i

KARYA TULIS AKHIR

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK KULIT SEMANGKA

(Citrullus lanatus) SEBAGAI ANTIJAMUR TERHADAP PERTUMBUHAN

JAMUR Candida albicans SECARA IN VITRO

Oleh :

LOLITA REDHY KUSUMA DEWI

201410330311136

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG

2018

ii

COVER DALAM

HASIL PENELITIAN

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK KULIT SEMANGKA

(Citrullus lanatus) SEBAGAI ANTIJAMUR TERHADAP PERTUMBUHAN

JAMUR Candida albicans SECARA IN VITRO VITRO

KARYA TULIS AKHIR

Diajukan kepada

Universitas Muhammadiyah Malang

untuk Memenuhi Salah Satu Persyaratan

dalam Menyelesaikan Program Sarjana

Fakultas Kedokteran

Oleh:

Lolita Redhy Kusuma Dewi

201410330311136

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG

2018

iii

LEMBAR PENGESAHAN

LAPORAN HASIL PENELITIAN

Telah Disetujui Sebagai Hasil Penelitian Untuk Memenuhi Persyaratan

Pendidikan Sarjana Fakultas Kedokteran

Universitas Muhammadiyah Malang

Tanggal : 6 Agustus 2018

Pembimbing I

Dr. dr. Fathiyah Safitri, M. Kes

Pembimbing II

dr. Thontowi Djauhari, NS, M. Kes

Mengetahui,

Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang

Dekan

Dr. dr. Meddy Setiawan Sp. PD

iv

PERNYATAAN ORISINALITAS

Karya tulis akhir ini adalah karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang

dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Lolita Redhy Kusuma Dewi

NIM : 201410330311136

Malang, 6 Agustus 2018

Lolita Redhy Kusuma Dewi

v

LEMBAR PENGUJIAN

Karya Tulis Akhir oleh Lolita Redhy Kusuma Dewi ini

Telah Diuji dan Dipertahankan di Depan Tim Penguji

Pada Tanggal 6 Agustus 2018

Tim Penguji Dr. dr. Fathiyah Safitri, M. Kes ,Ketua dr. Thontowi Djauhari, NS, M. Kes ,Anggota

dr. Sri Adila Nurainiwati, Sp.KK ,Anggota

vi

KATA PENGANTAR

Bismillahirahmanirrahim. Alhamdulillahirabbil’alamin, puji syukur

penulis panjatkan kehadiran Allah SWT karena atas rahmat dan hidayah-Nya,

penulisan tugas akhir dengan judul “Pengaruh Pemberian Ekstrak Kulit Semangka

(Citrullus lanatus) sebagai Antijamur terhadap Pertumbuhan Jamur Candida

albicans secara in vitro” dapat diselesaikan dengan baik. Begitu pula Dialah yang

menyelaraskan gerakan tangan dan pikiran dalam merangkai huruf menjadi kata

dan selanjutnya menjadi kalimat dalam penulisan tugas akhir ini. Shalawat serta

salam selalu tercurahkan kepada Rasulullah SAW, keluarga, para sahabat dan

pengikut beliau hingga akhir zaman.

Penelitian dalam tugas akhir ini diajukan untuk memenuhi persyaratan

pendidikan Sarjana Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang.

Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terimakasih yang sebesar-

besarnya kepada:

1. Dr. dr. Meddy Setiawan, Sp. PD selaku Dekan Fakultas Kedokteran

Universitas Muhammadiyah Malang atas bimbingannya selama di FK

UMM.

2. dr. Moch Ma’roef, Sp. OG selaku Wakil Dekan I Fakultas Kedokteran

Universitas Muhammadiyah Malang.

3. dr. Sri Adilla Nurainiwati, Sp. KK selaku Wakil Dekan II Fakultas

Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang dan selaku penguji,

terimakasih karena senantiasa memberikan masukan, evaluasi serta

saran yang sangat bermanfaat untuk penulis

vii

4. dr. Indra Setiawan, Sp. THT-KL selaku Wakil Dekan III Fakultas

Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang.

