MEDIA BIAKAN*

TUJUAN1.Mengetahui jenis dan menguasai cara-cara pembuatan mediapertumbuhan mikroba.2.Mengetahui dan menguasai teknik pemindahan mikroba dengan cara aseptik.

*

Macam media biakan

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran unsur zat hara (nutrien) yang berguna untuk membiakkan dan pertumbuhan mikroba. Media digolongkan menjadi:1. Berdasarkan bentuknya, terdiri dari media padat, media semi padat, dan media cair.2. Berdasarkan susunan kimia, terdiri dari:Media sintetik/media siap saji, adalah media yang di buat dari bahan-bahan yang diketahui dengan pasti yangbiasanya banyak di produksi oleh pabrik-pabrik.Media non sintetik/media alami, adalah media yang dibuat dari bahan-bahan alami yang susunan kimianya tidak diketahui dengan pasti.Media semi-sintetik adalah media yang tersusun oleh campuran bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintetis.*

3. Berdasarkan fungsi, terdiri dari media penguji, media diperkaya, media selektif, media diferensial, media untukmenghitung mikroba dan media khusus.Adapula persyaratan tertentu bagi media, agar mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang biak di dalam media tersebut, yaitu

Dalam keadaan steril, artinya sebelum di inokulasi mikroorganisme tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme lain yang tidak diinginkan.Harus mengandung unsur hara yang dibutuhkan untukpertumbuhan dan perkembangan mikroorganisme.Mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme. Pada dasarnya semua media kultur adalah cair, semisolid, dan solid. Medium yang cair dan tidak mengandung agen solid disebut medium cair (medium broth). Medium cair yang ditambah dengan agen solid yang disebut agar menghasilkan medium solid atau semisolid.

*

AgarAgar merupakan ekstrak dari rumput laut yang merupakan karbohidrat kompleks yang penyusun utamanya iaitu galaktosa dan tidak mengandung nutrisi. Medium solid membutuhkan agar sekitar 1,5 hingga 1.8%. Sedangkan konsentrasi kurang 1% dari tersebut akan menjadi semisolid.Agar bertindak sebagai agen pemadat yang sangat baik karena pada suhu 1000C berupa larutan sedangkanpada suhu 40oC memadat. Oleh karena itu organisme terutama yang patogen dapat dikultivasi pada temperatur 37,5 C, atau sedikit lebih tinggi tanpa rasa kuatir medium akan meleleh. Medium solid mempunyai keuntungan karena dapat memadat sehingga dapat ditumbuhi mikroorganisme dengan menggunakan teknik khusus untukmengisolasi koloni yang berlainan.*

Agar miringPada saat masih cair, medium solid dalam tabung reaksi diletakkan miring dengan sudut 15 derajat, sehingga saat medium mendingin dan memadat akan membentukagar miring (slant agar), yang berguna untuk menyimpan kulturmurni untuk keperluan sub kultur. Ketika medium dalam tabung tidak dimiringkan, saat memadat akan menjadi agar tegak (agardeep tube), yang berfungsi untuk keperluan mempelajari kebutuhan gas mikroorganisme. Sedangkan medium yang diletakkan dalam labu Erlenmeyer, dapat dicairkan dalam waterbath kemudian dituang dalam cawan petri menjadi agarcawan datar (agar plate).

*

Teknik pemindahan secara aseptic.

Mikroorganisme terdapat dimana-mana, oleh karena itu mikroorganisme lain yang tidak dikehendaki dapat masukke dalam biakan murni melalui aliran udara, kontak tangan yang tercemar, atau melalui tersentuhnya media atau permukaan tabungbagian dalam oleh benda yang belum disterilkan. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri dari satu spesies tunggal. Sehingga untuk mencegah mikroorganisme lain yang tidakdikehendaki perlu digunakan teknik aseptik, dimana semuaperalatan maupun media pertumbuhan yang akan digunakan pada teknik ini harus dalam keadaan steril/aseptik. Beberapa metode untuk memindahkan biakan murni dari satu wadah ke wadah yang lain secara aseptik:

*

Metode pemindahan moMetode streak/gores adalah metode memindahkan mikroorganisme dengan cara menggoreskan ujung jarum ose loop pada permukaan media.Metode spread/sebar adalah metode memindahkan mikroorganisme dengan cara meneteskan biakan bakteri lalu disebarkan dengan alat spread dari gelas bentuk L secara merata.Metode pour plate/cawan tuang adalah metode memindahkan mikroorganisme dengan cara meneteskan biakan bakteri kemudian menuangkan larutan nutrient

*

ALAT DAN BAHAN

Alat dan Bahan Pembuatan Media1.Labu Erlenmayer; 2. Pengaduk; 3.Gelas Beaker; 4. Kompor; 5. Kapas; 6. Aluminium foil; 7. Nutrien Agar (NA) 23 gr/l; 8. SDA65 gr/l

*

Alat danBahan Pemindahan Mikroba Secara Aseptik: 1. Lampu Bunsen; 2. Jarum inokulasi loop; 3. Cawan petri berisi media; 4. Tabung reaksi berisi mikroba; 5. Kapas; 6. Alkohol; 7. Korek; 8.Tissue.

*

PROSEDUR KERJA

Pembuatan media:1)Pembuatan Media NA:Menimbang berat media N A dengan menggunakan timbangan analitik. Media NAyang yang diperlukan untuk1 liter air adalah 23 gram, sehingga untuk 125 ml airdigunakan 2,875 gram media NA.Memasukkan media NA pada labu Erlenmeyer, kemudian ditambahkan 125 ml air.3 Memanaskan bahan di atas kompor listrik sambil mengaduksehingga semua bahan terlarut sempurna.4) Menutup rapat labu Erlenmeyer dengan menggunakan kapas, kemudian melapisinya dengan aluminium foil.5) Mensterilkan media dengan autoklaf pada tekanan 1 atm,temperature 121C selama 15 20 menit.6) Memanaskan media kembali, lalu menuangkannya pada cawan petri secara aseptik hingga merata.

*

Pembuatan Media sintetisa)Menimbang berat media SDAdengan menggunakan timbangan analitik. Media SD A yang diperlukan untuk 1 liter air adalah 65 gram, sehingga untuk 125 ml airdigunakan 8,125 gram media SDAb)Memasukkan media SDA. pada labu Erlenmeyer, kemudian ditambahkan 125 ml air.c)Memanaskan bahan di atas kompor listrik sambil mengaduksehingga semua bahan terlarut sempurna.Menutup rapat labu Erlenmeyer dengan menggunakankapas, kemudian melapisinya dengan aluminium foil.Mensterilkan media dengan autoklaf pada tekanan 1 atm,temperature 121C selama 15 20 menit.Memanaskan media kembali, lalu menuangkannya padacawan petri secara aseptik hingga merata.Pemindahan Mikroorganisme secara Aseptik dengan Metode Gores1)Mensterilkan meja kerja dan tangan dengan menggunakanalkohol.2)Membagi bagian bawah cawan petri yang berisi Nutrient Agarmenjadi 4 kuadran dengan menggunakan spidol.

*

3)Membuka tutup cawan petri dengan mulutnya di dekat apiBunsen.4)Memijarkan ujung loop, lalu mendinginkannya .5). Mengambil bakteri dengan cara memasukkan loop pada tabungyang berisi bakteri.6). Menggoreskan ujung loop yang berisi bakteri di atas cawanpetri dimulai dari bagian 1, dilanjutkan ke bagian 2, kemudianbagian 3 dan yang terakhir bagian 4. Selama menggoreskanharus hati-hati agar ujung luoop tidak keluar dari cawan petriataupun merusak media agar.7) Menutup cawan petri, kemudian mengisolasi sekeliling cawan,sehingga cawan tertutup rapat.

*

Media biakan padat*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Kandungan komponen media biakanMedia biakan adalah media yang mengandung nutrisi yang diperlukan oleh mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembang biak.Sel mikrorganisme mengandung unsur C, N, H, O, P sehingga nutrisi nya juga harus menyediakan unsur unsur yang akan digunakan oleh mo untuk membentuk bagian bagian sel. Karbon diperlukan untuk membentuk protoplasma, N diperlukan untuk menyusun DNA,*

Nutrisi mikroorganismeSumber karbon : Pada dasarnya semua molekul yang mengandung karbon dapat dijadikan makanan mo misalnya : plasti, bensin, aspal, pestisida, kayu dan monosakaria. Mo penyebab penyakit biasanya memerlukan sumber karbon dalam molekul sederhana. Mo akan mensintesis enzim yang dapat mendegradasi komponen kompleks (polimer) menjadi komponen yang lebih kecil sehingga dapat larut di dalam media dan dapat masuk ke dalam sel melalui membran sel.

