25

III. METODE PENELITIAN

3.1. Bahan dan Alat

Beras merah yang digunakan dalam penelitian ini merupakan beras yang

telah disosoh dan dikumpulkan dari beberapa daerah yaitu dari Nusa Tenggara

Timur sebanyak 2 jenis (galur) yaitu pare laka dan are dota, jati luwih asal Bali,

aek sibundong asal Balai Penelitian Padi Sukamandi, beras bandung asal

Bandung, beras raja hitam dan ratu merah asal Tangerang, beras ujung kulon asal

Ujung Kulon, beras halimun asal Gunung Halimun, beras sirampong dan jowo

melik asal Yogyakarta.

Rimpang kencur dan jahe didapatkan dari Unit Konservasi Budidaya

Biofarmaka Pusat Studi Biofarmaka LPPM-IPB Cikabayan Bogor. Gula jawa

didapatkan dari Desa Tegal Arum Kecamatan Sempu Banyuwangi Jawa Timur.

Bahan tambahan pangan lain sebagai pelengkap minuman beras kencur

didapatkan dari pasar swalayan terdekat. Minuman beras kencur sebagai

pembanding merupakan minuman komersial 1 (tetrapack) dan komersi 2 (instan)

yang didapatkan di swalayan terdekat dengan masa kadaluarsa lebih dari 10 bulan,

sedangkan minuman komersial 3 (tradisional) merupakan minuman tradisional

yang dibeli dari pasar tradisional.

Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis adalah radikal bebas stabil

DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), metanol, etanol, HCl, larutan besi (II)

klorida, larutan buffer sodium asetat, larutan buffer asam asetat, larutan buffer

potassium klorida, akuades, asam askorbat, asam tanat, pereaksi Folin-Denis,

potassium ferisianida dan ferric klorida.

Alat-alat yang digunakan untuk mendapatkan ekstrak jahe dan kencur

adalah blender. Baskom, pisau, talenan dan panci digunakan untuk

mempersiapkan bahan baku. Botol kaca, pipet tetes dan neraca analitik digunakan

untuk membuat formulasi minuman.

Alat-alat yang digunakan untuk analisis adalah oven, pH meter,

refraktometer, chromameter, mikropipet, spektrofotometer UV-Vis dan peralatan

gelas untuk analisis.

26

3.2. Metode

Penelitian ini dibagi menjadi lima tahap, yaitu penelitian 1) karakteristik

sifat fisikokimia beras merah, 2) ekstraksi dan analisis kandungan total fenol, total

flavonoid, dan aktivitas antioksidan beras merah, 3) formulasi minuman beras

kencur berbasis beras merah, 4) karakteristik minuman beras kencur formula

terpilih, dan 5) pengamatan stabilitas minuman beras kencur formula terpilih.

Diagram alir metodologi penelitian selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 17

dan 18

3.2.1. Karakteristik sifat fisiko kimia beras merah

Karakteristik sifat fisikokimia beras merah terdiri dari dua analisis yaitu

analisis warna untuk analisis fisik dan analisis proksimat untuk analisis kimia

beras merah. Metode analisis warna dan proksimat sebagai berikut:

3.2.1.1. Analisis warna, Metode Hunter (Hutching, 1999)

Analisa dilakukan dengan menggunakan alat Minolta Chroma Meters.

Pada prinsipnya, Minolta Chroma Meters bekerja berdasarkan pengukuran

perbedaan warna yang dihasilkan oleh permukaan sampel. Pengukuran

dilakukan dengan meletakkan sampel di dalam wadah sampel berukuran

seragam (misalnya cawan petri). Selanjutnya dilakukan pengukuran nilai L,

a, dan nilai b terhadap sampel. Nilai L menyatakan parameter kecerahan

(lightness) yang mempunyai nilai dari 0 (hitam) sampai 100 (putih). Nilai a

menyatakan cahaya pantul yang menghasilkan warna kromatik campuran

merah-hijau dengan nilai +a (positif) dari 0–100 untuk warna merah dan

nilai –a (negatif) dari 0–(-80) untuk warna hijau. Nilai b menyatakan warna

kromatik campuran biru-kuning dengan nilai +b (positif) dari 0–70 untuk

kuning dan nilai –b (negatif) dari 0–(-70) untuk warna biru. Selanjutnya

dihitung °Hue dari nilai a dan b yang diperoleh dengan persamaan °Hue =

arc tan (b/a) (Tabel 3).

