tidak valid dan serta tes dianggap invalid. Pada

praktikum ini, uji validasi menggunakan CCC didapatkan hasil positif

aglutinasi sehingga test yang dilakukan valid.

VII. KESIMPULAN

Dari Praktikum Direct Coombs Test pada sampel sel darah merah Mr.

X diperoleh hasil positif yang ditandai dengan terbentuknya aglutinasi.