Pada percobaan ini dilakukan pewarnaan spora. Pewarnaan spora ini sangat

penting dalam pembelajaran mikrobiologi di farmasi, karena tidak semua bakteri

mampu membentuk spora sehingga adanya spora dapat dijadikan indikator untuk

jenis bakteri tertentu, selain itu lokasi spora membantu identifikasi berbagai

spesies bakteri. Spora bakteri berfungsi sebagai mekanisme pertahanan dari

lingkungan yang ekstrim. Bakteri yang dapat membentuk spora berasal dari

bakteri Gram Positif, seperti dari genus Bacillus, Clostridium.

Dalam pengamatan kali ini digunakan bakteri bacillus subtilis sebagai sample,

karena Bacillus subtilis  mempunyai kemampuan untuk membentuk endospora

yang protektif yang memberi kemampuan bakteri tersebut mentolerir keadaan

yang ekstrim. Bacillus subtilis juga merupakan flora normal yang ada di sistem

pencernaan manusia dan menghasilkan enzim proteolytic yaitu subtilisin. Dalam

jumlah normal bakteri ini tidak akan memberikan efek yang serius bagi tubuh

manusia, tetapi dalam jumlah banyak dapat menyebabkan gastroenteritis.

Baccillus subtilis merupakan jenis kelompok bakteri termofilik yang dapat

tumbuh pada kisaran suhu 45 °C  –  55 °C dan mempunyai pertumbuhan suhu

optimum pada suhu 60 °C  –  80 °. Bacillus subtilis selnya berbentuk basil, ada

yang tebal dan yang tipis. Biasanya bentuk rantai atau terpisah. Semua

membentuk endospora yang berbentuk bulat dan oval.

Ada beberapa metode yang digunakan untuk pewarnaan spora, diantaranya Untuk

metode pewarnaan spora ini digunakan biakan yang tua (sekitar 72 jam) karena

Spora umumnya tidak terdapat pada kultur muda dan menjadi banyak pada kultur

yang tua. Pembentukkan spora segera terjadi pada kondisi lingkungan yangtidak

menguntungkan. Spora sangat tahan panas, kekeringan, radiasi, desinfektan

dan pembekuan untuk jangka waktu yang lama.

Didalam suspensi bakteri ditambah karbol fukhsin sebanyak 1:1, hal ini

merupakan bagian dari tahap pewarnaan spora. Pada tahap pewarnaan ini

dilakukan pemanasan supaya zat warna dapat menembus dinding spora. Larutan

ini memberi warna biru. Endospora sukar menyerap zat warna, tetapi sekali diberi

zat warna, warna tersebutsulit dilunturkan. Dalam praktikum pewarnaan spora

pada bakteri Bacillus subtilis setelah diberi warna merah menggunakan karbol

fukhsin dilakukan pemanasan selama 10 menit pada suhu 800C dalam kondisi

tersebut, lingkungan akan merugikan sel bakteri karena dapat mematikan bakteri,

pada kondisi seperti itu bakteri akan membentuk spora untuk melindungi dirinya

dari kondisi lingkungan yang merugikan. Selain itu pemanasan ini ditujukan

untuk membantu masuknya pewarna menembus kulit spora yang tebal, dengan

adanya pemanasan pori- pori membesar , spora meregang dan zat warna dapat

masuk dengan mudah. Pewarna pertama untuk spora belum tentu karbolfuksin

yang berwarna merah, bisa juga menggunakan pewarna lain, missal malachite

green yang berwarna hijau, tapi proses tetap diikuti dengan pemanasan. Karbol

fukhsin segera masuk ke dalam spora dan spora yang telah terpisah dari sel

vegetatif akhirnya terlihat berwarna hijau pada perbesaran dengan mikroskop.

Selanjutnya karena spora telah terpisah dari sel vegetatif dan berwarna oleh karbol

fukhsin, maka sel vegetatif terakhir terlihat berwarna biru karena warna yang

terserap adalah warna biru dari metilen biru yang terakhir diberikan dan dibiarkan

1 menit, dibilas dan dikeringkan.

Pembilasan dengan H2SO4 akan melunturkan warna karbol fukhsin dari sel

vegetatif. H2SO4 berfungsisebagai agen dekolorisasi sel. Pewarna kedua yaitu

metilen biru yang bersifat. Larutan ini digunakan untuk mewarnai sel vegetatif

sehingga timbul warna biru, warna ini tidak mempengaruhi warna merah dari

spora. Spora tahan proses pewarnaan biasa, hal ini karena dinding spora lebih

bersifat impermeabel dan spora mengandung sangat sedikit air, tetapi beberapa

pewarnaan biasa dapat dipaksa masuk ke dalam spora dengan cara pemanasan

(melalui pori-pori spora zat warna dapat masuk). Sekali spora menyerap zat warna

maka spora tidak mudah didekolorisasi (penghilangan warna),sedangkan zat

warna dapat dengan mudah dicuci dari sel vegetatif. Karena itu saat olesan dicuci

dan diberi pewarna tandingan dengan zat warna kedua, spora akan tetap

mempertahankan pewarna pertama dan sel vegetatif akan menunjukkan pewarna

dari pewarna kedua. Larutan pewarna dari pewarna gram tidak akan mewarnai

spora dan akibatnya spora memiliki warna yang berbeda dari sel vegetatifnya.

Pada pengecatan spora metode Klein dapat dilihat bahwa bagian yang berwarna

biru merupakan sel bakteri itu sendiri karena bakteri pertama diberi zat warna

fuchsin setelah difiksasi. Sedangkan ada bintik-bintik kecil yang berwarna merah,

itulah yang disebut sebagai spora bakteri..

Dari hasil pengamatan di atas dapat diketahui juga jenis spora dari bakteri

Bacillus subtilis, yaitu endospora karena berupa tubuh berdinding tebal, sangat

refraktif, dan sangat resisten. Jika kita lihat, spora bakteri (bintik-bintik berwarna

merah) terdapat pada ujung dari sel vegetative bakteri, sehingga berdasarkan letak

sporanya dapt dikategorikan sebagai spora terminal, yaitu spora yang dibentuk di

ujung sel bakteri.