Pada praktikum kali ini, telah dilakukan percobaan mengenai isolasi DNA plasmid

yang bertujuan untuk memahami metode isolasi DNA plasmid dari sel prokariot berupa

bakteri gram negatif menggunakan GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit. Bakteri yang

digunakan adalah bakteri Escherichia coli yang mengandung plasmid PET-DUET yang telah

disisipkan resistensi ampisilin. Antibiotik ampisillin termasuk golongan antibitotik beta

laktam, cara kerjanya adalah menghentikan perkembangbiakan bakteri dengan menghalangi

bakteri dari pembentukan dinding yang mengelilingi mereka. Dinding dibutuhkan untuk

melindungi bakteri dari lingkungan dan untuk menjaga isi sel. Ampisilin juga menghambat

pertumbuhan bakteri dengan berikatan dengan enzim DD-transpeptidase sebagai inhibitor

kompetitif yang memperantarai dinding peptidoglikan bakteri, sehingga dengan demikian

akan melemahkan dinding sel bakteri Hal ini mengakibatkan sitolisis karena

ketidakseimbangan tekanan osmotis, serta pengaktifan hidrolase dan autolysins yang

mencerna dinding peptidoglikan yang sudah terbentuk sebelumnya. Metode yang digunakan

pada isolasi DNA plasmid ini adalah metode alkali lisis atau lisis basa. Lisis basa adalah

perusakan sel pada pH tinggi dengan SDS (Sodium Dodesil Sulfat), diikuti dengan pelepasan

DNA plasmid, denaturasimaterial dinding sel, dan protein-protein lain.

Prosedur isolasi diawali dengan kultivasi bakteri yang mengandung plasmid yang

akan diisolasi. Umumnya bakteri dikultur selama 12-16 jam pada media Luria-Bertani broth.

Media LB cair steril media LB terdiri dari beef extract, peptone dan lactose. Kegunaan atau

manfaat dari masing-masing komponen pada lactose broth yaitu peptone dan beef extract

merupakan sumber nutrisi esensial untuk metabolisme bakteri. Sedangkan fungsi dari laktosa

yaitu sumber karbohidrat untuk bakteri melakukan fermentasi. Bakteri Escherichia coli

sangat cocok dan dapat tumbuh baik dalam media ini. Pada umur tersebut, pertumbuhan

bakteri masih berada dalam fase eksponensial. Kultivasi yaitu memberikan kesempatan bagi

bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam

jumlah banyak. Pemanenan sel dilakukan dengan sentrifugasi. 1000 µL suspensi bakteri

dimasukkan kedalam 2 eppendorf dengan menggunakan mikropipet kemudian di sentrifugasi

pada 6800g selama 2 menit. Gaya sentrifugal yang ada akan memisahkan massa sel bakteri

yang berbentuk padat dari cairan media pertumbuhan. Massa sel akan terendapkan pada dasar

tabung sebagai pelet. Untuk memperoleh DNA plasmid dalam jumlah yang tinggi, kultur

bakteri yang digunakan dalam isolasi plasmid haruslah yang berada dalam fase logaritmik

akhir atau awal fase stasioner. Setelah disentrifugasi, supernatannya dibuang kemudian

dimasukkan 1mL ddH2O pada salah satu eppendorf, di pipeting kemudian dijadikan satu

dengan pellet yang ada pada eppendorf kedua kemudian di pipeting lagi agar campuran

menjadi homogen. ddH2O atau disebut juga aqua bidestillata atau ultrapure water, adalah air

yang sangat murni, lebih murni dari aquadest atau pun air reverse osmosis karena telah

melalui berbagai macam cara pemurnian, Secara umum ddH2O dibuat dengan melewatkan

aquadest ke dalam suatu cartridge berisi resin-resin filter dan deionisasi untuk

menghilangkan ion-ion dari air, hingga diperoleh nilai hantaran listrik yang sangat kecil

(sekitar 5.5 × 10−6 S·m−1 atau 18 MΩ cm), terakhir air tersebut dilewatkan melalui filter

membran dengan pori-pori 0.22 µl. Biasanya ddH2O tidak perlu disterilkan lagi

menggunakan autoclave. Pada praktikum ini dd H2O digunakan untuk pencucian sel yang

sedang di panen agar terbebas dari kontaminan.