5. Dr. dr. Fathiyah Safitri, M. Kes selaku Ketua Program Studi Fakultas

Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang dan selaku

pembimbing pengganti untuk ujian komprehensif penulis.

6. dr. Irma Suswati, M. Kes selaku pembimbing pertama, atas bimbingan,

kesabaran dan semangat yang telah diberikan kepada penulis dalam

penyusunan tugas akhir ini sehingga penulis dapat menyelesaikan

penelitian ini dengan baik.

7. dr. Thontowi Djauhari, NS, M. Kes selaku pembimbing kedua, atas

bimbingan dalam penyusunan tugas akhir ini sehingga penulis dapat

menyelesaikan penelitian ini dengan baik.

8. dr. Gita Sekar Prihanti, MPD.Ked selaku komisi ilmiah Fakultas

Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang.

9. Yang tercinta, Ibu Sri Utami Amd. Keb, Almarhum Ayah Sumali, dan

Adik Nanda Vikriya Camila terima kasih atas doa, motivasi, dan

dukungannya dalam hal ilmu, finansial, dan moral selama ini.

10. Teman-teman Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah

Malang angkatan 2014 (Medula Spinalis) yang menjadi teman

seperjuangan selama menempuh pendidikan ini.

11. Sahabat kuliah, Nihayatul Husnia, Laili Niami, Nungky Hanazar, Dian

Sella, Nurizza Rahmania, dan Amalina Diva yang menjadi teman

seperjuangan dan terima kasih telah membantu, memberi semangat dan

menguatkan penulis dalam menyelesaikan tugas akhir.

viii

12. Sahabat SMA, Hilma Hasyimy, Amalina Septirana, Ebbylia Rachma,

Neni Fitriana, dan Rifqia Zahara yang selalu memberikan semangat

dan menguatkan penulis dalam menyelesaikan tugas akhir meskipun

dari jauh.

13. Staff Tata Usaha, Ibu Hj. Sri Endah P., Mbak Nuke Yuni Astari, S.E,

Mbak Citra Lestari, S. Ikom, Bapak Heri, Mas Joko Febriantoro, S.

Ikom, dan Mas Burhanudin Jauhari, S.E yang telah membantu

administrasi penulis dalam menyelesaikan tugas akhir.

14. Staff Laboratorium Biomedik, Bapak Drs. Joko Trisilo Wahono, Mbak

Patmawati, S.Pd, Bapak Husnan, S.P, Mas Nyono Putra Rusman, S. Pd

dan Mas Miftachurohman, Amd. Kim yang telah membantu penulis

dalam pelaksanaan penelitian.

15. Semua pihak yang turut membantu dalam menyelesaikan karya tulis

ini juga mendoakan demi suksesnya karya tulis ini yang tidak bisa

penulis sebutkan satu-persatu.

Penulis menyadari sepenuhnya bahwa tidak ada sesuatu yang sempurna di

dunia ini sehingga penulis sangat mengharapkan masukan dari berbagai pihak.

Semoga tugas akhir ini sebagai suatu karya tulis ilmiah dapat bermanfaat bagi

semua pihak.

Malang, 6 Agustus 2018

Penulis

xi

DAFTAR ISI

COVER DALAM ................................................................................................... ii LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................... iii PERNYATAAN ORISINALITAS ........................................................................ iv

LEMBAR PENGUJIAN ......................................................................................... v

KATA PENGANTAR ........................................................................................... vi ABSTRAK ............................................................................................................. ix

ABSTRACT ............................................................................................................ x

DAFTAR ISI .......................................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xiv

DAFTAR TABEL ................................................................................................. xv

DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................... xvi BAB I PENDAHULUAN ....................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 4

1.3 Tujuan Penelitian ...................................................................................... 4

1.3.1 Tujuan Umum ................................................................................... 4

1.3.2 Tujuan Khusus .................................................................................. 4

1.4 Manfaat Penelitian .................................................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................. 6