*

Sumber nitrogenNitrogen diperlukan oleh sel untuk membangun protein dan asam nukleat sel. Beberapa mikroorganisme memperoleh nitrogen dari: Udara bebas, nitrogen anorganik seperti garam-garam amonium, beberapa mo memerlukan nitrogen organik seperti : glutamin, asparagin atau cernan peptida.

*

Ion anorganikSemua mo memerlukan fosfat baik sebagai komponen sel mahupun sebagai simpanan energi (ATP, ADP, AMP)Belerang diperlukan oleh kebanyakan mo (bakteri) untuk mensintesisi asam amino yang mengandung belerang (sistein dan metionin). Beberapa kation seperti K+, Ca+2, Mg+2 diperlukan untuk kofaktor untuk enzim tertentu dan harus ditambahkan ke dalam media biakan. Namum kation-kation diperlukan dalam jumlah sangat kecil, sehingga kation-kation yang berasal dari air alam dapat mencukupi kebutuhan kation mo.

*

Kondisi pertumbuhan moDi samping nutrisi yang harus dipenuhi, kondisi lain harus dipenuhi untuk menumbuhkan mo.Medium yang sesuai untuk menumbuhkan mo tidak boleh terlalu asam atau basa : setiap mo mempunyai pH optimum untuk tumbuh. Pada dasarnya semua mo tidak dapat tumbuh pada pH >8 keculai basil kolera. Mo juga tidak bisa tumbuh pada pH asam . Sangat jarang mo dapat tumbuh pada pH

Fungsi buffer (penyangga)HPO4-2 + H+ -----------H2PO4-1Kelebihan asamH2PO4-1 +OH - ------------HPO4-2 + H2OKelebihan basa.*

Contoh media biakan bakteri (Clostridium butyricum)Konsentrasi dalam g/l: peptone, 4.0; L-cysteine, 0.5; NaCl, 3.0; MgCl2, 0.1; FeCl2, 0.1; K2HPO4, 2.5; vitamin cair 10 ml; trace element liquid, 10 ml. Vitamin cair terdiri dari (g/l): glutamic acid, 0.01; ascorbic acid, 0.025; riboflavin, 0.025; citric acid monohydrate, 0.02; folic acid, 0.01; p-aminobenzoic acid, 0.01; creatine, 0.025. The trace element liquid terdiri dari (g/l): MnCl2, 0.01; ZnCl2, 0.05; H3BO3, 0.01; CaCl2, 0.01; Na2MoO4, 0.01; CoCl2 6H2O, 0.2; AlK (SO4)2, 0.01; NiCl2 6H2O, 0.01.*

Suhu biakanMo dapat digolongkan berdasarkan suhu pertumbuhan optimalnya:Psikrofil, Mesofil, Termofil (ekstrem termofil dan hipertermofil).Mo psikrofil (0-25). Mo mesofil (20-40)C. Kedua jenis mo psikrofil dan mesofil merupakan ancaman bagi kesehatan manusia karena pertumbuhan masih bisa berlangsung sampai pada suhu 0 C, sehingga penyimpanan di dalam kulkas tidak menjamin semua mo akan mati.Mo termofil (50-100) C bukan ancaman kesehatan.

*

Bakteri yang mampu hidup dengan sumber kabon anorganik (tanpa karbon organik)Nitrobacter, Nitrosomonas dan Thiobacillus.Ada mo yang tidak dapat mensintesisi enzim yang dapat mengkatalisi pembentukan senyarwa protein tertentu. Mo ini harus disediakan protein yang tidak dapat disintesisi oleh mo tersebut dari luar nisalnya darah sebagai metabolit penting. Metabolit penting lainnya adalah jenis protein: nikotin (niasin), tiamin, riboflavin, asam pantoten dll. Metabolit penting diperlukan untuk ko-enzim pada henis enzim tertentu.*

