MULTI INFEKSI PADA UDANG Litopenaeus vannamei :DIAGNOSIS DENGAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

DAN REVERSE TRANSCRIPTASE-POLYMERASE CHAIN REACTION(RT-PCR)

Isti Koesharyani, Lila Gardenia, dan Hambali SupriyadiPusat Penelitian dan Pengembangan Perikanan Budidaya

Jl. Ragunan 20, Pasar Minggu, Jakarta Selatan 12540E-mail: isti@cria.indosat.net.id; istisugama@yahoo.com

(Naskah diterima: 19 April 2011; Disetujui publikasi: 15 Februari 2012)

ABSTRAK

Penelitian ini dilakukan karena adanya masalah yang dihadapi seperti pertumbuhanudang yang tidak seragam (ukuran bervariasi), penampakan klinis yang abnormal danorgan yang tidak sempurna. Gejala tersebut akibat dari infeksi penyakit yangdisebabkan oleh virus. Untuk mengetahui jenis virus yang menyerang udang tersebut,maka dilakukan analisis Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) menggunakan berbagai jenis spesifik primer WSSV,IHHNV, MBV, TSV, IMNV, dan PvNV. Sampel udang yang secara visual normal danabnormal diambil lalu disimpan dalam larutan pengawet 90% Ethanol dan RNAlaterkemudian dianalisis di laboratorium dengan metode yang sudah dikembangkan olehPusat Penelitian dan Pengembangan Perikanan Budidaya. Hasilnya menunjukkan bahwaudang yang tumbuh lambat dan mempunyai rostrum bengkok dan warna otot dagingmemutih ternyata tidak hanya diserang oleh satu virus namun dua virus IHHNV danIMNV. Hasil penelitian ini juga mengindikasikan bahwa udang yang terserang IHHNVakan tumbuh lambat walaupun tidak mematikan, sedangkan udang yang diserang IMNVotot daging di tubuh memutih terutama pada bagian punggung dan dapat menimbulkankematian.

KATA KUNCI: multi infeksi Litopenaeus vannamei, IHHNV, IMNV, WSSV, PCR,RT-PCR

ABSTRACT: Multi infection of Litopenaeus vannamei shrimp: detection byusing Polymerase Chain Reaction (PCR) and Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) method. By: Isti Koesharyani,Lila Gardenia, and Hambali Supriyadi

This research was done due to the problems found in the field such as shrimp withabnormal growth (dwarf). Those symptoms caused the disease outbreak by viruses.To know the type of virus that infected to the shrimp, the samples be analyze by usingPolymerase Chain Reaction (PCR) and Reverse Transcriptase-Polymerase ChainReaction (RT-PCR) method with primers of specific WSSV, IHHNV, MBV, TSV, IMNV, andPvNV. Samples of normal and abnormal shrimp were taken and stored in a preservativesolution 90% ethanol and RNAlater and then analyzed in the laboratory with a methodthat has been developed by The Research Center for Aquaculture. The results showedthat the shrimp that grow slowly and have a curved rostrum and the white fleshmuscle was infected by two type of viruses IHHNV and IMNV. The results also indicate

Multi infeksi pada udang Litopenaeus vannamei: ..... (Isti Koesharyani)

73

that IHHNV infected shrimp will grow slowly, although there are not mortality. Whilethe shrimp are IMNV infected by shown muscle white body, especially on the backand can cause mortality

KEYWORDS: multi infection Litopenaeus vannamei, IHHNV, IMNV, WSSV,PCR,RT-PCR

PENDAHULUANBudidaya udang telah diketahui sangat

menguntungkan, bila produksi tidak mengalamikegagalan baik dalam produksi larva dihatcheri maupun pada saat proses per-tumbuhan di tambak. Namun, kenyataan yangada di lapangan seringkali terjadi berbagaimasalah, kasus tersebut adalah adanya infeksipatogen baik bakteri, jamur, maupun patogenlain yaitu virus. Patogen yang disebabkan olehvirus disinyalir merupakan kasus yang seringditemukan dan menyebabkan kerugian karenatingkat kematian dapat mencapai 100% sepertipada kasus infeksi white spot syndrome virus(WSSV) pada budidaya udang P. monodon.Virus tersebut mempunyai inang yang sangatluas, dapat menyerang berbagai jenis udangpenaeid, di antaranya P. monodon, P. japonicus,P. chinensis, P. Indicus, P. marguensis, dan L.vannamei (Kasornchandra et al., 1998,Koesharyani et al., 2001; Flegel. 1999 ; Kimuraet al., 1996; Inouye et al., 1994; Rodriguez etal., 2003).

Beberapa kasus kematian massal yangdisebabkan oleh penyakit pada udang vanamepernah dilaporkan terjadi di beberapa tambakbaik di Jawa maupun di luar Jawa. Adapun gejala-gejalanya yang pernah dilaporkan sesuaidengan jenis penyakit yang disebabkan olehpatogen virus. Menurut OIE (Aquaculture AsiaPacific, 2010), ada beberapa jenis penyakitvirus yang menyerang udang dan perludiwaspadai diantaranya (ada 9 jenis penyakit),yaitu White Spot Syndrome Virus (WSSV),Infectious Hypodermal dan HaematopoeticNecrosis (IHHNV), Penaeus monodon-typebaculovirus (MBV), Taura syndrome virus (TSV),Yellow head virus (YHV), Infectious myonecrosisvirus (IMNV), Hepatopancreatic parvovirus(HPV), Gill associated virus (GAV), danMacrobrachium rosenbergii noda virus (MrNV).Di mana dari kesembilan jenis virus tersebutenam jenis virus (WSSV, IHHNV, MBV, YHV,IMNV, dan TSV) sudah menginfeksi secaradefinitif pada budidaya udang P. monodon danL. vannamei di Indonesia. Namun tidaktertutup kemungkinan akan adanya infeksi

penyakit baru yang akan menginfeksi bilapencegahan dengan cara diagnosis rutin tidakdilakukan. Sementara infeksi jenis virustersebut diketahui sangat mematikan sehinggadapat menimbulkan kerugian ekonomi yangtidak sedikit.