2.1 Semangka ................................................................................................. 6

Taksonomi ......................................................................................... 6

Gambaran Umum .............................................................................. 6

2.1.3 Morfologi dan Anatomi..................................................................... 7

2.1.4 Kandungan ........................................................................................ 9

2.2 Pelarut Ekstraksi ..................................................................................... 12

2.3 Candida albicans .................................................................................... 13

Taksonomi ....................................................................................... 13

2.3.1 Morfologi dan Identifikasi .............................................................. 14

2.3.2 Struktur sel ...................................................................................... 16

2.3.3 Patogenesis dan Patologis ............................................................... 18

2.3.4 Manifestasi Klinis ........................................................................... 20

2.3.5 Pengobatan Kandidiasis .................................................................. 23

2.3.6 Diagnosis Laboratorium .................................................................. 25

xii

2.4 Uji Kepekaan Terhadap Antimikroba in vitro ........................................ 28

2.5 Hasil Penelitian yang Sudah Dilakukan ................................................. 31

2.5.1 Ekstrak Kulit Semangka dan Trichophyton mentagrophytes .......... 31

BAB III KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS ........................................... 33

3.1 Kerangka Konsep ................................................................................... 33

3.2 Hipotesis ................................................................................................. 34

BAB IV METODE PENELITIAN ....................................................................... 35

4.1 Jenis Penelitian ....................................................................................... 35

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian ................................................................ 35

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian ............................................................. 35

4.3.1 Populasi ........................................................................................... 35

4.3.2 Sampel Penelitian ............................................................................ 35

4.3.3 Estimasi dan Jumlah Pengulangan .................................................. 36

4.4 Variabel Penelitian ................................................................................. 36

4.4.1 Variabel Bebas ................................................................................ 36

4.4.2 Variabel Tergantung........................................................................ 37

4.4.3 Variabel Kontrol.............................................................................. 37

4.5 Definisi Operasional ............................................................................... 37

4.6 Alat dan Bahan Penelitian ...................................................................... 38

4.6.1 Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak Kulit Semangka (Citrullus lanatus) ......................................................................................................... 38

4.6.2 Alat dan Bahan Uji Antimikroba .................................................... 38

4.7 Prosedur Penelitian ................................................................................. 39

4.7.1 Sterilisasi Alat ................................................................................. 39

4.7.2 Pembuatan Medium Sabouraud Dextrose Agar (SDA) .................. 39

4.7.3 Pembuaatan Sabouraud Dextrose Broth (SDB) .............................. 40

4.7.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Semangka (Citrullus lanatus) ................ 40

4.7.5 Identifikasi Jamur Candida albicans .............................................. 41

4.7.6 Pembuatan Perbenihan Cair Jamur ................................................. 41

4.7.7 Uji Efektifitas Kepekaan Ekstrak Kulit Semangka terhadap Jamur C. albicans ......................................................................................................... 41

4.8 Skema Alur Penelitian ............................................................................ 44

4.9 Analisis Data .......................................................................................... 45

BAB V HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS DATA .................................... 46

5.1 Identifikasi C. albicans ........................................................................... 46

xiii

5.2 KBM Ekstrak Kulit Semangka (Citrullus lanatus) terhadap C. albicans .. ................................................................................................................ 47

5.3 Pengaruh Perbedaan Konsentrasi Ekstrak Kulit Semangka (Citrullus Lanatus) dengan pertumbuhan C. albicans ...................................................... 48

BAB VI PEMBAHASAN ..................................................................................... 51

BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................. 54

7.1 Kesimpulan ............................................................................................. 54

7.2 Saran ....................................................................................................... 54

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 55

LAMPIRAN .......................................................................................................... 59

HASIL DETRMINASI ..................................................................................... 59

SURAT SELESAI PENELITIAN .................................................................... 60

SURAT LOLOS KOMISI ILMIAH ................................................................. 61

HASIL PENELITIAN ....................................................................................... 62

ALAT PENELITIAN ........................................................................................ 64

DOKUMENTASI PENELITIAN ..................................................................... 66

HASIL ANALISIS STATISTIK ...................................................................... 68

KARTU KONSULTASI TUGAS AKHIR ....................................................... 70

HASIL DETEKSI PLAGIASI ......................................................................... 71

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Semangka ............................................................................................ 6