3.2.1.2. Analisis proksimat (AOAC 1995)

Kadar air (%) diukur dengan metode oven. Kadar protein (%) diukur

dengan metode mikro-kjeldahl. Kadar lemak diukur dengan metode

ekstraksi soxhlet; kadar abu/mineral (%) dengan tanur; total karbohidrat (%)

dengan metode By Difference.

27

Tabel 1 Deskripsi warna berdasarkan °Hue

°Hue [arc tan (b/a)] Deskripsi warna

18 – 54 Red (R)

54 – 90 Yellow Red (YR)

90 – 126 Yellow (Y)

126 – 162 Yellow Green (YG)

162 – 198 Green (G)

198 – 234 Blue Green (BG)

234 – 270 Blue (B)

270 – 306 Blue Purple (BP)

306 – 342 Purple (P)

342 – 18 Red Purple (RP)

3.2.2. Ekstraksi, Analisis Senyawa dan Aktivitas Antioksidan Beras Merah

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan pelarut terbaik dalam

mengekstraksi beras merah, mengetahui kandungan kelompok senyawa polifenol

dan flavonoid, dan mengetahui aktivitas antioksidan beras merah. Hasil penelitian

ini akan didapatkan pelarut terbaik dan beras merah terbaik yang akan digunakan

dalam formulasi minuman beras kencur berbasis beras merah. Metode analisis

yang digunakan pada tahap penelitian ini sebagai berikut:

3.2.2.1 Ekstraksi (Chotimarkron et al, 2008).

Sebanyak 5 g tepung beras diekstrak 5 kali masing-masing dengan 10 mL

metanol, etanol dan air selama 30 menit dengan shaker. Supernatan

dievaporasi dalam kondisi vakum pada suhu 40oC hingga kering. Ekstrak

kering ini kemudian dilarutkan dengan methanol untuk selanjutnya

dianalisis.

3.2.2.2 Uji Kuantitatif Polifenol ( Shahidi dan Naczk, 1995).

Sebanyak 1 ml sampel (diencerkan 2-4x dengan akuades) ditambahkan

kedalam pereaksi Follin-Ciocalteau sebanyak 1 mL dan diinkubasi pada

ruang gelap suhu kamar selama 5 menit. Kemudian ditambahkan 0,25 mL

Na2CO3 (60g/L) dan 1.75 mL akuades. Setelah dilakukan inkubasi pada

ruangan gelap suhu kamar selama 30 menit dilakukan pembacaan absorbasi

dengan spektrofotometer pada λ 760 nm. Hasil pengukuran total fenol

28

dihitung berdasarkan kesetaraan dengan asam tanat yang dinyatakan dalam

mg per gram EAT (ekivalen asam tanat)

3.2.2.3. Uji Kuantitatif Flavonoid (Shen et al, 2009 ):

Sebanyak 0.5 ml ekstrak atau larutan standar dipipet kedalam tabung

reaksi 15 ml, 2 ml air bidestilasi ditambahkan kedalam tabung reaksi dan

dicampur dengan 0.15 ml 5% NaNO2. Setelah 5 menit ditambahkan 0.15%

AlCl3.6H20 lalu didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit ditambahkan

NaOH 1 M sebanyak 1 ml dan didiamkan selama 15 menit. Kemudian

diukur pada panjang gelombang 415 nm. Total flavonoid dihitung

berdasarkan kesetaraan dengan standar kuercetin yang dinyatakan dalam mg

per gram EK (ekivalen kuercetin).

3.2.2.4. Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH (Nikolova dan

Dzhurmanski, 2009).

Sebanyak 3 ml ekstrak dengan konsentrasi 1000, 600, 300, 100, dan 50

µg/mL ditambah dengan 1 mL larutan DPPH (2,2’-diphenyl-1-

picrylhydrazyl) 0.3mM dalam methanol dan dilakukan pengocokan dengan

menggunakan vortex. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30

menit. Absorbansi sampel dibaca pada panjang gelombang 517 nm. Persen

inhibisi dihitung berdasarkan persamaan ((Ablanko- Asampel)/Ablanko)x100%.

