Algoritme Diagnosis Infeksi DETEKSI AGENT atau RESPON IMUN SPESIFIK? antibodyInfections DIAGNOSIS INFEKSI DIAGNOSIS INFEKSI 1. Deteksi agen infeksi langsung: 1. Mikroba utuh (keseluruhan) : 1. Pemeriksaan mikroskopik 2. KUltur 2. Bagian dari mikroba: 1. Antigen 2. Toksin 3. DNA 2. Deteksi respon imun spesifik (Antibodi) Jenis jenis Mikroskop 1. Mikroskop sinar 2. Mikroskop medan gelap 3. Mikroskop elektron Mikroskop Sinar Rutin digunakan di bidang mikrobiologi Pembesaran maksimal 1.000x Mikroskop Medan Gelap Pembesaran maksimal 1.000x mikroba hidup dan sulit dicat Lensa obyektif Bermanfaat untuk Minyak emersi Kondensor dengan reflektor Hasil Pengamatan Mikroskop Medan Gelap Electron Microscope Electron Gun Pembesaran ratusan ribu jutaan x Bermanfaat untuk mikroba ukuran sangat kecil (virus, chlamydia) Condenser Specimen Transmitted Scanning Objective Intermediate Image Projector Final Image Pemeriksaan Mikroskopik 1. Preparat basah (tanpa cat, cat sederhana): 1. Tanda infeksi: lekosit? 2. Untuk mikroba ukuran besar: protozoa, fungi 3. Untuk pengamatan mikroba hidup (gerak protozoa 2. Preparat kering: Pengecatan Preparat Basah, Jenis dan Manfaat: 1. Preparat basah + deck glass (tetes gantung) Banyak digunakan pada kasus keputihan dapat melihat gerakan mikroba:. protozoa, Trichomonas 2. Preparat + cat sederhana: KOH: melihat jamur dari kerokan kulit, kuku: LPCB: melihat jamur Tinta parker: melihat yeast cell (Pytirosporum ovale) Preparat Tetes Gantung Preparat basah + cat sederhana Penicillium sp + LPCB Ccccidiodes immitis + KOH Preparat segar Trichomonas PENGECATAN (STAINING) PENGECATAN (STAINING) Keuntungan: Cepat Murah Bahaya infeksi Kerugian: Identifikasi maksimal hanya sp tingkat genus: Kurang spesifik Kurang sensitif Pegamatan mikroskopis meliputi: Pegamatan mikroskopis meliputi: 1. Kondisi preparat 2. Mikroba: 1. Bentuk 2. Ukuran 3. Susunan (aransemen sel) 4. Rx. Pengecatan 5. Bangunan khusus (kalau terlihat): kapsul, spora, flagel, granula Klasifikasi Pengecatan: Klasifikasi Pengecatan: 1. Pengecatan sederhana: hanya menggunakan satu bahan cat. 1. Pengecatan sederhana positif 2. Pengecatan sederhana negatif 2. Pengecatan komplek: mengunakan lebih dari satu bahan cat. 1. Pengecatan differensial: Gram, Ziehl-Neelsen 2. Pengecatan khusus Langkah dan Bahan Pengecatan: 1. Fiksasi: melekatkan preparat pd obyek gelas Umumnya digunakan cara fisik (pemanasan) 2. Cat: Lebih dari satu pada pengecatan komplek (cat I dan cat ke II) 3. Mordant: penguat cat utama 4. Decolorator/peluntur: sangat menentukan dlm pengecatan komplek Peluntur sederhana: air, utk membersihkan kelebihan cat Langkah Pengecatan: 1. Bersihkan slide 2. Ratakan preparat 3. Melekatkan preparat dg api 4. Genangi dg cat PENGECATAN SEDERHANA 1. Pengecatan Sederhana Positif menggunakan cat basa bereaksi dengan protoplasma bakteri yang bersifat asam (misalnya asam nukleat) yang bermuatan negative. Contoh cat: Methylen Blue, Carbol fuchin, safranain, gentian violet. PENGECATAN SEDERHANA 2. Pengecatan Sederhana Negatif menggunakan cat asam, kuman tidak tercat. Jadi yang terlihat adalah daerah transparan yang merupakan daerah kuman dengan latar belakang sesuai warna cat. Terutama untuk organisme yang sulit dicat (spirochaeta), kapsul Contoh cat: nigrosin, Congo red, India ink, Burrie Langkah pengecatan Burrie Hasil pengecatan sederhana + dan