Infeksi WSSV sangat ganas dan mematikanpada budidaya udang windu P. monodon,sedangkan pada udang L. vannamei yangberasal dari Amerika ternyata rentan terhadapserangan penyakit Taura Syndrome Virus (TSV)infeksi. Penyakit ini diketahui sejak tahun 1992di Ecuador (Poulos et al., 1999). Penyakit lainyang dapat menyerang udang L. vannameiadalah Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) dandiketahui sejak tahun 2004 di Brazil. KasusIMNV pertama di Indonesia dilaporkan telahmenginfeksi budidaya udang L. vannameipada tahun 2006 di Situbondo Jawa Timur(Senapin et al., 2007) dan infeksi tersebutsampai saat ini masih sering ditemukan padatambak yang bermasalah. Penyakit lain yangdianggap terbaru yang sudah diketahui diBelize pada tahun 2004 juga menyerang udangputih ini adalah Penaeus vannamei NodaVirus (PvNV), serangan virus ini dapat meng-akibatkan nekrosia pada daging atau musclenecrosis, gejala ini hampir sama sepertiserangan IMNV (Tang et al., 2007b). Umumnyaudang L. vannamei ini rentan terhadapinfeksi golongan RNA virus (TSV, IMNV, danPvNV) dan beberapa golongan DNA virusseperti WSSV dan IHHNV (OIE, 2006). Untukvirus lain seperti YHV dan MBV masing-masingpernah ditemukan, tetapi intensitas infeksitidak seperti pada virus lainnya. Pada tahun2009 kasus infeksi MBV masih ditemukan padabudidaya udang P. monodon organik diSidoarjo, Jawa Timur (Koesharyani et al., 2009unpublish).

Dengan banyaknya kejadian infeksipenyakit di lapangan khususnya virus, makaperlu dilakukan pemantauan dan diagnosisguna mencegah masuknya patogen baru yangakan memperparah kondisi perudangan diIndonesia. Oleh karena itu, untuk mengetahuiadanya patogen maka perlu dilakukan analisis

J. Ris. Akuakultur Vol. 7 No. 1 Tahun 2012: 73-84

74

deteksi rutin menggunakan PCR dan RT-PCRmenggunakan berbagai macam spesifikprimer. Diharapkan hasil yang diperoleh dapatmenentukan status penyakit sehubungandengan pengembangan udang introduksi L.vannamei.BAHAN DAN METODE

Sampel Udang L. vannameiSampel udang L. vannamei normal dan

abnormal yang berumur ± 2 bulan berasal darilokasi budidaya udang di Situbondo, JawaTimur. Sampel udang diambil dengan gejalaseperti ukuran yang tidak seragam walaupunberumur sama, abnormalitas bentuk rostrum(memendek dan bengkok) serta warna tubuhyang memutih. Sampel selanjutnya disimpandalam dua larutan pengawet yang berbedayaitu pada 90% Ethanol untuk digunakan dalampengujian DNA virus dengan metode PCR, danRNAlater® (Qiagen), untuk digunakan dalamanalisis RNA virus dengan metode RT-PCR.Pada setiap individu sampel udang kemudiandiekstrak DNA dan RNA nya. (Ektraksi DNA danRNA dilakukan pada setiap individu sampeludang).

Ekstraksi DNAPersiapan lysate: Masing-masing sampel

udang uji diambil jaringan insang/pleopodseberat 10 mg, dimasukkan dalam (2 mL)mikrotube Precellys Ceramic ditambahkan 250µL Lysis buffer (Mole product). Jaringan udangdihancurkan dengan alat HomogenizerPeqLab dengan kecepatan 5000 rpm selama 3menit dengan penghentian kecepatan tiap 1menit sebanyak 3 kali. Selanjutnya homogenatdiinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam.Sebanyak 10 µL Rnase A (Dnase & ProteaseFree) 10mg/mL ditambahkan untuk meng-hilangkan RNA dan protein sebagaipenghambat amplifikasi dan inkubasikankembali pada suhu 37oC selama kurang lebih45 menit kemudian ditambahkan 10 µL Protein-ase-K (10 mg/mL) dan diinkubasi pada suhu55oC satu malam, selanjutnya lysate yangdiperoleh akan digunakan pada proses isolasigenom DNA.

Isolasi genom DNA: Isolasi genom DNAdilakukan dengan Gen Mole StripTM DNA Tisuesecara Robotik, yaitu dengan memindahkansebanyak ± 200 µL Lysate (supernatan) yangtelah diperoleh dari ektraksi ke dalam tabungStrip Mole dan ditempatkan sedemikian rupa

dalam rak pada mesin robotik kemudiandiprogram dan dioperasikan selama 45 menit.Hasil akhir berupa 100 µL genom DNA,selanjutnya dipindahkan ke dalam mikrotubesteril (DNAse & Rnase Free). Genom DNAdigunakan untuk amplifikasi DNA virus targetdengan menggunakan PCR dan spesifikprimer.

Ekstraksi RNAPersiapan lysate: Sampel udang uji

diambil jaringan insang/pleopod seberat 25mg, dimasukkan dalam (2 mL) mikrotubePrecellys Ceramic ditambahkan 600 µL LysisBuffer (Mole product). Jaringan udang di-hancurkan dengan alat Homogenizer PeqLabdengan kecepatan 5000 rpm selama 3 menitsebanyak 2 kali, homogenat diinkubasikanpada suhu ruang selama 10-15 menit,kemudian di-sentrifugasi dengan kecepatan14 000 rpm selama 1 menit. Sebanyak 600 µLsupernatan diambil dan ditempatkan ke dalammikrotube baru dan ditambahkan 600 µL Etha-nol 80%.

