Obesitas pada Anak Usia Sekolah dan Korelasinya dengan E. Coli pada Usus dan Bifidobacteria: Stusi Kasus Kontrol

Abstrak

Latar belakang: Untuk menentukan korelasi antara obesitas pada anak-anak usia sekolah dan ketidakseimbangan mikroba usus dengan memeriksa perubahan rasio Bifidobacteria usus dan E. Coli pada anak obesitas yang dibandingkan dengan kelompok kontrol bebas-obesitas.

Metode: Sebuah penelitian case-control 1:1 yang berbasis rumah sakt telah dilaksanakan. Sample fecal dari subjek penelitian dikumpulkan untuk ekstraksi DNA dan dianalisa dengan PCR kuantitatif real-time (Qpcr) untuk menentukan jumlah salinan Bifidobacteria dan E. Coli. Rasio perbandingan kedua mikroba (B/E) kemudian dihitung dan dianalisa secara statistik.

Hasil: Subjek penelitian yaitu kelompok obesitas dan kelompok kontrol yang menunjukan tidak ada perbedaan yang sigifikan dalam usia, jenis kelamin atau tinggi (P > 0,05); namun mereka memiliki perbedaan yang signifikan dalam berat badan dan BMI. Jumlah salinan Bifidobacteria dan E.coli per gram sampel fecal basah pertama ditentukan menggunakan Qpcr dalam kedua kelompok yaitu kelompok obese dan kelompok normal, yang selanjutnya digunakan untuk perhitungan rasio B/E. Kami menemukan bahwa rasio B/E dalam kedua grup menunjukan perbedaan yang signifikan (P < 0,05). Uji X2 yang telah dikoreksi dilakukan untuk kedua kelompok terhadap B/E <1, dan ditemukan bahwa terdapat korelasi positif (OR = 719.2, OR 95% CI = 81.57-6341. 18) antara penurunan rasio B/E dengan obesitas pada masa anak-anak.

Kesimpulan: Anak-anak obesitas memiliki jumlah Bifidobacteria yang lebih rendah dan jumlah E.coli yang lebih tinggi (rasio B/E yang lebih kecil) dibandingkan dengan anak bebas gemuk yang normal. Disarankan bahwa obesitas pada anak-abak dapat dikaitkan dengan ketidakseimbangan mikroba usus..

Kata kunci: Obesitas, Anak, Mikroba usus, dan Bifidobacteria.

Latar BelakangObesitas adalah akumulasi lemak yang berlebih di seluruh tubuh karena berbagai faktor. Dampak obesitas pada metabolisme, fungsi endokrin, sistem kardiovaskular, pernafasan dan pencernaan serta pertumbuhan dan perkembangan tubuh telah diteliti dengan baik. Obesitas pada masa anak-anak erat kaitannya dengan obesitas pada dewasa, diabetes, hiperlipidemia, hipertensi dan penyakit jantung koroner. Dalam beberapa tahun terakhir, seiring meningkatnya kondisi kehidupan masyarakat dan perubahan pola diet serta faktor lain, obesitas pada anak prevalensinya semakin meningkat dan terjadi pada anak dengan usia yang lebih muda. Diantara faktor resiko non-genetik pada obesitas, peran dari mikroba usus telah diakui. Korelasi antara obesitas dan perubahan pada mikroba usus telah dibuktikan dalam beberapa penelitian menggunakan model binatang yang menderita obesitas, diabetes, dan

penyakit lainnya. Selain itu telah terbukti bahwa jumlah E. Coli lebih tinggi pada wanita dengan kelebihan berat badan dari pada wanita dengan berat badan normal selama kehamilan. Sebaliknya, Bifidobacterium dan Akkermansia muciniphila menunjukan hasil yang cenderung berlawanan. Sejauh ini, korelasi antara obesitas pada anak-anak dengan mikroba usus telah hampir baik diteliti, serta rasio dari Bifidobacteria intestinal dan E. Coli (rasio B/E) masih harus didefinisikan. Saat ini penelitian case-control berbasis rumah sakit 1:1 meneliti perubahan rasio Bifidobacteria usus dan E. Coli pada anak obese dan non-obese usia sekolah menggunakan kuantitaif realtime PCR. Data kami menunjukkan bahwa ada korelasi positif antara obesitas dan ketidakseimbangan mikroba usus.