Kemudian disentrifugasi kembali pada 6800 g selama 1 menit dilakukan sebanyak 2

kali. Setelah itu, supernatan dibuang, pelet sel kemudian diresuspensikan dengan

menggunakan resuspension solution. Kedalam eppendorf dimasukkan 125 µL resuspension

solution, dipipeting agar homogen. Resuspension solution ini merupakan larutan yang

mengandung 50mM glukosa, 25mM Tris-HCl dan 10mM EDTA. EDTA berfungsi sebagai

perusak sel dengan cara mengkhelat (mengikat) kation-kation divalen seperti Mg2+ dan Ca2+.

Kedua ion ini berfungsi sebagai kofaktor yang esensial bagi aktivitas DNAse dalam mencacah

molekul DNA. Selain itu, ion Mg dan Ca diketahui berperan penting dalam mempertahankan

integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat

serta menjaga kestabilan membran plasma bakteri sehingga kerja EDTA juga berfungsi

membantu destabilisasi membran. Glukosa berfungsi menjaga tekanan osmotik sel agar tidak

pecah. Tris-HCl berfungsi sebagai buffer atau larutan penyangga yang dapat

mempertahankan pH sehingga DNA tetap terjaga pada pHnya. Fungsi dari penambahan

suspension soulution adalah untuk meresuspensi pelet sel bakteri setelah pemanenan

menggunakan sentrifus

Tahap selanjutnya lisis sel dan denaturasi DNA dengan pemberian lysis solution

sebanyak 125 µL, kemudian dikocok bulak-balik 4-6 kali. Lysis solution ini terdiri dari 1%

w/v SDS dan 0,2N NaOH. SDS (Sodium Dodesil Sulfat) merupakan garam deterjen anionik,

yang ketika dilarutkan dalam air akan berdisosiasi menjadi ion Na+ dan dodesil sulfat.

Dodesil sulfat adalah molekul deterjen berantai hidrofobik panjang dengan gugus sulfat

bermuatan negatif pada salah satu ujungnya. Dodesil sulfat akan berikatan dengan bagian

interior lipid bilayer pada membran sehingga mengakibatkan lisis sel. Komponen selular

bakteri termasuk DNA dan RNA akan keluar dan larut. Ion deterjen dodesil sulfat juga

mendenaturasi protein yang ada dalam lisat, dengan jalan memutuskan ikatan-katan non

kovalen (terutama ikatan hidrogen) pada protein, sehingga kembali ke struktur primernya,

sebagai rantai linier polipeptida. Hal ini membuat protein-protein enzim kehilangan aktivitas

enzimatiknya, termasuk enzim DNAse yang dikhawatirkan merusak DNA plasmid. Pada

tahap ini larutan akan berisi asam nukleat (DNA dan RNA) dan debris cell yang terdapat

dalam kompleks dodesil sulfat-lipid-protein. NaOH yang bersifat basa membuat seluruh

molekul DNA berutas ganda, baik DNA kromosomal maupun plasmid mengalami denaturasi

menjadi utas-utas tunggal. Itulah mengapa metode ini disebut sebagai metode lisis basa

(alkaline lysis). Pada tahapan ini, DNA kromosomal terpisah sempurna menjadi utas-utas

tunggal terpisah; sedangkan utas tunggal plasmid yang berbentuk lingkaran tetap terhubung,

seperti dua cincin yang saling bertautan. Karakter ukuran dan struktur kedua jenis DNA

inilah yang menjadi dasar pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosomal. Fungsi lysis

solutin ini adalah untuk melisiskan sel dengan cara melarutkan membran sel (oleh SDS), dan

mendenaturasi DNA kromosol namun tidak mendenaturasi DNA plasmid. DNA plasmid

tidak terdenaturasi karena sifatnya yang covalently closed circular DNA

Kemudian ditambahkan 175 µL neutralization solution, kocok 4-6 kali.

