DETEKSI ANTIGEN RABIES PADA JARINGAN OTAK

DENGAN METODE FLUORESCENT ANTIBODY TECHNIQUE (FAT)

1. PRINSIP

Organ target virus penyebab penyakit rabies adalah jaringan sistem syaraf pusat (SSP) otak (khususnya, cerebellum, hipokampus, brain stem, Ammons horn, thalamus, cerebral cortex dan medulla oblongata). Hewan yang menunjukkan gejala klinis rabies atau mati akibat penyakit rabies, banyak ditemukan antigen virus rabies di dalam air liur, air mata dan jaringan otak. Dalam otak, antigen virus rabies terdapat dalam jumlah yang sangat banyak terutama pada thalamus, pons dan medulla. Organ lain, seperti gld salivarius memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang bervariasi. Jaringan yang direkomendasikan untuk dikoleksi dan diuji adalah pool dari jaringan otak dan batang otak (brain stem).

Identifikasi agen infeksi atau diagnosis rabies menggunakan fluorescent antibody test (FAT), yang direkomendasikan oleh WHO dan OIE, karena sensitif, spesifik, dan akurat. Uji FAT merupakan uji gold standard yang digunakan secara langsung pada preparat ulas (smear). Immunoglobulin murni terhadap virus atau protein nukleokapsid rabies yang sudah dilabel dengan fluorescein isothiocyanat (FITC) ditambahkan ke preparat ulas/tekan dari sampel otak yang sudah difiksasi menggunakan aseton. Agregat protein nukleokapsid diidentifikasi dengan adanya fluoresens spesifik dari ikatan antara konjugat dan protein nukleokapsid (antigen /Ag antibody/ Ab) tersebut, saat dilihat di bawah mikroskop FAT berwarna hijau apel yang berpendar dengan intensitas dan bentuk bervariasi.

2. PERALATAN2.1 Gunting dan pinset

2.2 Gelas obyek/ gelas slide2.3 Gelas penutup

2.4 Inkubator 370C

2.5 Mikroskop FAT ( Olympus / Nikon )2.6 Cawan petri2.7 Lemari pendingin ( Kulkas )2.8 Gelas beajer 2.9 Pipet Pasteur Spuit 1 ml3. BAHAN / REAGENSIA / PEREAKSI3.1 PBS pH 7,43.2 Aseton absolut dingin3.3 Aquades

3.4 Larutan evans blue 1:20003.5 Buffer gliserin 50% (mounting media)3.6 Konjugat Rabies (Biorad), antibodi spesifik terhadap virus rabies dilabel FITC

3.7 Jaringan otak kontrol positif3.8 Jaringan otak kontrol negative

4. PROSEDUR KERJA4.1 Pembuatan preparat/ slide tekan : 4.1.1 Buat lingkaran pada gelas obyek yang akan digunakan untuk membuat preparat tekan dengan menggunakan grafir intan

4.1.2 Tulis nomor / kode spesimen pada ujung preparat

4.1.3 Letakkan sampel pada cawan petri dan potong bagian otak (hipokampus, medulla, pons) dan letakkan pada paper towel / kertas minyak4.1.4 Tempelkan gelas obyek pada potongan otak, dimulai dari lingkaran yang dekat dengan nomor specimen, lalu tekan yang kuat. Lakukan hal yang sama pada lingkaran yang satunya. Pindahkan pada kertas towel dan tekan yang sama di atas beberapa kali agar mendapatkan preparat tekan yang tipis. Preparat dikering-anginkan sejenak4.1.5 Buat preparat kontrol positif rabies seperti di atas

4.1.6 Preparat difiksasi dalam asetone absolut dingin pada suhu -20oC selama 30 menit dan dikering-anginkan kembali

4.1.7 Susun preparat dalam cawan petri besar yang telah dialasi kertas saring basah (untuk menjaga kelembaban)

4.1.8 Tetesi preparat (0,1 ml) dengan konjugate rabies yang sudah dilarutkan dengan pelarut konjugat pada lingkaran yang sudah tersedia.

Rekomendasi : U/ memperoleh hasil yang lebih kontras dan lebih baik Fluorescentnya serta mendeteksi sample yang positif lemah / Low Positif, dianjurkan konjuget Biorad dicampur dengan Evans Blue 1 % dengan pernbandingan :

0,1 ml Evans Blue 1 % dicampurkan dengan 2 ml konjuget Biorad.

Cara Pembuatan Evans Blue 1 % ( Stock / 1 : 2000 ) ;

Ambil 1 gram Evans blue dicampur 99 ml Aquadest / Aquabidest steril ( Stock 1 % Evans Blue )

Simpan dilemari es / refrigerator suhu 4 8 C4.1.9 Inkubasikan dalam inkubator selama 30 menit pada suhu 37OC.

4.1.10 Cuci dan rendam dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit sebanyak 2 (dua) kali lalu dikering- anginkan

4.1.11 Beri 1 tetes buffer gliserin 50% sebagai mounting medium, lalu diberi gelas penutup 4.1. 12 Periksa di bawah mikroskop FAT dg kebesaran 40x5. PENETAPAN HASIL

5.1 Agregat protein nukleokapsid virus Rabies diidentifikasi dengan adanya fluorescens spesifik dari ikatan antara protein nukleokapsid virus rabies dan konjugat, maka sampel dinyatakan Positif Rabies. Agregat akan berwarna hijau apel dan bervariasi intensitas serta bentuknya.

5.2 Protein non antigen terlihat berwarna keputihan dan latar belakang memberikan warna merah.

6. DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2010, Procedures for Rabies and Lyssavirus Diagnosis Including Rabies Fluorescent Antibody Test (FAT) and Virus Isolation, Australian Animal Health Laboratory, CSIRO Livestock Australia, p. 1-18

Anonim, 2011, Rabies, In OIE Terrestrial Manual, Office International des Epizooties (OIE). Pp. 1-20

Anonim, 2010, Manual instruction of anti-rabies nucleocapsid conjugate, Biorad

Uji FAT Positif Rabies Sampel Otak (hipokampus)

(i) Evans Blue (ii) tanpa Evans Blue

_1408942718.ppt

Uji FAT Negatif Rabies sampel Otak (hipokampus)

(i) Evans Blue (ii) tanpa Evans Blue