Isolasi Genom RNA: Isolasi genom RNAdilakukan dengan menggunakan SurePrepTM

True TotalTM RNA purification Kit (Fisher BioReagent ), proses awal isolasi adalahpengikatan genom RNA dengan memasukkan2 x 600 µL lysate dalam spin column dandisentrifugasi masing-masing dengankecepatan 14 000 rpm selama 1 menit, setelahRNA terikat pada spin column selanjutnyadilakukan proses pencucian RNA.

Pencucian (washing), ke dalam spincolumn ditambahkan 400 µL wash solutiankemudian disentrifugasi dengan kecepatan14000 rpm selama 1 menit. Proses tersebutdilakukan sebanyak tiga kali pada pencucianyang ketiga, lama sentrifugasi menjadi 2 menit.Column dibiarkan sebentar hingga keringkemudian dilanjutkan dengan proses pen-cairan RNA.

Pencairan RNA (RNA Elution). Padaproses pencairan RNA column dipindahkanke dalam mikrotube steril (DNAse & RNAse Free)dan ditambahkan 100 µL pelarut RNA yang adadalam kit. Kemudian mikrotube berisi columndisentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpmselama 2 menit. Sentrifugasi dilanjutkandengan kecepatan 12000 rpm selama 1 menit.Genom RNA yang diperoleh selanjutnyadigunakan untuk amplifikasi cDNA dengan RT-PCR menggunakan spesifik primer.

Multi infeksi pada udang Litopenaeus vannamei: ..... (Isti Koesharyani)

75

Konsentrasi DNA/RNA: DNA diukur kwalitasdan kuantitasnya dengan menggunakan alatpengukur DNA “nanodrop”. Kemurnian DNAdiukur pada panjang gelombang 260 dan 280nm (OD260/280= 1.6-1.8). DNA dan RNA yang baikdalam jumlah dan kemurniannya selanjutnyadigunakan pada proses amplifikasi denganPCR.

Amplifikasi DNAAmplifikasi PCR untuk jenis infeksi dari

virus DNA dilakukan dengan menggunakan 5xGreen GoTaq Flexi Reaction Buffer (Promega).Amplifikasi dilakukan dengan total reaksi 10µL. Sebanyak 1 µL DNA (10 ng) ditambahkanmastermix dengan konsentrasi 3,5 mM MgCl2,0,3 mM dNTP mix, 0,5 pM masing-masingReverse dan Forward primer, 0,5 U GoTaqPolymerase (Promega) dan 1 x Green GoTagReaction Buffer (Promega). Proses amplifikasimenggunakan mesin PCR SpeedyCycler(Tretiakov & Saluz US Patent 6.556.940). Profilamplifikasi untuk masing-masing virus IHHNV

dan MBV dapat dilihat pada Tabel 2, sedangkanuntuk WSSV dapat dilihat pada Tabel 3.

Amplifikasi c-DNA dengan RT-PCRAmplifikasi untuk virus-virus RNA dilakukan

dengan menggunakan AccssQuickTM RT-PCRSystem Promega. Amplifikasi dilakukan dengantotal reaksi sebanyak 10 µL: 2 µL DNA (10 ng)ditambahkan mastermix dengan konsentrasi,0,5 pM masing-masing Reverse dan Forwardprimer, dan 0,2 x AccssQuickTM Master mix(Promega). Untuk mendiagnosa atau meng-amplifikasi c-DNA virus menggunakan mesinPCR SpeedyCycler (Tretiakov & Saluz US Patent6.556.940) profil amplifikasi untuk masing-masing virus IMNV, TSV, dan PvNV dapat dilihatpada Tabel 4.

ElektroforesisHasil amplifikasi selanjutnya dielektro-

phoresis pada 2% agarose gel, dengan larutanSB-Buffer (10 x 100 mM NaOH yang di-

Tabel 1. Primer spesifik yang digunakan dalam mendeteksi beberapa jenis virus yangmenginfeksi udang L. vannamei

Table 1. The specific primers used to detect of several types of viruses infected on L.vannamei shrimp

Ukuran amplikon Amplicon size

(bp)

WSSV R: 5’- AgA Tag CgA AAC AAC ATC CAA C-3’ 113F: 5’- ATg gTA CAT TTT CCg ggC g -3’ Gen Bank U50923.1

IHHNV R: 5’ - ggC CAA gAC CAA AAT ACg AA -3’ 389F: 5’ - Cgg AAC ACA ACC CGA CTT TA -3’ Tang et al . (2007) (a)

Gen Bank.AF218266R: 5’ - Tgg CAT gCA CTC CCT gAg AT -3 526F: 5’ - CAT ATC ggC CgA ATA gTg gTC -3’ Jena Germany

TSV R: 5’- AAg TAg ACA gCC gCg CTT gC-3’ 231F: 5’- TCA ATg AgA gCT Tgg TCC-3’ Nunan et al. ( 1998)

Gen Bank AF277675Nt.6910-7140

IMNV R: 5’- TgA AAA, ATA AGC TgT gCC CCA TgT T-3’ 600F: 5’- ggC AAT TTC AAC CTA ATT CTA AAA C-3’ Senapin et al . (2007)

Gen Bank EF061744R: 5’- CCg TTT gAA TTT CAg CAA CA -3’ 339F: 5’- CTg TCT CAC Agg CTg gTT CA-3’ Tang et al . (2007) (b)

