PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION)

OLEH :ACHMAD BUSTOMYPUTRI ALIFTA RISTIONOPCR (POLIMERASE CHAIN REACTION)BIOLOGI MOLEKULERPENGERTIANPCR (POLIMERASE CHAIN REACTION Atau REAKSI BERANTAI POLIMERASE )Adalah teknik amplifikasi in vitro fragmen gen tertentu yang terletak diantara pasangan oligonukleotida primer spesifik.Merupakan Salah satu cara yang cepat dan sederhana untuk mengkloning gen dalam tabung reaksi, tanpa membutuhkan bakteri.

SEJARAHSebuah makalah di Journal of Molecular Biology oleh Kleppe dan rekan kerja 1971 pertama kali dijelaskan metode menggunakan tes enzimatik untuk meniru template DNA pendek dengan primer in vitro.Penemuan (1976) Taq polymerase - polimerase DNA dimurnikan dari bakteri termofilik, Thermus aquaticus, yang secara alami hidup di air panas (50 sampai 80C (122-176F)) lingkungan seperti mata air panas. Membuka cara untuk perbaikan dari metode PCR. Polimerase DNA diisolasi dari T. aquaticus stabil pada suhu tinggi tetap aktif bahkan setelah denaturasi DNA, sehingga menghindarkan kebutuhan untuk menambah polimerase DNA baru setelah setiap siklus. Hal ini memungkinkan proses berbasis thermocycler otomatis untuk amplifikasi DNA.PCR pertama kali ditemukan oleh Carry Mullis pada tahun 1985Saat ini PCR digunakan oleh bidang molekuler dan bidang terapan seperti :ZoologiBotaniIlmu lingkungan Ilmu forensik

TEKNIK PCRSecara umum teknik PCR dapat mengurangi sejumlah tahap analisis sehingga memenuhi karakter ekonomis3 tahap reaksi dalam teknologi PCR :DenaturasiAnnealing Polimerisasi

DENATURASIBertujuan memtuskan ikatan H asam deoksiribosanukleat (DNA) double starnded yang akan diamflikasi.Dua untai DNA ganda helix secara fisik terpisah pada suhu tinggi + 95 0CHasil yang diperoleh merupakan DNA cetakan untai tunggal untuk penempelan oligonukleotida primer dalam tahap annealing.ANNEALINGTerbentuk ikatan H baru antara untai tunggal DNA cetakan dengan oligonukleotida primer.Pada tahap ini suhu diturunkan + 45 0C dan dua untai DNA menjadi template untuk polimerase DNA agar selektif memperkuat DNA target. POLIMERISASITahap pemanjangan untai tunggal oligonukleotida perimer dari ujung3 ke ujung 5 dengan katalis enzim DNA polimerase Temperature + 72 0C

SKEMA TAHAP PCR

PROSES PCR (1)Berlangsung dalam 30-35 siklus bergantung pada enzim polimerase, jumlah templat, dan sebagainya.Beberapa komponen yang diperlukan untuk proses PCR :Mesin Thermal cycler (thermacycler)Bahan DNA sampel yang akan diamflikasidNTP ; bahan baku nukleotida saat polimerisasi (terdiri dari : dATP, dGTP, dCTP dan dTTP)Oligonukleotida primer ; nukleotida pendek untuk mengawali reaksi polimerisasiEnzim DNA polimerase untuk mengkatalis reaksi pemanjangan primerddH2Oserta bufer PCR sebagai pelarut ALAT-ALAT PCR (1)Thermacycler (saat ini)Thermacycler (dahulu)

ALAT-ALAT PCR (2)"Baby Blue", mesin prototipe 1986 untuk melakukan PCRMesin yang sekarang di pakai (1994)

PROSES PCR (2)Hasil proses PCR disebut amplikonBanyaknya amplikon dapat ditentukan dengan rumus : (2n 2n)xKet.n : jumlah siklus2n : produk siklus pertama dan keduax : jumlah DNA templatAmplikon merupakan nukleotida komplemen yang berada diantara sepasang primer yang mengapit DNA templat.MENENTUKAN KEBERADAAN AMPLIKONMeload produk PCR yang diperoleh dengan DNA penanda berukuran tertentu. Ukuran (s) dari produk PCR ditentukan oleh perbandingan dengan tangga DNA (penanda berat molekul), yang berisi fragmen DNA ukuran diketahui.Dimasukkan ke dalam gel agarosa 0,8-4 % dalam reaksi elektrosoresis.Gel agarosa mengandung EtBr yang mampu melakukan kelat dengan DNA.Amplikon akan terlihat jika produk PCR yang ada dalam gel disinari ultraviolet