MetodeSubjek dan kelompok-kelompok penelitian

Penelitian ini telah dilakukan dengan persetujuan tertulis dari komite etik West China University Second Hospital dan persetujuan tertulis dari subjek dan orangtua subjek.

Penelitian ini merupakan sebuah case –control yang berbasis rumah sakit 1:1 dengan random sampling. Kriteria inklusi termasuk: subjek kelompok obesitas yang direkrut dari kunjungan ke Child Health Clinic of West China University Second Hospital dari Februari 2012 sampai juni 2012 dan didiagnosis dengan obesitas menurut standar WHO / NCHS; dan subjek kontrol bebas obesitas direkrut dari tempat yang sama dengan sebuah catatan pemeriksaan kesehatan tahunan selama periode yang sama dan rumah sakit yang sama tanpa sebuah diagnosa obesitas. Anak obesitas dan kelompok kontrol dipasangkan menurut umur dan jenis kelamin. Kriteria eksklusi termasuk yang menerima antibiotik atau probiotik, atau riwayat diare atau penyakit gastrointestinal lainnya dalam 4 minggu terakhir; jantung, paru-paru, hati, ginjal, endokrin, genetik dan penyakit metabolik; atau penolakan untuk berpartisipasi dalam penelitian ini.

Usia, jenis kelamin dan informasi umum lainnya dari subjek dicatat; tinggi (m) dan berat badan (kg) subjek dari kedua kelompok diukur; sampel fecal dari semua subjek dikunpulkan di kotak steril dan disegel dalam 2 jam setelah buang air besar, dan segera disimpan di -700 untuk persiapan selanjutnya.

Metode EksperimenProsedur ekperimen termasuk; penyusunan standar stains (revival, kultur, bagian

penyimpanan dan isolasi DNA), ekstraksi DNA dari sampel fecal, penentuan konsentrasi DNA dan kemurnian, desain primer untuk mendeteksi strain spesifik dari mikroba, pembentukan kurva standar dengan strain DNA standar dan analisis kuantitatif real-time PCR (Qpcr) pada sampel yang dilakukan dengan mengikuti petunjuk produsen.

Strain primer disintesis oleh TaKaRa. Urutan primer dari forward (F) dan reverse (R) yang digunakan dlam penelitian ini adalah sebagai berikut. F: 5’-TTGGGCGTAAAGGGCTCGTA-3’, dan R: 5’- TTCGCCATCGGTGTTCTTCC-3’ untuk Bifidobacteria, yang menghasilkan produk PCR dengan panjang 166 bp. F: 5’-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-3’ dan R: 5’-ACCAGGGTATCTTAATCCTGTT-3’ untuk E. Coli dengan produk PCR 144 bp.

Analisa PCR kuanttatif fluoresensi pada sampel: sample DNA diambil/diekstraksi, dan jumlah Bifidoacteria dan E. Coli 16 s Rrna ditentukan oleh analisa PCR kuantitatif fluoresensi menggunakan sistem reaksi dan kondisi yang sama sebagai pembentuk kurva standar. Serial pengenceran Ten-fold dari standar dan sampel DNA bakteri fecal saat ini telah diuji. Standar dan kontrol kosong dimasukkan dalam setiap percobaan, dan setiap sampel diuji 3 kali atau rangkap 3. Kekhususan dari reaksi PCR dikonfirmasi oleh kurva cair/lembut dan jumlah salinan gen bakteri dihitung menggunkan nilai Ct dan kurva standar. Data disajikan sebagai algoritma dan salinan angka/ jumlah (x lgx ± slgx) dan rasio Bifidobacteria terhadap E. Coli telah dijumlahkan.