Hasil Pengecatan Sederhana: Bacillus Methylen Blue Klebsiella Burrie Pengecatan Gram: Hasil pengecatan Gram tergantung susunan dinding selnya. bahan-bahan : 1. Gram A: Carbol gentian violet .warna ungu (cat I) 2. Gram B: Lugol .mordant 3. Alkohol absolute .peluntur 4. Safranin/basic fuscin .warna merah (cat II) Hasil: Kuman Gram positif: tercat ungu dengan latar belakang merah. Kuman Gram negative tecat merah dengan latar belakang merah. POSES PENGECATAN GRAM BAKTERI GRAM + BAKTERI GRAM -Carbol gentian violet Lugol Alkohol Absolut Safranin Hasil Pengecatan Gram Streptococcus Gram + Neisseria Gram -Pengecatan Tahan Asam (Ziehl-Neelsen) Kuman tahan asam mempunyai lapisan lilin (40% berat kering kuman) Bahan-bahan sbb.: 1. Carbol fuchin (cat I) (dipanaskan) .warna merah 2. Alkohol asam .peluntur 3. Methylen blue (cat II) .warna biru Hasil: Kuman Tahan Asam: tercat merah dengan latar belakang biru. Kuman Tidak Tahan Asam tecat biru dengan latar belakang biru Kinyoun-Gabbet: tanpa panas POSES PENGECATAN Tahan Asam (ZN) BAKTERI Tak Tahan Asam BAKTERI Tahan Asam Carbol fuschin (dipanaskan) Alkohol Asam Methylen Blue Hasil Pengecatan ZN: Mycobacterium tuberculosis Acid-fast stain. 1000X magnification. Pengecatan Khusus 1. Pengecatan Kapsul (Gins-Burrie) 2. Pengecatan Spora (Schaefer-Fulton) 3. Pengecatan Granula: Granula metachromatik (Neisser) Granula polisakarida Iodine hitam Granula glycogen Iodine coklat Granula lemak Sudan III kuning 4. Pengecatan jamur: KOH mount . Lactophenol Cotton Blue Calcofluor white 5. Pengecatan Fluorescence Dapat berikatan dengan berbagai protein termasuk antigen dan antibody deteksi tehnik imunomikroskopi (direct indirect) 6. Pengecatan inti Fuelgen 7. Flagel: Leifson 8. Wright Giemsa: organisme intra seluler, mis.: Histoplasma capsulatum, Lishmania, inclusion bodies. Pemeriksaan Kultur Merupakan gold standard pemeriksaan mikrobiologi Kelebihan: Sensitif Spesifik: deteksi sp tk spesies Langsung dapat dilakukan tes sensitivitas Antibiotik Kerugian: Waktu lama Bahaya infeksi: Minimal laboratorium BSL-2 Langkah kultur: Spesimen bakteri sedikit (darah, LCS) Spesimen bakteri banyak (sputum, feces, swab) Media Penyubur ISOLASI MEDIA PADAT (KOLONI) Tes Biokimia Tes Sensitivitas Antibiotik Spesies bakteri Sensitivitas Bakteri thd Antibiotik ISOLAT DAN TES SENSITIVITAS ISOLAT DAN TES SENSITIVITAS General, selective and differential medium gram-negative identification Semi-automated systems for identification of microorganisms The API 20E System The Enterotube II System Enterobacteriaceae Identification: Enterobacteriaceae Identification: Automated systems for identification of microorganisms VITEK 2 Microbact-24E MALDI-TOF mass-spectrum MicroSEQ Tes Biokimia metode API Kultur patogen intra-seluler obligat: Contoh: virus, chlamydia, ricketsia Media sel hidup: 1. Telur + Embrio ayam 2. Binatang percobaan 3. Kultur sel/jaringan Purnomo Hadi, Mikrobiologi FK UNDIP DIAGNOSIS IMUNOLOGIS Dasar & Jenis dx imunologis Dasar: reaksi spesifik antara antigen dan antibodi Tergantung tujuannya, dibagi: 1. Deteksi antigen: : perlu punya antobodi yg sudah diketahui 2. Deteksi antibodi: perlu punya antigen yg sudah diketahui. Y Y Deteksi antigen Deteksi antibodi Tehnik pemeriksaan imunologi 1. Aglutinasi 2. Prsepitasi 3. RIPA: Radio immunoprecipitation assay 4. Fiksasi komplemen 5. Netralisasi 6. EIA -Elisa 7. RIA 8. Western blot 9. RIBA: Recombinant immunoblot assay 10. Immunofluorecens 11. Immunohistochemistry Deteksi antigen: Kelebihan: Cepat Merupakan dx etiologis Bukti kuat adanya infeksi yg sedang terjadi Kekurangan: Deteksi agen hidup maupun mati Spesivitas? tgt tehnik yg digunakan Sensitivitas? harus memilih spesimen yg mengandung agen Immuno-fluorescence assay: Figure 3. Specimen of Lung Tissue from the Index Patient's Mother. Immunohistochemical analysis of the specimen shows interstitial pneumonitis and a single epithelial cell containing intranuclear influenza A viral antigens (red) and an antinucleocapsid antibody. Antigen detection: Immunocyto-chemistry Deteksi antibodi: Kelebihan: Cepat Spesimen mudah/melimpah Kekurangan: Spesivitas? tgt tehnik yg digunakan Merupakan pemeriksaan respon imun hati-hati dalam interpretasi: IgM atau IgG? Masih infeksi / Post infeksi / post vaksinasi? RESPON PRODUKSI ANTIBODI Ig G dan Ig M OLEH ADANYA INFEKSI ELISA RAPID TEST Direct Indirect Sandwich tests: Western Blot Western Blot Purnomo Hadi, Mikrobiologi FK UNDIP DIAGNOSIS MOLEKULER RFLP: Restriction Fragments Length Polymorphism Restriction endonuclase s: enzimes that cleavage the DNAs chain at specific sequence of nucleotide base Nucleic Acid Hybridization Probes Principles: Two different nucleic acids can hybridize by uniting at their complementary regions: Adenine with Thymine Guanine with Cytosine Adenine with Uracil All different combinations are possible: Single-stranded DNA can unite with other singlestranded DNA or RNA, and RNA can hybridize with other RNA. Nucleic Acid Hybridization Probes Methods Direct hybridization rapid hybridization Southern blot hybridization (with electrophresis) FISH: Fluorescent (or enzyme) in situ hybridization (intact cells or tissues, primarily RNA molecule), observed microscopically Direct hybridizati on Southern blot hybridization DNA Sequencing Analysis of DNA by its size, restriction patterns, and hybridization characteristics is instructive Dideoxynucleotide will cut the chain elongation process that occurs during the DNA polymerase Automated DNA sequencing PCR: Polymerase Chain Reaction Prinsip: Megamplifikasi/memperbanyak asam nukleat Keuntungan: Sensitif Spesifik Deteksi agen Waktu cepat Tanpa kultur, risiko infeksi kecil, dapat digunakan untuk mikroba yg tidak dapat atau terlalu berbahaya kalau dikultur PCR: Kekurangan: Mudah kontaminasi: ruangan steril, terbagi-bagi Deteksi agen sudah mati Relatif mahal: alat, reagen Sumber daya manusia Reagen: DNA/RNA target (spesimen) Primer Enz Taq polymerase Buffer dNTPs Instruments Thermocycler: konvensional atau real time Electrophoresis kits: untuk konvensional Denaturation 1 (95oC) 95oC Annealling (55oC) N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN & Sintesis (70OC) Denaturation 2 (94oC) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 94oC 94oC The next annealing & sintesis Result: 4 base pairs RTPCR menggunakan gel elektroforesis pada sampel AI H5N1 terdeteksi H5N1 tidak terdeteksi Purnomo Hadi 86 H5 HA Real-Time RT-PCR RNP H5 A H5 HA Real-Time RT-PCR RNP H5 A MICROBIOLOGICAL DIAGNOSTIC METHODS APPLICATION MICROBIOLOGICAL DIAGNOSTIC METHODS APPLICATION Dengue infection .. HIV DIAGNOSTIC STRATEGY TBC TBC HZV Oral candidiasis PCP OHL Cryptococcus diarrhea Cryptococcus meningitis PPE CMV MAC