Novita Ella Wahyuni

12/329677/BI/08798

Mikrobiologi Bahan Makanan

Metode Kimiawi Identifikasi Mikrobia

Telah dikembangkan metode baru menggunakan substrat sintetik khromogenik-

fluorogenik. Prinsip dasar metode ini yaitu mendeteksi ensim-ensim spesifik yang dihasilkan

oleh bakteri-bakteri yang ada dalam kelompok koli maupun yang hanya dihasilkan oleh E

coli. Ensim spesifik dari bakteri ini akan menghidrolisa substrat dan melepaskan aglikon

yang bersifat khromogen (berwarna) atau fluorogen (berfluorosensi). Dengan metode ini

proses identifikasi dan kuantifikasi mikroba dapat dilakukan secara cepat dan akurat pada

media primair. Kombinasi substrat khromogenik-fluorogenik dapat mengeliminasi kebutuhan

sub kultur dan rangkaian uji biokimia. Enzim spesifik yang dapat dideteksi dengan substrat

khromogenik-fluorogenik contohnya : α-D Galactosidase pada kelompok bakteri koli, α -D-

Glucuronidase pada bakteri E coli, aminopeptidase pada familia Enterobacteriaceae dan 4-

methylumbelliferyl-N-acetyl-â-galactosaminide pada Candida (Abelson et al, 1997).

Umumnya substrat khromogenik merupakan turunan fenol, dan substrat fluorogenik

merupakan turunan coumarin terdiri dari:

1. Pewarna fluorogenik, yang akan meningkatkan fluorosensi akibat adsorbansi pewarna

fluoroscent pada DNA atau protein sel bakteri. Contoh: α -aniline-1- naphthalene-sul-

phonic acid (ANS) dan Acridine-orange.

2. Indikator pH-fluoroscent, yang merubah intensitas fluorosensi atau absorbansi

indikator pH akibat adanya aktivitas ensimatik. Contoh : acridine dan 7-

Hydroxycoumarin.

3. Ensim-substrat kompleks. Ensim bakteri akan menghidrolisa substrat dan melepaskan

yang dideteksi dari terbentuknya warna atau fluorosensi. Contoh: o- atau p-Nitrophe-

nol; 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ; 4-Methylumbelliferone-.

1

Bagaimanakah metode pengukuran adenin trifosfat?

Penentuan jumlah angka mikroorganisme sangat penting dilakukan untuk menetapkan

keamanan suatu sediaan farmasi dan makanan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk

menghitung jumlah mikroorganisme baik dengan menghitung jumlah sel, massa sel, atau isi

sel yang sesuai dengan jumlah sel. Terdapat empat macam cara umum untuk memperkirakan

besar populasi mikroorganisme, yaitu perhitungan langsung, pengukuran langsung,

perhitungan tidak langsung, dan perkiraan tidak langsung. Salah satunya dengan perkiraan

tidak langsung (indirect estimate) yang digunakan untuk mengukur biomassa

mikroorganisme. Biomassa mikroorganisme diperkirakan dengan cara mengukur komponen

biokimia sel mikroorganisme yang relatif konstan, seperti protein, adenosin trifosfat (ATP),

lipopolisakarida (LPS), murein, dan klorofil. Biomassa juga dapat diperkirakan secara tidak

langsung dengan mengukur kekeruhan. Perkiraan tidak langsung biomassa mikroorganisme

dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan membandingkannya pada kurva standar

(Harmita 2006).

Gambar 1. Struktur kimia adenin trifosfat

Adenosin trifosfat (ATP) adalah molekul yang berfungsi sebagai sumber energi

universal untuk reaksi seluler, sebuah nukleotida (unit struktural dasar asam nukleat – DNA

atau RNA) yang terdapat dalam jaringan organisme. Diasumsikan bahwa setiap sel

mengandung ATP yang nantinya akan hilang seiring dengan kematian sel. sehingga dasar ini

dapat dijadikan parameter untuk pengukuran kuantitas sel. adanya reaksi antara ATP dengan

luciferin dikatalisasi oleh enzim luciferase adalah prinsip metode bioluminescence.

Satu foton cahaya diproduksi per molekul ATP yang dihidrolisis, proses ini dapat

diukur dengan menggunakan fotometer (Hobson et al., 1996). Cahaya yang dipancarkan

adalah sebanding dengan jumlah ATP yang tersedia. Dengan mengetahui konsentrasi ATP

dalam sampel, maka mikrobia yang ada dapat diestimasi. Dalam beberapa kasus terdapat

variasi nukleotida adenin seperti ATP, ADP, dan AMP maka nilai ATP yang dihitung adalah

konsentrasi totalnya. Secara umum tes berbasis luminescence untuk mendeteksi bakteri yang

ini lebih baik dibandingkan dengan metode konvensional. Karena metode ini menggunakan

2

gen reporter sehingg memungkinkan selektif pencacahan sel yang valid (Billard dan DuBow,

1998).

Daftar Pustaka

Abelson, J., Simon, M., Brand, L., and Johnson, M. 1997. Fluorescence Spectroscopy.

Methods in Enzymology, Vol. 278. Brand, L., and Johnson, M. L., Eds. Academic

Press.

Billard, P., and DuBow, M. S. 1998. Bioluminescence-based assays for detection and

characterization of bacteria and chemicals in clinical laboratories. Clin. Biochem.,

31(1): 1-14.

Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Hayat. Jakarta: Kedokteran EGC. Ed. ke-3.

Hobson, N. S., Tothill, I., and Turner, A. P. F. 1996. Microbial detection. Review article.

Biosens. Bioelectr. 11(5): 455-477.

3