Analisa StatistikData dianalisis menggunakan paket perangkat lunak SPSS. Data kuantitatif disajikan

sebagai mean ± standar deviasi (x ±sd). Perbandingan ini dilakukan dengan menggunakan 2 tailed t-test. Data kategori dibandingkan menggunakan tabel 2x2 tes X2 (tes X2 Yates’ atau uji Fisher exact digunakan ketika kriteria tidak bertemu). Nilai Odd Ratio (OR) dan C.I 95% telah dihitung. P < 0.05 dianggap signifikan secara statistik. Hasil

Informasi umum: kedua kelompok obesitas dan kelompok kontrol memasukan 63 subjek. Kedua grup menunjukan tidak terdapat perbedaan bermakna pada umur, jenis kelamin dan tinggi badan (P> 0.05), sedangkan kedua kelompok memiliki perbedaan bermakna pada berat badan dan BMI (P< 0.05).

Penentuan konsentrasi DNA dan kemurnian: A260/A280 nilai standar dari DNA adalah 1.83 ± 0.17 untuk Bifidobacteria dan 1.86 ± 0.14 untuk E. Coli; nilai A260/A280 dari ekstrak DNA adalah 1.92 ± 0.28 untuk kelompok obesitas dan 1.89 ± 0.26 untuk kelompok kontrol. Tidak ada perbedaan yang bermakna dari konsentrasi dan kemurnian DNA yang telah dideteksi diantara kedua kelompok (P>0.05).

Hasil real-time PCR kuantitatif dari sampel fecal (gambar. 1, data disajikan sebagai algoritma dari jumlah salinan (_x lgx ± slgx).

Berdasarkan pada apakah rasio nilai B/E lebih rendah daripada 1, distribusi dari subjek kedua kelompok dimasukan kedalam sebuah tabel 2x2 (Tabel 2). Karena n> 40 dan I ≤T < 5, uji Yates’ X2 digunakan. Hasil penelitian menunjukan X2 = 99.96, γ = 1, P < 0.0001, menunjukan sebuah perbadaan bermakna antara kelompok obesitas dan kelompok kontrol; perhitungan lebih lanjut menunjukan OR = 719.2 dengan sebuah C.I 95% dari 81.57

6341.18. Disarankan bahwa terdapat korelasi antara obesitas dan B/E <1.

PembahasanSeperti yang telah dilaporkan oleh WHO dalam beberapa tahun lalu, obesitas masa

anak-anak meningkat pesat secara global dan insiden obesitas meningkat dua kali lipat sejak 1980, dan lebih dari 40 juta anak saat ini hidup dengan obesitas. Sementara patogenesis dari obesitas tidak didefinisikan secara jelas, peran dari mikroba usus telah diusulkan. Dalam model seekor tikus, telah menunjukan bahwa obesitas dapat di transfer oleh mikroba usus: tikus menerima mikroba usus dari donor yang obesitas menunjukan obesitas tetapi bukan donor yang langsing. Pengumpulan data dalam litelatur mendukung gagasan bahwa mikroba usus, yang terbesar dan yang paling penting dari sistem mikro-ekologi dalam tubuh manusia, memainkan peran penting dalam kesehatan. Dalam keadaan normal, bakteri dalam usus mempertahankan proporsi tertentu dari spesies dan jumlah untuk mempertahankan stabilitas mikro-ekologi usus. Namun, stabilitas dapat terganggu oleh berbagai faktor, termasuk metabolisme, sistem imun serta reaksi inflamasi dari pejamu, dan kemudian mengakibatkan obesitas dan penyakit lain. Dalam waktu yang berarti, mikroba usus berada dibawah pengaruh kondisi psikologis, diet dan obat. Sebagai contoh, antibiotik, kehamilan atau oleh probiotik mempengaruhi berat badan melalui modulasi flora usus. Namun, data mengenai mikroba usus dan obesitas pada anak yang sangat terbatas. Sehingga menjadi sangat penting untuk mempelajari hubungan antara mikroba usus dan obesitas dikarenakan oleh peningkatan pesat obesitas pada anak. Metode tradisional untuk identifikasi dan kuantifikasi/penghitungan