Asai Vitamin*

KesimpulanBakteri memerlukan nutrien baik untuk mensintesisi protoplasma mahupun untuk penyediaan sumber energi. Namun kemampuan untuk menggunakan berbagai-bagai substansi yang kompleks sebagai sumber nutrien sangat beraneka ragam.Apabila mo ditempatkan pada medium pertumbuhan segar, ada satu fase di mana mo tidak berkembang disebut fase lag (tenggang) atau periode penyesuaian pada lingkungan baru.Kemudian diiukuti dengan pembelahan sel dengan kecepatan konstan (fase eksponensial). Jumlah bakteri yang tumbuh dapat dihitung dengan teknik pengenceran, pengukuran kekeruhan, pengukuran oksigen yang dikonsumsi atau mengukur asam (metabolit sekunder).Mo yang tidak dapat mensintesis salah satu komponen yang diperlukan, harus disediakan dari luar.*

TEKNIK ISOLASI BAKTERI*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

PENGERTIAN ISOLASI MIKROORGANISME

Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Proses pemisahan atau pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Sutedjo, 1996).Jika sel-sel tersebut tertangkap oleh media padat pada beberapa tempat yang terpisah, maka setiap sel atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah, sehingga memudahkan pemisahan selanjutnya (Sutedjo, 1996).

*

Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan secara individu karena terlalu kecil dan tidak tetap tinggal di tempatnya. Akan tetapi bila sel-sel itu dipisahkan dengan cara pengenceran, kemudian ditumbuhkan dalam media padat dan dibiarkan membentuk koloni, maka sel-sel tersebut selanjutnya dapat diisolasi dalam tabung-tabung reaksi atau cawan petri-cawan petri yang terpisah (Sutedjo, 1996).Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam mengisolasi mikroorganisme adalah1. Sifat dan jenis mikroorganisme2. Habitat mikroorganisme3. Medium pertumbuhan4. Cara menginokulasi dan inkubasi5. Cara mengidentifikasi6. Cara pemeliharaannya (Dwidjoseputro, 1998).Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu (Admin, 2008) :

*

IsolasiIsolasi MikroorganismeMikroba di alam selalu tercampurIsolasi mikroba untuk produk yang spesifikSumber mikrobaJenis MikrobaProduk spesifik:Metabolite productsEnzymeTransformation compoundsBiomass

*

Memisahkan bakteri dari campuran mikrobaKultur (spesies) tunggal untuk dipelajari lebih lanjutDua metode konvensional isolasi bakteri:Metode cawan goresMetode cawan tuang

*

*

Isolasi mikroorganismeIsolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Proses pemisahan atau pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Jika sel-sel tersebut tertangkap oleh media padat pada beberapa tempat yang terpisah, maka setiap sel atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah, sehingga memudahkan pemisahan selanjutnya (Sutedjo, 1996).

*

Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan secara individu karena terlalu kecil dan tidak tetap tinggal di tempatnya. Akan tetapi bila sel-sel itu dipisahkan dengan cara pengenceran, kemudian ditumbuhkan dalam media padat dan dibiarkan membentuk koloni, maka sel-sel tersebut selanjutnya dapat diisolasi dalam tabung-tabung reaksi atau cawan petri-cawan petri yang terpisah (Sutedjo, 1996).

*

Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam mengisolasi mikroorganisme adalah

1. Sifat dan jenis mikroorganisme2. Habitat mikroorganisme3. Medium pertumbuhan4. Cara menginokulasi dan inkubasi5. Cara mengidentifikasi6. Cara pemeliharaannya (Dwidjoseputro, 1998).

*

Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu

1) Isolasi pada agar cawanPrinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan metode agar cawan tuang. Metode gores kuadran. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satu sel. Metode agar tuang. Berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (500C), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan atau di dalam cawan. (Admin, 2008) :*

2) Isolasi pada medium cairMetode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.3) Isolasi sel tunggalMetode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.

*

a. Isolasi mikroba dengan cara penggoresanTujuan utama dari penggoresan ini adalah untuk menghasilkan koloni-koloni bakteri yang terpisah dengan baik dari suspensi sel yang pekat. Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tapi memerlukan ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Ada beberapa teknik goresan, antara lain :Goresan TGoresan kuadranGoresan radianGoresan sinambung (Nuniek, 2001).*

*

b. Isolasi mikroba dengan cara penaburanCara penaburan (pour plate) merupakan cara yang kedua di samping penggoresan untuk memperoleh biakan murni dari biakan campuran mikroba. Cara ini berbeda dari cara penggoresan dimana media agar diinokulasi dalam keadaan tetap cair yaitu pada suhu 450C, dan demikian pula koloni-koloni akan berkembang di seluruh media, tidak hanya pada permukaan. Untuk beberapa tujuan hal ini menguntungkan, contohnya dalam mempelajari pertumbuhan koloni streptococcal pada sel-sel darah merah. Supaya koloni yang tumbuh dalam cawan tidak terlalu banyak ataupun sedikit maka contoh diencerkan hingga beberapa kali pengenceran dan ditaburkan pada beberapa cawan (Nuniek, 2001).