Produk PCR bromide bernoda Ethidium setelah gel elektroforesis. 2 set primer yang digunakan untuk memperkuat urutan target dari 3 sampel jaringan yang berbeda. Tidak ada amplifikasi hadir dalam sampel #1; Pita DNA dalam sampel #2#3 menunjukkan amplifikasi sukses urutan target. Gel juga menunjukkan kontrol positif,dan sebuah tangga DNA yang mengandung fragmen DNA panjang yang ditetapkan untuk ukuran band di PCR eksperimental.

MENENTUKAN KEBERADAAN AMPLIKON (2)OPTIMASI PCRPCR dapat gagal karena berbagai alasan, untuk mencegahnya perlu diperhatikan :Kepekaan terhadap kontaminasi menyebabkan amplifikasi DNA produk palsu.Kontaminasi dengan DNA asing ditujukan dengan protokol laboratorium dan prosedur yang memisahkan campuran pra-PCR dari kontaminan DNA potensial.Benar-benar membersihkan permukaan kerja antara setup reaksi. Teknik Primer-desain yang penting dalam meningkatkan hasil produk PCR dan menghindari pembentukan produk palsuPenggunaan komponen penyangga alternatif atau enzim polymerase dapat membantu dengan amplifikasi.Penambahan reagen, seperti formamida, dalam sistem penyangga dapat meningkatkan spesifisitas dan hasil PCR. Simulasi komputer dari hasil PCR teoritis (Electronic PCR) dapat dilakukan untuk membantu dalam desain primer.

MANFAAT PCR (1)Menentukan bakteri dan protozoa patogen pada manusia. Contoh : E.coli, M.leprae, M.tuberculosis, S.thypi.Menentukan virus patogen pada manusia. Contoh : HIV, virus leukemia,hepatitis B, dan virus demam.Diagnosis penyakit tertentu. Contoh : kanker dari penyakit genetik (leukemia dan limfoma)Mendeteksi miroba patogen dalam makananAspek mikrobiologi lingkungan, contoh : Mendeteksi genetically enginecred microorganism (GEM) dan virus dalam perairanMikroorganisme lokal dalam lingkunganMikroorganisme indikator dalam airMikroba patogen dari air limbah kapal

MANFAAT PCR (2)6. Mempermudah kajian genetik pada tumbuhan , hewan, manusia.Teknik forensik :Sidik jari genetik yang digunakan untuk mengidentifikasi hubungan genetik antara individu dengan membandingkan DNA eksperimental. Contoh :hubungan orang tua-anak atau antara saudara kandung dalam pengujian paternitas. (lihat gambar) Elektroforesis fragmen DNA PCR-diperkuat. (1) Bapa. (2) Anak. (3) Ibu. Anak telah mewarisi beberapa, tapi tidak semua sidik jari masing-masing orang tua nya, memberikan baru, sidik jari yang unik.

17VARIASI TEKNIK PCRSpesifik alel PCRMajelis PCR atau Polymerase Cycling Majelis (PCA)Asymmetric PCRDial-out PCRDigital PCR (dPCR)Tergantung helikase amplifikasiHot PCRIntersequence spesifik PCR (ISSR)PCR InverseLigasi-dimediasi PCRMetilasi spesifik PCR (MSP)Miniprimer PCRMultiplex Ligasi Probe Amplifikasi (MLPA)Multiplex-PCRNanopartikel-Assisted PCR (nanoPCR)Nested PCRTumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan dengan ekstensi tumpang tindih (SOEing):PAN-ACPCR kuantitatif (qPCR)Transkripsi PCR (RT-PCR)Fase Padat PCRBunuh diri PCRThermal asimetris interlaced PCR (TAIL-PCR)Touchdown PCR (Step-down PCR)Universal Cepat BerjalanKEUNTUNGAN PCR (polimerase chain reaction) DIBANDINGKAN RFLP (restriction fragment length polymorphism)Dalam uji forensik, meningkatkan spesifitasMampu mendeteksi alel kecil dari sampel yang sangat kecilMengurangi waktu pengujian dan tenagaTidak menggunakan label nonisotopMengurangi pemakaian barang buktiBerlangsung hanya berhari-hariT E R I M A H K A S I H