Deteksi Bacillus cereus Pada Makanan dengan Metode Loop-Mediated

Isothermal Amplification

Bacillus cereus adalah bakteri aerob gram positif yang mampu membentuk spora dan

menyebabkan gastroenteritis karena mampu membentuk komplek enterotoksin. Bacillus cereus

merupakan bakteri psikrofil yang berbentuk batang, serta merupakan bakteri beta endemik.

Beberapa strain Bacillus cereus dapat berbahaya bagi manusia dan menyebabkan penyakit

bawaan makanan. Bakteri ini menyebabkan pembusukan pada buah,, sayur, dan umbi. Bacillus

cereus dapat menghasilkan racun, racun ini dapat menyebabkan penyakit diare dan toksin

muntah. Gejala penyakit biasanya muncul 8-16 jam setelah mengkonsumsi makanan yang

terkontaminasi, dan sembuh dengan sendirinya dalam 12-24 jam (Ray, 2001).

Metode PCR telah digunakan untuk berbagai kepentingan diantaranya untuk deteksi

suatu gen, diagnosis suatu penyakit, kloning, dan mutagenesis suatu gen, misalnya deteksi B.

cereus pada makanan. Dari dasar metode PCR telah dikembangkan metode amplifikasi DNA

diantaranya dengan menghilangkan tahap denaturasi dan reaksi dilakukan dalam kondisi

isothermal sehingga tidak memerlukan thermocycler. Metode ini dapat disebut loop-mediated

isothermal amplification of DNA (LAMP) (Notomi et al., 2000).

Aplikasi LAMP

LAMP telah dimanfaatkan untuk melakukan deteksi terhadap berbagai patogen pada

tanaman dan manusia. Metode LAMP dapat digunakan untuk deteksi B. cereus pada makanan.

B. cereus banyak ditemui pada berbagai jenis makanan dan merupakan bakteri patogen dengan

voitoxin yang sangat berbahaya. Oleh karena itu, perlu dikembangkan metode deteksi cepat

untuk patogen B. Cereus misalnya dengan metode LAMP (Okamura et al., 2009).

Prinsip Kerja LAMP

Metode ini mengamplifikasi fragmen DNA melalui mekanisme sintesis dan pemisahan

rantai DNA secara otomatis yang dilakukan oleh enzim DNA polymerase dan 4 buah primer

yang mengenal 6 daerah spesifik, dengan 3 daerah di masing-masing ujung fragmen DNA-nya.

Forward inner primer (FIP) terdiri atas sekuen komplementer F1 di ujung 5’, linker TTTT dan

sekuen F2 di ujung 3’. Forward outer primer (F3) merupakan sekuen F3. Backward inner primer

(BIP) terdiri atas sekuen komple-menter B1 di ujung 5’, linker TTTT dan sekuen B2 di ujung 3’.

Backward outer primer (B3) merupakan sekuen B3 (Gambar 1).

Gambar 1. Jenis primer yang digunakan pada LAMP

Reaksi LAMP terdiri atas tahapan produksi material awal berupa struktur dumb-bell

(starting material producing step), tahapan amplifikasi siklus (cycling amplification step) dan

tahapan perpanjangan dan siklus berulang (elongation and recycling step). Reaksi pada produksi

material awal merupakan tahapan yang kritis untuk keberhasilan reaksi LAMP (Gambar 2).

Bagian F2 dari FIP akan menempel pada bagian F2c dari DNA template (1) dan akan dilanjutkan

dengan perpanjangan DNA ke arah 3’ (2). Selanjutnya Forward outer primer (F3) akan

menempel pada sekuen F3c dari template DNA dan dilanjutkan perpanjangan DNA (3).

Perpanjangan ini akan menyebabkan terlepasnya rantai DNA hasil perpanjangan dari primer FIP

(5). Rantai DNA yang lepas akan membentuk loop pada ujung 5’ yaitu dengan hibridisasi bagian

F1 hasil polimerasi dengan F1c dari primer FIP (6). Sementara perpanjangan dari primer BIP dan

pelepasannya oleh reaksi polimerasi dari primer B3. Utas rantai yang terlepas akan menghasilkan

loop karena hibridisasi B1 pada BIc dan pada ujung yang lain terbentuk loop karena hibrididasi

F1 pada F1c, sehingga membentuk struktur dumb bell (8). Struktur terakhir ini akan digunakan

sebagai bahan utama pada tahapan amplifikasi berikutnya dengan primer FIP dan BIP. Reaksi ini

akan menghasilkan beberapa bentuk struktur DNA dengan ukuran yang berbeda-beda (Notomi et

al., 2000).

Gambar 2. Prinsip kerja LAMP

Menurut penelitian yang dilakukan Liu et al., (2011) metode deteksi LAMP untuk B.

cereus merupakan metode yang sederhana dan cepat. Dalam puluhan menit, LAMP Assay dapat

secara efektif mengidentifikasi patogen B. Cereus yang mengandung plasmid pCER270. Reaksi

amplifikasi akan selesai dalam 40-70 menit pada water bath dan dipertahankan pada 63-650C .

Produk LAMP dapat diuji dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa, dan terlihat adanya

pengendapan putih muncul. Berdasarkan target urutan B. cereus 16SrDNA dan gen CesA akan

dirancang LAMP primer spesifik, dan diuji kondisi optimal termasuk suhu, waktu dan

konsentrasi Mg2 + dan primer. Konsentrasi akhir dari masing-masing bagian primers adalah 1,6

dan 0,2 mMof setiap primers. Kemudian produk yang bernilai positif dari hasil amplifikasi akan

dikonfirmasi dengan enzim restriksi yang sesuai 16SrDNA dan CesA target. Hasil yang didapat

LAMP assay untuk B. cereus menunjukkan sensitivitas tinggi. Strain yang terdeteksi dengan alat

tes LAMP untuk B. cereus dapat diverifikasi oleh PCR. Dalam pengujian diketahui sampel susu

terkontaminasi dengan B. cereus melalui uji LAMP. Sehingga, Metode LAMP cocok untuk

deteksi B. cereus pada susu maupun makanan lainnya.

DAFTAR PUSTAKA

Liu, Z., G. Fang., Q. Li.,, G. Zhou., R. Li., Y. Fu., H. Li, and S. Qu. 2011. Detection of Bacillus cereus containing voitoxin in food by loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Food Safety 31 : 313–319.

Notomi, T., H. Okayama., H. Masubuchi., T. Yonekawa., K. Watanabe., N. Amino, and T. Hase, 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acid Research 28:e63.

Okamura, M., Y. Ohba., S. Kikuchi., K. Takehara., M. Ikedo., T. Kojima, and M. Nakamura. 2009. Rapid, sensitive, and specific detection of the O4 group of Salmonella enterica by loop-mediated isothermal amplification. Avian Dis 53: 216–221.

Ray, B. 2001. Fundamental Food Microbiology. CRC Press, Boca Raton.