Gambar 2.2 Lapisan dinding sel jamur C. albicans ............................................. 16

Gambar 2.3 Pseudohifa pada pewarnaan KOH .................................................... 25

Gambar 2.4 Pertumbuhan C. albicans pada SDB (kiri) dan pada SDA (kanan) .. 27

Gambar 2.5 Germ tube mulai terbentuk dari hifa sejati (anak panah) .................. 28

Gambar 5.1 C. albicans secara makroskopis ......................................................... 46

Gambar 5.2 C. albicans secara mikroskopis dengan LPCB .................................. 46

Gambar 5.3 Grafik rata-rata jumlah koloni pada masing-masing perlakuan ........ 48

xv

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Kandungan Mineral dan Vitamin pada semangka .................................. 9

Tabel 2.2 Perbandingan kandungan pada semangka............................................. 10

Tabel 2.3 Hasil penelitian oleh Sholihah dkk (2015) ............................................ 31

Tabel 5.1 Rata-rata jumlah koloni C. albicans pada cawan .................................. 47

Tabel 5.2 Tabel Analisa Ragam Satu Arah (One Way Analysis of Variance) untuk

jumlah koloni C. albicans per cawan .................................................................... 49

Tabel 5.3 Hasil uji Post Hoc Bonferroni ............................................................... 49

xvi

DAFTAR SINGKATAN

AIDS : Acquired Immune Deficiency Syndrome

ALS : Agglutinin-Like Sequence

ATP : Adenosina trifosfat

CDC : Centers for Disease Control

CFU : Colony Forming Unit

DNA : Deoxyribo Nucleic Acid

IDSA : Infectious Diseases Society of America

KBM : Kadar Bunuh Minimum

KHM : Kadar Hambat Minimum

NCCLS : National Committee for Clinical Laboratory Standard

RNA : Ribonucleic Acid

ROS : Reactive Oxygen Species

RSCM : Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo

SDA : Sabouraud Dextrose Agar

SDB : Sabouraud Dextrose Broth

USDA : United States Department of Agriculture

WHO : World Health Organization

55

DAFTAR PUSTAKA

Agrawal JD, 2010, Pharmacological Activities of Flavonoids, A Review. International Journal of Pharmaceutical Sciences an Nanotechnology, Vol. 4, No. 2, pp. 1394-1398.

Andyani R, Afrina, Sari K, 2017, Uji Aktivitas Antifungal Ekstrak Kulit Pisang Barangan (Musa paradisa L.) terhadap Candida albicans. Cakradonya Dent J, Vol 9, No. 1, pp. 26-33.

Apsari AS, Adiguna MS, 2013, Resistensi Antijamur dan Strategi untuk Mengatasi, Media Dermato Venerelogica Indonesiana, Vol. 40, No. 2, pp. 89-95.

Arifin WN, Zahiruddin WM, 2017, Sample Size Calculation in Animal Studies Using Resource Equation Approach, Malays J Med Sci, Vol. 24, No. 5, pp. 101-105

Bhaskara GY, 2012, Uji Daya Antifungi Ekstrak Etanol Daun Salam (Syzygium polianthum [Wight] Walp.) terhadap Candida albicans Atcc 10231 Secara In Vitro, pp. 1-14.

CDC, 2016, Antifungal Resistance, viewed 15 Januari 2018, <https://www.cdc.gov/fungal/antifungal-resistance.html>

Choi H, Lee DG, 2015, Lycopene induces apoptosis in Candida albicans through reactive oxygen species production and mitochondrial dysfunction, Biochimie, Vol, No, pp.