MBV

PvNV

Sekuen primer 5’ ~ 3’ Primers sequences 5’ ~ 3’

Jenis virus Type of virus

J. Ris. Akuakultur Vol. 7 No. 1 Tahun 2012: 73-84

76

Tabel 4. Profil suhu amplifikasi untuk mendeteksi IMNV, TSV, dan PvNV dengan PCRTable 4. Temperature profile amplification for IMNV, TSV, and PvNV detection by PCR

Kondisi Temperat ur Waktu (det ik) SiklusCondit ion Tempera t ure (oC) Time (second) Cycle

Transkripsi terbalik 48 120Reverse transcriptation 95 20Denaturasi awal 95 10Pre-denaturation

Penempelan 58 (IMNV & TSV)Annealing 55 (PvNV)Pemanjangan 72 20Extension

Pemanjangan akhir 72 120 1Final elongation

1

10 40

Tabel 3. Profil suhu amplifikasi untuk mendeteksi WSSV dengan PCRTable 3. Temperature profile amplification for WSSV detection by PCR

Kondisi Temperat ur Waktu (det ik) SiklusCondit ion Tem pera t ure (oC) Tim e (second) Cycle

Denaturasi awal 95 120 1Pre-denaturation

Denaturasi 95 5Denaturation

Penempelan/Pemanjangan 60 20Annealing/Extension

Pemanjangan akhir 72 120 1Final elongation

45

Tabel 2. Profil suhu amplifikasi untuk mendeteksi IHHNV dan MBV dengan PCRTable 2. Temperature profile amplification for IHHNV and MBV detection by PCR

Kondisi Temperatur Wakt u (det ik) SiklusCondit ion Tempera t ure (oC) Time (second) Cycle

Denaturasi awal 95 120 1Pre-denaturation

Denaturasi 95 10 45 (IHHNV)Denaturation

Penempelan 58 10Annealing

Pemanjangan 72 20 35 (MBV)Extension

Pemanjangan akhir 72 120 1Final elongation

Multi infeksi pada udang Litopenaeus vannamei: ..... (Isti Koesharyani)

77

tambahkan H3BO3 atau Boric Acid sampaipH 8). Hasil elektroforesis selanjutnyadidokumentasikan menggunakan Geldoc.HASIL DAN BAHASAN

Sampel udang yang diperoleh pada bulanJuli 2009 dengan lama pemeliharaan sekitar 2bulan berasal dari tambak dengan dasar beton,menggunakan sistem sirkulasi dan tandon.Benih udang L. vannamei yang ditebar ditambak sekitar PL 10-12, berasal dari indukSpesifik Pathogen Free (SPF) dengan kepadatanberkisar 80-100 ekor/m2.

Gejala udang sakit yang ditemukan dilapangan adalah adanya nekrosa pada ototbagian atas perut dan ekor disertai warna

putih pada bagian otot punggung ke arah ekorjuga nekrosia di ujung-ujung ekor (Gambar 1).Hasil pengamatan juga diperoleh adanyapertumbuhan udang yang tidak seragam atauukuran yang bervariasi dan disertai bentukrostrum yang abnormal atau bengkok (Gambar2). Kondisi udang di lapangan hampir semuamenampakkan gejala yang sama, seperti telahdijelaskan di atas. Oleh karena itu, untukpengujian dalam penelitian hanya diambilbeberapa contoh (8 ekor udang) yang dapatmewakili kondisi atau keadaan udang dilapangan.

Berdasarkan sampel yang diperoleh baikyang sehat secara visual maupun yang sakit,setelah dilakukan diagnosa beberapa jenisvirus (WSSV, IHHNV, MBV, TSV, IMNV, dan PvNV)

Gambar 1. Sampel udang L. vannamei dengan gejala warna udang putih (opaque) dankerdil (A) disertai necrosia pada ekor (B)

Figure 1. Samples of L. vannamei shrimp with symptoms of white shrimp color (opaque)and stunted (A), necrosia accompanied on the tail and (B)

Gambar 2. Sampel udang L. vannamei yang digunakan (A) normal, abnormal dan ukuranudang yang tidak seragam, (B) rostrum yang bengkok

Figure 2. Samples of L. vannamei shrimp were used testing (A) healthy, normal, abnor-mal and the size of shrimp that are not uniform, (B) and a bend rostrum

J. Ris. Akuakultur Vol. 7 No. 1 Tahun 2012: 73-84

78

A B

A B

menggunakan teknik PCR dan RT-PCR denganspesifik primer (Tabel 1) ternyata menunjuk-kan adanya infeksi. Hasil yang diperolehmenunjukkan bahwa 75% sampel terinfeksioleh IMNV dan 100% sampel terinfeksi IHHNV.Dari perhitungan diagnosa ternyata tidaksedikit (75%) udang uji terinfeksi oleh keduajenis virus secara bersamaan IHHNV dan IMNV(Tabel 5). Kasus natural multi infeksi ini seringditemukan pada udang penaeid, walaupunvariasi jenis virus berbeda pada setiap kasus.Hal ini ditunjukkan seperti pada kasus multiinfeksi WSSV dan MBV yang ditemukan padabudidaya udang P. monodon di Philippine(Natividad et al., 2006). Bahkan ditemukankasus ‘triple infection’, 3 jenis virus MBV, HPV,dan WSSV pada P. monodon di India walaupunMBV dan HPV difinitif positif dengan peme-riksaan histopatologi dan WSSV positif dengansingle step PCR (Manivannan et al., 2002).