bakteri fecal melakukan pendekatan kultur, yang memakan banyak tenaga kerja, dan hasilnya dapat bervariasi karena operasi atau pelaksanaan yang berbeda. Dengan kemajuan dari teknik biologi molekuler, metode bebas kultur telah muncul. Saat ini, 16 s Rrna berdasarkan Qpcr telah digunakan secara luas dalam penelitian mikro-flora karena tingginya akurasi dan sensitivitas serta rendahnya kemungkinan kontaminasi.

Saat ini, penelitian case-control berbasis rumah sakit 1:1, DNA tinja disiapkan dari subjek obes dan kontrol dan diperiksa dengan standar noda/ stains DNA. A260/A280 pada DNA ini ditentukan untuk menjadi 1.6 – 1.8, menunjukan kualitas yang baik dari DNA ekstraksi. DNA standar telah siap menggunakan standar strain dan diuji dengan PCR konvensional dan kuantitatif fluorescent real-time PCR untuk membentuk kurva standar. Yang pertama memiliki kekhasan yang baik untuk memeriksa stains, seperti yang ditunjukan oleh hasil PCR konvensional dan kurva lembut/cair. PCR kuantitatif fluorescent real-time selanjutnya digunakan untuk kuantifi atau menghitung kandungan Bifidobacteria dan E. coli intestinal, dan hasilnya menunjukan bahwa anak obese secara signifikan memiliki kandungan Bifidobacteria lebih rendah dan kandungan E. coli yang lebih tinggi, dibandingkan dengan kontrol normal. Disarankan bahwa adanya ketidakseimbangan dari mikroba usus yang terdapat pada anak obesitas. Rasio Bifidobacteria dan E. coli intestinal (B/E) pertama kali diperkenalkan oleh Dutch scholar Van Der Waaij et al. untuk mewakili resistensi kolonisasi dari mikroba usus. Bifidobacteria adalah bakteri yang bermanfaat untuk intestinal, sedangkan E. coli mewakili bakteri patogen. Penurunan B/E dianggap sebagai indikator penting bagi pergeseran dari mikroba normal usus kepada sebuah kondisi yang merugikan kesehatan. Karena kedua jenis bakteri ini juga merupakan bagian dari flora normal usus, rasio B/E mewakili keseluruhan kondisi dari mikro-flora usus. Pada penelitian ini, rasio B/E secara signifikan lebih rendah pada anak obesitas dibandingkan kelompok kontrol normal, dan terdapat sebuah korelasi yang kuat antara obesitas dan B/E <1, yang konsisten atau sama dengan penelitian yag dilakukan oleh Million dan Santacruz pada binatang percobaan dan populasi lainnya. Kolonisasi yang lebih rendah pada Bifidobacteria dan ketidakseimbangan mikroba usus mungkin memainkan peranan penting dalam pengembangan obesitas.

KesimpulanRingkasan, hubungan antara obesitas dan mikroba usus telah menjadi salah satu topik penelitian terpanas. Penelitian pada mikroba usus telah mencapai kemajuan besar pada penggunaan binatang percobaan. Penyelidikan lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan dengan jelas perannya dalam obesitas pada manusia. Rasio B/E adalah sebuah parameter besar yang digunakan untuk memperkirakan keseluruhan kondisi flora usus. Namun mikroba

usus terdiri dari sistem yang besar dan kompleks. Penelitian lebih lanjut untuk seluruh seluruh spektrum dari fungsinya dan mekanisme dalam kesehatan dan kondisi patologi dapat memberikan target terapi pengobatan obesitas.