*

Khusus ntuk isolasi khamir dan jamur dikenal beberapa teknik inokulasi yaitu :1. Teknik pengenceran2. Teknik Hansen3. Teknik Lindner4. Mikromanipulator

*

Membuat media biakan mikroorganisme.

Pembiakan sel memerlukan suatu media sebagai tempat hidupnya yang disebut dengan medium kultur dan media biakan (Tortora, 2001). Suatu medium kultur yang baik harus memiliki komposisi yang lengkap antara lain harus berisi zat hara serta memiliki kondisi lingkungan yang mendukung dan sesuai kondisi in vivo sel yang akan dikultur. Pembuatan media kultur sel didasarkan pada fungsi, komposisi media, dan konsistensinya sehingga dalam kultur yang dilakukan sel dapat tumbuh dengan baik dan sesuai dengan yang diaharapkan*

Kulturisasi bakteri untuk keperluan yang bermanfaat, pada umumnya dilakukan dengan biakan murni. Biakan murni hanya mengandung satu jenis. Untuk mengisolasi bakteri dalam biakan murni, umumnya digunakan dua prosedur yaitu metode agar cawan dengan goresan dan metode agar tuang*

Mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang biak pada suatu medium yang mengandung unsur unsur yang diperlukan oleh mikrooranisme. Komposisinya medium harus sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme yang bersangkutan. Ada sebagian mikroorganisme yang memerlukan nutrien lebih tinggi dibandingkan dengan lainnya. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber karbon organik seperti gula. Hal penting yang harus diperhatikan, adalah unsur unsur yang ada di dalam media biakan harus dapat larut di dalam air. Media biakan harus mengandung : air, karbon, hidrogen, oksigen mineral dan faktor tumbuh.*

Fase biakanBerdasarkan konsistensi atau kepadatannya, medium dibagi menjadi tiga jenis, yaitu :a. Medium cair atau broth (kaldu)Contoh : air pepton, nutrient broth, laktosa b. Medium setengah padat (semi solid medium)Contoh : sim agar, cary dan brain agarc. Medium padat (solid medium)Contoh : endo agar, PDA, Nutrient agar

*

Perlakuan mediaYang dimaksud media pada dan semi padat adalah media cair yang ditambah dengan agar agar 1,5%-1,8% berat. Medium semi solid kadarnya setengah dari medium padat.Semua peralatan yang akan digunakan harus disterilisasi agar tidak ada mikroorganisme lliar yang masih hidup yang menempel di peralatan ketika digunakan.Sterilisasi adalah pemanasan bahan atau alat alat pada tekanan 2 atm, suhu 121oC selama 30 menit di dalam panci bertekanan atau autoclave (sterilisasi basah). Sterilisasi kering pemanasnya menggunakan oven.

*

Contoh komposisi media pertumbuhan Clostridium butyricum (bakteri penghasil hidrogen).Konsentrasi dalam g/l: peptone, 4.0; L-cysteine, 0.5; NaCl, 3.0; MgCl2, 0.1; FeCl2, 0.1; K2HPO4, 2.5; vitamin cair 10 ml; trace element liquid, 10 ml. Vitamin cair terdiri dari (g/l): glutamic acid, 0.01; ascorbic acid, 0.025; riboflavin, 0.025; citric acid monohydrate, 0.02; folic acid, 0.01; p-aminobenzoic acid, 0.01; creatine, 0.025. The trace element liquid terdiri dari (g/l): MnCl2, 0.01; ZnCl2, 0.05; H3BO3, 0.01; CaCl2, 0.01; Na2MoO4, 0.01; CoCl2 6H2O, 0.2; AlK (SO4)2, 0.01; NiCl2 6H2O, 0.01.*

*