Choi Y, Lee SM, Chun J, Lee HB, Lee J, 2006, Influence of Heat Treatment on The Antioxidant Activities and Pholyphenolic Compounds of Shiitake (Lentinus edodes) Mushroom, Food Chem, Vol. 99, pp. 381-387.

Dzen SM, Roekistiningsih SS, Winarsih S, 2003, Bakteriologi Medik, Bayumedia Publishing, Malang.

Gavarkar PS, Adnaik RS, Mohote SK, 2013, An Overview of Azole Antifungals, International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, Vol. 4, No. 11, pp. 4083-4089

Gunawan I, 2014, Analisis Pendapatan Usahatani Semangka (Citrullus vulgaris) Di Desa Rambah Muda Kecamatan Rambah Hilir Kabupaten Rokan Hulu, Jurnal Sungkai, Vol. 2, pp. 52-63

Harborne JB, 1987, Metode Fitokimia, Terjemahan dari: Phytochemical Methods Edisi 2, Padmawinata K, Soediro I, penerjemah, Institut Teknologi Bandung, Bandung

56

Ismayati, Bahri S, Nurhaeni, 2013, Kajian Kadar Fenolat dan Aktivitas Antiosidan Jus Kulit Buah Semangka (Citrullus lanatus), Online Jurnal of Natural Science, Vol 2, No. 3, pp. 100-110

Johnson JT, Iwang EU, Hemen JT, Odey MO, Efiong EE, Eteng OE, 2012, Comparative Evaluation of Anti-nutrient Contents of Watermelon (Citrullus lanatus), Annals Of Biological Research, Vol. 3, No. 11, pp. 5145-5150.

Johnson JT, Lennox JA, Ujong UP, Odey MO, Fila WO, Edem PN, Dasafunjo K, 2013, Comparative Vitamins Content of Pulp, Seed, and Rind of Fresh and Dried Watermelon (Citrullus lanatus), International Journal of Science and Technology, Vol. 2, pp. 99-103

Kalie MB, 1999, Bertanam Semangka, Penebar Swadaya, Jakarta.

Kalista KF, Chen LK, Wahyuningsih R, Rumende CM, 2017, Karakteristik Klinis dan Prevalensi Pasien Kandidiasis Invasif di Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo, Jurnal Penyakit Dalam Indonesia, Vol. 4, No. 2, pp. 56-61.

Karta IW, Burhannuddin, 2017, Uji Aktivitas Antijamur Ekstrak Akar Tanaman Bama (Plumbago zeylanica) terhadap Pertumbuhan Jamur Trichophyton mentagrophytes Penyebab Kurap pada Kulit, Jurnal Media Sains, Vol. 1, No. 1, pp. 23-31.

Komariah RS, 2012, Kolonisasi Candida dalam Rongga Mulut, Majalah Kedokteran FK UKI, Vol 28, No.1, pp. 39-47

Lathifah QA, 2008, Uji Efektifitas Ekstrak Kasar Senyawa Antibakteri pada Buah Blimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.) dengan Variasi Pelarut, S.Si thesis, Universitas Islam Negeri, Malang

Mitchel TG, 2016, Medical Mycology, In: Carroll KC, Mietzner TA, Miller S, Morse SA, Jawetz, Melnick, Adelberg’s Medical Microbiology, Edisi 27, McGraw-Hill Education, United States, pp. 684-687

Mutiawati VK, 2016, Pemeriksaan Mikrobiologi pada Candida Albicans, Jurnal Kedokteran Syiah Kuala, Vol. 16, No. 1, pp. 53-63

Nelwan EJ, 2014, Kandisiasis, In: Setiati S, Alwi I, Sudoyo AW, Simadibrata M, Setiyohadi B, Syam AF, Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam, Edisi 6, InternaPublishing, Jakarta, pp. 755-762

Nobile J, Johnson AD, 2016, Candida albicans Biofilms and Human Disease, Annu Rev Microbiol, Vol. 69, pp. 71-92.