Infeksi IMNV pada budidaya tambak udangL. vannamei sampai saat ini masih seringterjadi dengan intensitas yang cukup tinggiterjadi hampir setiap tahun baik di Jawa mau-pun di luar Jawa. Monitoring yang dilakukanpada awal tahun 2010 diperoleh kasuskematian dengan gejala TSV dan IMNV padatambak L. vannamei di Banyuwangi, Jawa Timur(Laporan monitoring 2010 unpublish). InfeksiIMNV pada budidaya udang L. vannamei yangteridentifikasi pada tahun 2004 juga meru-pakan kasus infeksi yang cukup merugikan.Keberadaan penyakit tersebut akan terusberada selama dalam pertumbuhan udang ditambak, dan secara kumulatif akibat infeksi

IMNV ini dapat mematikan udang budidayasampai dengan 70% (Nunes et al. dalam Pouloset al., 2006; Poulos & Lightner, 2006). Hasilpengujian infeksi buatan terhadap infeksi IMNVmenunjukkan bahwa IMNV dapat menginfeksipada ketiga jenis udang L. vannamei, L.stylirostris, dan P. monodon walaupunmempunyai efek yang berbeda (Tang et al.,2005) dan kemungkinan dapat menyerangudang penaid lainnya. Dalam nomenklaturvirus, IMNV ini termasuk ke dalam RNA virusdouble-stranded, family Totaviridae, yangtidak beramplop (non-enveloped), berbentukicosahedral dengan diameter virion 40 nm(Senapin et al., 2007).

Akurasi deteksi virus agar mendapatkanhasil yang maksimal dengan menggunakanteknik PCR/RT-PCR, yang ditentukan olehbeberapa faktor, seperti penyimpanan sampelpada larutan yang tepat dan ketepatan jenisprimer yang digunakan. Penyimpanan jaringanuntuk pemeriksaan virus dari gol RNA sepertiTSV, IMNV, dan PvNV dan lain-lain dalamlarutan ethanol 90% bisa mengalami kerusakansehingga tidak dapat dideteksi kembali adanyapatogen virus. Sebaiknya sampel untukgolongan RNA virus disimpan dalam larutanRNAlater, dari hasil percobaan ternyataRNAlater dapat menjaga kestabilan RNA dandari hasil pengamatan preservasi penggunaansampel jaringan yang disimpan selama 1 tahundalam larutan RNAlater pada suhu -20oCkeadaan RNA masih tetap baik dan stabildibandingkan dengan penyimpanan jaringandalam larutan Ethanol 90% (Novita et al., 2009).

Tabel 5. Hasil diagnosa enam jenis virus WSSV, MBV, IHHNV, TSV, IMNV, dan PvNV padaudang L. vannamei

Table 5. Diagnostic results of six types of viruses WSSV, MBV, IHHNV, TSV, IMNV, and PvNVon L. vannamei shrimp

WSSV MBV IHHNV TSV IMNV PvNVNormal - - + - + -Abnormal (Dwarf ) - - + - - -Normal - - + - + -Abnormal (Whitish ) - - + - + -Normal - - + - + -Abnormal (Whitish ) - - + - + -Abnormal curved-rostrum - - + - - -Abnormal (Whitish ) - - + - + -

Diagnost ik virus (Viruses detect ion )Sampel udang vanameShrimp samples L. vannamei

Multi infeksi pada udang Litopenaeus vannamei: ..... (Isti Koesharyani)

79

Pemilihan dan ketepatan primer jugasangat menentukan hasil diagnosa. Adabeberapa jenis primer yang dapat digunakandalam mendiagnosa IMNV. Dalam percobaanini, primer IMNV yang digunakan adalah primeryang didesain oleh (Senapin et al., 2007)dengan target berat molekul 600 bp. Primertersebut mempunyai sensitivitas yang lebihbaik dibandingkan primer lain yang pernah ada(Poulos & Lightner, 2006). Pada penelitian inipenggunaan spesifik primer dengan targetberat molekul 600 bp. merupakan hasil sekuendari udang L. vannamei yang terinfeksi IMNVdi Indonesia sehingga keberhasilan dalammendeteksi adanya IMNV akan lebih spesifikdan tidak menghasilkan false negative (negatifpalsu). Sekuen susunan nukleotida yangberasal dari IMNV Indonesia ini sudah di-masukkan ke dalam Gen Bank denganaccession no. EF061744 (Senapin et al., 2007).Hasil analisis sampel uji dengan RT-PCRmenggunakan primer IMNV dapat dilihat padaGambar 3.

Kasus lain yang ditemukan pada penelitianini yaitu adanya infeksi IHHNV. Dari sampelyang diperoleh dari lapangan baik itu udangyang terlihat sehat maupun sakit, ternyatasampel uji tersebut terinfeksi 100% (8/8)oleh IHHNV. Diketahui bahwa IHHNV dapat

mematikan dan sangat patogen terhadapudang jenis L. stylirostris (Lightner & Redman,1998). Virus tersebut diketahui tidak me-matikan bila menginfeksi udang L. vannameiatau P. monodon, namun IHHNV hanyamenyebabkan pertumbuhan yang lambat danpertumbuhan rostrum yang abnormal(bengkok) (Tang et al., 2007a; Bonnichon etal., 2006; Flegel et al., 2004; Tang et al., 2003;Kalagayan et al., 1991). Hal tersebut samaseperti kasus yang diperoleh dalam penelitianini, udang menampakkan gejala pertumbuhanyang tidak normal dengan beragam ukurandisertai bentuk rostrum yang abnormal ataubengkok (Gambar 2). Walaupun infeksi IHHNVtidak mematikan pada udang tetapi dapatmenimbulkan kerugian ekonomi oleh karenaterjadi peningkatan Feed Conversion Ratio(FCR) pakan. Berdasarkan karakteristikmorfologi dan biokimia, IHHNV termasuk kedalam golongan Parvoviridae dengan bentukicosahedral DNA non-enveloped yang ber-diameter 22 nm (Bonami et al., 1990). Dari hasilpenelitian menyatakan bahwa penyebaranvirus IHHNV dapat diturunkan secara vertikalmelalui induk betina, yaitu pada ovari udangbetina yang terinfeksi. Sementara darisperma udang jantan yang positif IHHNV tidakmenurunkan IHHNV. Dengan demikian IHHNVini diturunkan dari induk betina yang positif