Neutralization solution ini merupakan larutan kalium asetat pH ~5,5, asam asetat glasial dan

aquadest. Ion K+ bebas yang berasal dari kalium asetat pada larutan akan menetralkan muatan

negatif dari kompleks kompleks dodesil sulfat-lipid-protein terdenaturasi, membentuk

kalium-dodesil-sulfat (KDS) yang tidak larut dan terpresipitasi bersama lipid membran dan

protein yang terdenaturasi. Asam asetat berfungsi menetralkan suasana basa yang diciptakan

oleh ion hidroksida dari NaOH yang diberikan pada tahap lisis sebelumnya. Ketika pH

larutan kembali netral, ikatan-ikatan hidrogen antar basa utas tunggal DNA terbentuk

kembali, sehingga molekul tersebut dapat berenaturasi menjadi DNA berutas ganda. Proses

renaturasi inilah yang menjadi tahap seleksi bagi plasmid. Utas-utas tunggal sirkular DNA

plasmid yang yang berukuran kecil dan tetap saling bertautan dapat berenaturasi sempurna

membentuk utas ganda yang tetap berada dalam larutan; sedangkan DNA kromosomal yang

berukuran jauh lebih besar dari plasmid tidak dapat berenaturasi sempurna, membentuk

struktur kusut tak beraturan yang terperangkap dan ikut terpresipitasi bersama kompleks

KDS-lipid-protein. Larutan ini berfungsi untuk menetralisir pH menghentikan denaturasi

DNA kromosomal sehingga terbentuk presipitat DNA kromosom yang menempel dengan

debris seluler, dan memisahkan DNA plasmid yang larut di dalam supernatan hingga

terbentuk lisat bakteri. Kemudian disentrifugasi pada 12000 g selama 5 menit untuk

mengendapkan debris sel.

Kemudian supernatannya dipindahkan kekolom tabung kolektor untuk proses

purifikasi. Purifikasi ini bertujuan untuk membersihkan/memurnikan isolat dari kontaminan

selain DNA. Kemudian disentrifugasi pada 12000 g selama 1 menit bertujuan agar DNA

plasmid yang berada dalam kolom. Kemudian supernatant dibuang dan hanya DNA plasmid

yang berada dalam kolom.

Kemudian ditambahkan Wash Solution sebanyak 250 µL dan disentrifugasi pada

12000 g selama 1 menit. Kemudian supernatant dibuang dan kolom dimasukkan kembali ke

tabung kolektor. Penambahan Wash Solution bertujuan untuk menghilangkan kontaminan

yang ada di kolom. Wash Solution ini berisi etanol yang berfungsi selain menghilangkan

kontaminan, etanol ini berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan

mengendapkan DNA. Tahap ini dilakukan dua kali bertujuan untuk menghilangkan sisa Wash

Solution yang terdapat dalam kolom.

Setelah itu, kolom dipindahkan kedalam tabung Eppendrof 1,5 mL baru. Kemudian

ditambahkan Elution Buffer sebanyak 30 µL. Kemudian diinkubasi selama 2 menit pada suhu

ruangan dan kemudian disentrifugasi pada 12000 g selama 2 menit. Penambahan Elution

Buffer bertujuan untuk mengelusi DNA plasmid atau melepaskan ikatan antara matriks dan

silica gel dengan DNA plasmid. Elution Buffer mengandung 10mM Tris-HCl pH 8,5 yang

berfungsi sebagai larutan penyangga yang menjaga kestabilan pH. Pada saat memasukkan

Elution Buffer, tip mikropipet tidak boleh menyentuh membrane kolom agar kolom tidak

rusak dan mencegah adanya kontaminan.