Nuria MC, Faizatun A, Sumantri, 2009, Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun J. curcas (Jatropha curcas Linn) Terhadap Bakteri Staphylococcus

57

aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 dan Salmonella typhi ATCC 1408, Mediagro, Vol 5, No. 2, pp. 26-37.

Ornay AKD, Prehananto H, Dewi ASS, 2017, Daya Hambat Pertumbuhan Candida albicans dan Daya Bunuh Candida albicans Ekstrak Daun Kemangi (Ocimum sanctum l.), Jurnal Wiyata, Vol. 4, No. 1, pp. 78-83.

Pappas PG, Kauffman CA, Andes DR, Clancy CJ, Marr KA, Zeichner LO, Reboli AC, Schuster MG, Vazquez JA, Walsh TJ, Zaoutis TE, Sobel JD, 2016, Clinical Practice Guideline for the Management of Candidiasis: 2016 Update by the Infectious Diseases Society of America, Clinical Infectious Diseases, Edisi 62, No. 4, pp. 1–50

Puspitasari, Yosefina. 2014. Kualitas Selai Lembaran dengan Kombinasi Albedo Semangka (Citrullus vulgaris Schard.) dan Buah Naga Super Merah (Hylocereus costaricensis). S1 thesis, UAJY.

Ramadhani A, 2014, Ekstraksi dan Karakterisasi Pektin dari Limbah Kulit Semangka secara Enzimatis dengan Aspergillus niger, Skripsi thesis, Universitas Islam Negeri Sultan Syarif Kasim Riau.

Sholihah TP, Martina A, Yuharmen, 2015, Uji Aktivitas, Antifungal, Kulit Manggis, (Garcinia mangostana) dan Semangka (Citrullus lanatus) terhadap Trichophyton mentagrophytes penyebab Dermatomycosis, JOM FMIPA, Vol. 2, No. 1, pp. 1-10

Siregar, Firmansyah D. 2010. Budi Daya Semangka. Hal 13-14. Diakses 24 Oktober 2017 <https://books.google.co.id/books?id=EIjcRG4AXisC&pg =PA3&dq=semangka&hl=id&source=gbs_toc_r&cad=4#v=onepage&q=semangka&f=false >

Soleha TU, 2015, Uji Kepekaan Terhadap Antibiotik, Jurnal Kesehatan Unila, Vol 5 (9), pp. 119-123

Sung WS, Lee IS, Lee DG, 2007, Damage to the Cytoplasmic Membrane and Cell Death Caused by Lycopene in Candida albicans, Journal of Microbiology and Biotechnology, Vol. 17, No. 11, pp. 1797-1804.

Tjampakasari CR, 2006, Karakteristik Candida albicans, Cermin Dunia Kedokteran, No. 151, pp. 33-36

USDA Nutrient Database, 2018, Basic Report: 09326, Watermelon, raw, viewed 27 April 2018 <https://ndb.nal.usda.gov/ndb/foods/show/09326?fgcd= &manu=&format=&count=&max=25&offset=&sort=default&order=asc&qlookup=raw+WATERMELON&ds=&qt=&qp=&qa=&qn=&q=&ing=/ >

WHO, 2014, Antimicrobial Resistance Global Report on Surveillance, viewed 19 Januari 2018, < http://www.who.int/drugresistance/documents/surveillanc ereport/en/>

58

Xu G, Ye X, Chen J, Liu D, 2007, Effect of Heat Treatment on The Phenolic Compound and Antioxidant Capacity of Citrus Peel Extract, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 55, No. 2, pp. 330-335.

Yulianti, D., Susilo, B., dan Yulianingsih, R., 2014, Pengaruh Lama Ekstraksi dan Konsentrasi Pelarut Etanol terhadap Sifat Fisika-Kimia Ekstrak Daun Stevia (Stevia Rebaudiana Bertoni M.) dengan Metode Microwave Assisted Extraction (MAE), Jurnal Bioproses Komoditas Tropis, 2(1), pp.35-41.