Gambar 3. Profil amplifikasi PCR sampel udang L. vannamei yang terinfeksi IMNV padatarget berat molekul 600 bp. 1: Normal; 2: Abnormal/dwarf; 3: Normal;4: Abnormal/whitish; 5: Normal; 6: Abnormal/whitish; 7: Abnormal/curvedrostrum; 8: Abnormal/whitish, N: Negative Control, M: Marker Low Range

Figure 3. Profile of PCR amplification of shrimps samples L. vannamei infected IMNVon the target molecular weight of 600 bp. 1: Normal; 2: Abnormal/ dwarfs;3: Normal; 4: Abnormal/whitish; 5: Normal; 6: Abnormal/whitish; 7: Abnor-mal/curved rostrum; 8: Abnormal/whitish, N : Negative Control, M: MarkerLow Range

J. Ris. Akuakultur Vol. 7 No. 1 Tahun 2012: 73-84

80

1500

600

850400

200

50

terinfeksi IHHNV (Motte et al., 2003). Olehkarena itu, dalam persiapan perbenihan udang,pemeriksaan induk yang akan digunakan untukproduksi larva dalam hatcheri harus benar-benar diperhatikan terutama dalam mendeteksiada-tidaknya infeksi khususnya IHHNV padainduk betina yang akan digunakan dalampembenihan.

Ada beberapa jenis primer yang dapatdigunakan dalam deteksi secara rutin terhadapIHHNV (OIE, 2006; Tang et al., 2003; Tang etal., 2007a) dan teknik deteksi lain sepertiRamification Amplification Assay (RAM) yangbisa digunakan dalam alternatif deteksi (Tenget al., 2006). Dalam penelitian diagnostikIHHNV, digunakan spesifik primer yang sangatsensitif dan tercatat dalam Gen Bank denganAsseccion No AF 218266 dengan target beratmolekul 389 bp. Primer ini bisa digunakanuntuk mendiagnosa semua jenis IHHNV darilokasi berbagai negara serta dapat digunakanuntuk deteksi rutin (Tang et al., 2007a). Telahdijelaskan di atas bahwa sampel udang yangkelihatan sehat (normal) dan abnormal padapenelitian ini ternyata positif terinfeksi IHHNV.Hasil diagnostik dapat dilihat dari hasilamplifikasi dengan PCR (Gambar 4).

Infeksi IHHNV yang ditemukan bersamaandengan infeksi IMNV pada sampel L. vannameiini, tidak menyebabkan kematian yang berarti.Fenomena ini kemungkinan disebabkan oleh

adanya kompetisi atau perbedaan polareplikasi virion pada kedua virus tersebut didalam seluler tubuh udang. Kasus seperti inipernah terjadi pada percobaan infeksi buatanWSSV pada L. vannamei yang positif IHHNV,dimana tingkat kematian adanya infeksi WSSVdapat dihambat karena kemungkinan ter-ganggunya WSSV dalam mereplikasi didalamtubuh udang dibandingkan dengan infekesiWSSV ke L. vannamei yang negatif terinfeksiIHHNV. (Bonnichon et al., 2006; Melena et al.,2006). Kondisi ini sama dengan apa yangditemukan pada kasus yang terjadi pada udangsampel yang dianalisis pada tulisan ini. Di manakematian yang terjadi tidak terlalu banyak,kemungkinan kasus ini adanya fenomenatersebut di atas. Akibatnya adalah ukuranudang yang sangat bervariasi karena adanyainfeksi IHHNV dan penampilan udang yangtidak begitu cerah akibat infeksi IMNV. Olehkarena itu, kualitas penggunaan induk sangatperlu diperhatikan didalam melakukan pem-benihan udang vanname. Pencegahan adalahtindakan yang harus dilakukan dengan caramelakukan deteksi dan monitoring adanyapatogen penyakit.

Untuk pencegahan dapat dilakukandengan cara mendeteksi dengan baik danbenar. Saat ini telah berkembang teknikdeteksi atau diagnosa dengan Real-Time PCRatau Quantitatif PCR (Q-PCR). Teknik tersebut

Gambar 4. Profil amplifikasi PCR sampel udang L. vannamei yang terinfeksi IHHNV pada targetberat molekul 389 bp. 1: normal; 2: abnormal/dwarf; 3: Normal; 4: abnormal/whitish;5: normal; 6: abnormal/whitish; 7: abnormal/curved rostrum; 8: abnormal/whitish,M: marker low range, (-): negative control, (+): positive control

Figure 4. Profile PCR amplification samples of shrimps IHHNV-infected L. vannamei on thetarget molecular weight of 389 bp. 1: normal; 2: abnormal/dwarfs; 3: normal;4: abnormal/whitish; 5: normal; 6: abnormal/whitish; 7: abnormal/curved rostrum;8: abnormal/whitish, M: marker low range, (-): negative control, (+):positive control

Multi infeksi pada udang Litopenaeus vannamei: ..... (Isti Koesharyani)

81

389 389

50

200

400850

1500

mempunyai keunggulan yaitu tingkatsensitivitas yang sangat tinggi selainmendeteksi secara kwalitatif juga dapatmengetahui kwantitas virion di dalam individuyang terinfeksi oleh suatu virus. Pada individudengan serangan awal suatu infeksi virus,maka dengan mudah dapat diketahui adanyainfeksi walaupun dalam jumlah virion sangatsedikit/kecil. Teknik tersebut dapat di-aplikasikan pada ikan atau hewan lain yangbersifat carrier. Teknik Real-Time PCR inisudah banyak diterapkan di antaranya dalammendiagnosa virus IHHNV dan WSSV padaudang (Dhar et al., 2001), sedangkan pada ikantawar Koi digunakan dalam mendeteksi infeksiKHV (Gilad et al., 2004).