Kemudian ditambahkan ddH2O sebanyak 30 µL dan diinkubasi selama 2 menit.

Kemudian disentrifugasi pada 12000 g selama 2 menit dan diperoleh supernatant yang berisi

DNA plasmid (Fraksi A). Penambahan ddH2O bertujuan untuk melepaskan sisa DNA yang

melekat pada matriks dan memekatkan DNA plasmid yang diperoleh. Setelah itu, kolom

dilepaskan dan dimasukkan kedalam Eppendrof 1,5 mL baru. Kemudian ditambahkan Elution

Buffer sebanyak 30 µL untuk mengelusi DNA plasmid dan diinkubasi selama 2 menit pada

suhu ruangan. Kemudian disentrifugasi pada 12000 g selama 2 menit dan diperoleh

supernatant yang berisi DNA plasmid (Fraksi B). Kemudian kolom dilepaskan dan

dimasukkan kedalam tabung kolektor. Kedua fraksi tersebut disimpan pada suhu -200C agar

DNA plasmid tidak rusak.

Setelah proses isolasi DNA plasmid selesai, sampel diuji menggunakan elektroforesis.

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas

ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Makin besar ukuran molekulnya,

makin rendah laju migrasinya Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan

partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju

kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak

menuju kutub negatif (anode) Hasil elektroforesis ini dapat diamati dengan bantuan sinar UV

dimana akan terlihat pita pita DNA . Elektroforesis ini juga dapat digunakan untuk

mengetahui ukuran DNA dengan menggunakan DNA marker yang sudah diketahui

ukurannya.

Migrasi DNA saat elektroforesis tergantung pada ukuran dan bentuk DNA maka

bentuk dari DNA sampel dapat diperkirakan berdasarkan jarak migrasinya. Untuk plasmid

yang sama diperoleh lebih dari satu ukuran karena adanya DNA lain, seperti DNA

kromosomal dan DNA mitokondria yang bisa saja terikut dalam elektroforesis selain DNA

plasmid sehingga diperoleh berbegai macam ukuran DNA. Bentuk DNA plasmid yang

diperoleh juga bervariasi, kemungkinan penyebabnya adalah proses renaturasi plasmid yang

tidak sempurna sehingga tidak dapat berbentuk sirkular seperti normalnya atau bahkan

plasmid tersebut terdenaturasi karena goncangan yang terlalu kencang saat proses isolasi.

Bentuk DNA (plasmid) yang paling cepat termigrasikan menuju kutub positif adalah DNA

dengan bentuk supercoiled. Disusul oleh DNA plasmid bentuk supercoiled terdenaturasi,

relaxed circular, linear, dan nicked open circular. DNA plasmid yang digunakan untuk proses

elektroforesis ini tidak dapat dijamin 100% kemurniannya karena selain DNA plasmid dalam

bakteri juga terdapat DNA lain yang mungkin saja terikut, misalnya, pada proses penetralan

jika sentrifugasi dan pengocokan dilakukan berlebihan atau terlalu kuat maka DNA

kromosom dapat terlarut dalam supernatant bersama DNA plasmid yang digunakan untuk

tahap selanjutnya. Dalam proses elektroforesis itu sendiri banyak hal yang mempengaruhi

migrasi DNA, yaitu: ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, tegangan arus

listrik, arah medan listrik, temperatur, keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan

komposisi buffer elektroforesis.

Kesimpulan

Praktikan dapat mengisolasi DNA plasmid dari sel prokariot berupa bakteri gram

negatif Escherichia coli menggunakan GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit dengan

melakukan beberapa tahap yaitu : tahap kultivasi dan harvesting , tahap lisis dan tahap

pemurnian DNA plasmid. Setelah, hasil isolasi DNA kromosom diuji dengan

elektroforesis.