Selain itu menurut Tang et al. (2007b),mengatakan bahwa terdapat kasus infeksibaru yang dapat menyerang udang yangdinamakan P. vannamei Nodavirus atau PvNV.Walaupun sampai saat ini di Indonesia kasusinfeksi PvNV tersebut belum pernah di-temukan, namun tidak tertutup kemungkinanakan adanya penyebaran, sehingga dapatberakibat merugikan dalam budidaya udang L.vannamei. Dengan ketersediaan induk L.vannamei yang sudah didomestikasi dantersertifikasi bebas virus (WSSV, IHHNV, TSV,IMNV, dan PvNV), diharapkan dapat menghin-dari introduksi penyakit virus di Indonesia.KESIMPULAN1. Hasil diagnosa yang diperoleh memper-

lihatkan bahwa 75% sample terinfeksiIMNV, 100% terinfeksi IHHNV dan 75%kasus multi infeksi IHHNV dan IMNV padabudidaya udang L. vannamei.

2. Kasus multi infeksi IHHNV dan IMNV tidakmenimbulkan kematian massal pada udangL. vannamei.

3. Penggunaan sampel dengan preservasiyang tepat dan primer spesifik, dapatmeningkatkan validitas diagnosa

SARAN1. Dalam kebijakan kedepan harus diupaya-

kan standarisasi diagnosa untuk seluruhlaboratorium yang ada di Indonesia.

2. Perlu adanya pemantauan rutin denganstandar diagnosa akan adanya infeksi viruspada udang introduksi L. Vannamei.

3. Perlu adanya kontrol yang ketat terutamaimport udang jenis L. vannamei untukmencegah introduksi penyakit baru.

UCAPAN TERIMA KASIHDiucapkan terima kasih kepada labo-

ratorium beserta staf Hans-Knoll Institute (HKI)Jena Germany yang sudah memberikankesempatan dalam melakukan diagnosis dalampenelitian tersebut di atas.DAFTAR ACUANAquaculture Asia Pacific March/April. 2010.

Real-time PCR shrimp virus detection, 6(2):46.

Bonnichon, V., Lightner, D.V., & Bonami, J.R.2006. Viral interference between infec-tious hypodermal and hematopoietic ne-crosis virus and white spot syndrome vi-rus in Litopenaeus vannamei. Dis. Aquat.Org., 72: 179-184.

Bonami, J.R., Trumper, B., Mari, J., Brehelin, M., &Ligtner, D.V. 1990. Purification and charac-terization of the infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus of penaeidshrimps. J. Gen Virol., 71: 2,657-2,664.

Dhar, A.K., Roux, M.M., & Klimpel, K.R. 2001.Detection and quantification of infectioushypodermal and haematopoietic necrosisvirus and white spot virus in shrimp usingreal-time quantitative PCR and SYBR greenchemistry. Journal of Clinical Microbiology,p. 2,835-2,845.

Flegel, T.W., Nielsen, L., Thamavit, V., Kongtim,S., & Pasharawipas, T. 2004. Presence ofmultiple viruses in non-diseased, culti-vated shrimp at harvest. Aquaculture, 240.55-68.

Flegel, T.V. 1999. An overview of prawnviral disease work in Thailand: PCR forshrimp disease diagnosis. Moleculer diag-nostic for shrimp viruses in The Asian Re-gion. ACIAR-Mahidol Univ. Thailand, L3-1–L3-11.

Gilad, O., Yun, S., Zagmutt-vergara, F.J.,Leutenegger, C.M., Bercovier, H., &Hedrick, R.P. 2004. Concentration of a koiherpesvirus (KHV) in tissue of experimen-tally infected Cyprinus carpio koi as as-sessed by real-time TagMan PCR. Diseasesof Aquatic Organism, 60:179-187.

Inouye, K., Miwa, S., Oseko, N., Nakano, H.,Kimura, T., Momoyama, K., & Hiraoka, M.1994. Mass mortalities of culured kurumashrimp Penaeus japonicus in Japan in 1993:Elektron microscopic evidence of thecausative virus. Fish Patologhy, 29(2): 149-158.

J. Ris. Akuakultur Vol. 7 No. 1 Tahun 2012: 73-84

82

Kasornchandra, J., Boonyaratpalin, S., & Itami,T. 1998. Detection of white-spot syndromein cultured penaeid in Asia. Microscopicobservation and polymerase chain reac-tion. Aquaculture, 164: 243-251.

Kalagayan, H., Godin, D., Kana, R., Hagino, G.,Sweeney, J., Wyben, J., & Brook, J. 1991.IHHNV virus as an etiological factor in runt-deformity syndrome (RDS) of juvenilePenaeus vanname cultured in Hawaii. Jour-nal World Aquaculture Society, 22: 235-243.

Kimura, T., Yamano, K., Nakano, H., Momoyama,K., Hiraoka, M., & Inouye, K. 1996. Detec-tion of Panaeid Rod-shaped DNA Virus(PRDV) by PCR. Fish Pathology, 31(2): 93-98.

Koesharyani, I., Supriyadi, H., Gardenia, L.,Mufidah, T., &. Aryati, Y. 2009. Aplikasi danvalidasi metode diagnostik DNA virusudang IHHNV, MBV dan WSSV secara parareldan multiplek. Laporan Penelitian APBN2009 unpublish.

Koesharyani, I., Roza, D., Mahardika, K., Johnny,F., Zafran, & Yuasa, K. 2001. Manual for fishdisease diagnosis-II (Marine fish and Crus-tacean diseases in Indonesia. Gondol Re-search Institute for Mariculture and JapanInternational Cooperation Agency, 49 pp.

Lightner, D.V. & Redman, R.M. 1998. Shrimp dis-eases and current diagnostic method.Aquaculture, 164: 201-220.

Manivannan, S., Otta, S.K., Karusanagar, I., &Karusanagar, I. 2002. Multiple viral infec-tion in Penaeus monodon shrimp postlarvaein an Indian hatchery. Dis. Aquat. Org., 48:233-236.

Mote, E., Yugcha, E., Luzardo, J., Castro, F.,Leclercg, G., Miranda, P., Borja, O., Serrano,J., Terreros, M., Montalvo, K., Narvaez, A.,Tenorio, N., Cedeno, V., Mialhe, E., & Boulo,V. 2003. Prevention of IHHNV verticaltransmision in the white shrimp Litopenaeusvannamei. Aquaculture, 219: 57-70.

Melena, J., Bayot, B., Betancourt, I., Amano, Y.,Panchana, F., Alday, V., Calderon, J., Stern,S., Roch, Ph., & Bonami, J.R. 2006. Pre-ex-posure to infectious hypodermal and he-matopoietic necrosis virus or to inacti-vated white spot syndrome virus (WSSV)confers protection against WSSV inPenaeus vanname (Boone) post-larve. Jour-nal of Fish Diseases, 29: 589-600.

Natividad, K.D.L., Migo, M.V.P., Albaladejo, J.D.,Magbanua, J.P.V., Nomura, N., Matsumura,M. 2006. Simultaneous PCR detection of

two shrimp virus (WSSV and MBV) in postlarvae of Penaeus monodon in the Philip-pines. Aquaculture, 257: 142-149.

Novita, H., Mufidah, T., & Koesharyani, I. 2009.Perbandingan penggunaan berbagaipreservasi RNA jaringan dengan RNAlater,alkohol dan alkohol-gliserol untuk deteksiIMNV dengan PCR. J. Ris. Akuakultur, 4(3):377-383.

OIE. 2006. Mannual of Diagnostic Test forAquatic Animal, World Organisation for Ani-mal Health, 414 pp.

Poulos, B.T., Kibler, R., Bradley, D., Dunlop,Mohney, L.L., & Liggtener, D.V. 1999. Pro-duction and use of antibiodies for detec-tion of Taura syndrome virus in penaidshrimp. Dis. Aquat. Org., 37: 99-106.

Poulos, B.T., Tang, K.F.J., Pantoja, C.R., Bonami,J.R., & Lightner, D.V. 2006. Purification andcharacterization of infectious myonecrosisvirus of penaeid shrimp. Journal of GeneralVirology, 87: 987-996.

Poulos, B.T. & Lightner, D.V. 2006. Detectioninfection with infectious myonecrosis vi-rus (IMNV) of penaeid shrimp by Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction(RT-PCR). Dis. Aquat. Org., 73: 69-72.

Rodriguez, J., Bayot, B., Amano, Y., Panchana,F., I de Blas, Alday, V., & Caledron, J. 2003.White spot syndrome virus infection in cul-tured Penaeus vanname (Boone) in Ecua-dor with emphasis on hstopathology andultrasucture. Journal of Fish Diseases, 26:439-450.

Senapin, S., Phewsaiya, K., Briggs, M., & Flegel,T.W. 2007. Outbreaks of infectiousmyonecrosis virus (IMNV) in Indonesia con-firmed by genome sequencing and use ofan alternative RT-PCR detection method.Aquaculture, 266: 32-38.

Teng, P.H., Lee, P.Y., Lee, F.C., Chien, H.W.,Chen, M.S., Sung, P.F., Su, C., & Ou, B.R.2006. Detection 0h infectious hypodermaland hematopoietic necrosis virus (IHHNV)in Litopenaeus vanname by ramificationamplification assay. Dis. Aquat. Org., 73:103-111.

Tang, K.F.J., Navarro, S.A., & Lightner, D.V. 2007a.PCR assay for discrimenitating betweeninfectious hypodermal and hematopoeiticnecrosis virus (IHHNV) and virus -relatedsequences in the genome of Penaeusmonodon. Dis. Aquat. Org., 74: 165-170.

Tang, K.F.J., Pantoja, C.R., Redman, R.M., &Lightner, D.V., 2007 b. Development of in

Multi infeksi pada udang Litopenaeus vannamei: ..... (Isti Koesharyani)

83

situ hybridization and RT-PCR assay for thedetectionof a nodavirus (PvNV) that causesmuscle necrosis in Penaeus vanname. Dis.Aquat. Org., 75: 183-190.

Tang, K.F.J., Pantoja, C.R., Poulos, B.T., Redman,R.M., & Lightner, D.V. 2005. In situ hybrid-ization demonstrates that Litopenaeusvanname, L stylirostris, and Penaeusmonodon are susceptible to experimentalinfection with infectious myonecrosis vi-rus (IMNV). Dis. Aquat. Org., 63: 261-265.

Tang, K.F.J., Poulos, B.T., Wang, J., Redman, R.M.,Shih, H.H., & Lightner, D.V. 2003. Geo-graphic variation among infectious hypo-dermal and hematopoeitic necrosis virus(IHHNV) isolates and characteristics of theirinfection. Dis. Aquat. Org., 53: 91-99.

Tretiakov, A. & Saluz, H.P. US Patent 6,556,940).SpeedyCycler PCR Machine.

J. Ris. Akuakultur Vol. 7 No. 1 Tahun 2012: 73-84

84