Nilai IC50 dihitung berdasarkan persamaan regresi sigmoid non-linier

menggunakan hasil persen inhibisi dan konsentrasi. IC50 menunjukkan nilai

konsentrasi sampel yang diperlukan untuk menghambat 50% radikal bebas

DPPH

3.2.2.5 Uji aktivitas antioksidan metode FRAP (Benzie dan Strain,

1996).

FRAP (ferric reducing ability of plasma) reagen dibuat dengan

mencampurkan 0.1 mol/L buffer asetat (pH 3,6), 10 mMol/L TPTZ, dan 20

mmol/L besi klorida (10:1:1 v:v:v). 4,5 ml reagen, 450 µl air dan 150 µl

sampel dicampurkan kedalam tabung reaksi dan diinkubasi 37° C selama 30

menit, sedangkan blank sampel digunakan 4,5 ml reagen dan 600 µl air.

Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 593 nm.

29

Aktivitas antioksidan metode FRAP dihitung berdasarkan kesetaraan

dengan standar FeCl3 yang dinyatakan dengan µmol Fe(II) per gram.

3.2.3. Formulasi minuman beras kencur berbasis beras merah

Formulasi awal untuk megetahui berapa banyak total bahan penyusun

minuman beras kencur berbasis beras merah yang dapat ditambahkan kedalam

minuman sehingga tidak menimbulkan kendala pada citarasa. Prinsip dasar

pembuatan minuman yang dilakuan adalah mencampur bahan baku dan bahan

tambahan minuman kedalam blender berdasarkan bobot per volume (b/v). Basis

minuman dibuat dengan total volume 1000 ml untuk mempermudah formulasi.

Optimasi formula minuman dilakukan dengan metode Mixture Experiment,

menggunakan bantuan piranti lunak Design Expert 7.0®

. Proporsi relatif beras

merah, kencur dan jahe dimasukkan sebagai data masukan. Selanjutnya ditentukan

pula proporsi relatif minimum masing-masing rempah (lower limit) dan proporsi

relatif maksimum masing-masing rempah (upper limit) sebagai data masukan

sebelum didapatkan model rancangan percobaan.

Hasil keluaran berupa model rancangan percobaan selanjutnya dilakukan

pembuatan minuman untuk mengukur respon masing-masing model rancangan

percobaan tersebut. Dalam pembuatan minuman ditambahkan gula jawa dan asam

jawa dengan jumlah tetap. Variabel respon minuman diukur berdasarkan hasil uji

aktivitas antioksidan minuman (metode penangkapan senyawa radikal bebas) dan

hasil uji organoleptik minuman (metode hedonik dengan parameter citarasa dan

warna). Variabel respon tersebut digunakan sebagai parameter untuk menetapkan

nilai target optimasi formulasi minuman.

Selanjutnya variabel respon yang didapat dari masing-masing model

dimasukkan kembali ke dalam piranti lunak Design Expert 7.0®

sebagai data

masukan untuk mendapatkan formula minuman yang optimal berdasarkan nilai

target yang sudah ditetapkan. Setelah itu dilakukan kembali pembuatan minuman

dengan formula optimal.

Metode yang digunakan pada tahap ini adalah pembuatan minuman beras

kencur, pengujian aktivitas antioksidan minuman beras kencur dan pengujian

organoleptik skala hedonik.

30

3.2.3.1. Pembuatan minuman beras kencur (Saidi Z , 1985).

Beras digiling sampai halus dan disangrai menggunakan api kecil. Beras

dan bahan segar serta bahan tambahan lain dihomogenkan didalam waring

blender hingga hancur dan tercampur rata. Setelah tercampur, kemudian

disaring dengan kain bersih 4 lapis dan diperas hingga air habis,

dimasukkan kedalam kemasan pounc yang terbuat dari alumunium dilapis

plastik dan dilakukan pasteurisasi. Minuman beras kencur siap dihidangkan.

3.2.3.2 Pengukuran aktivitas antioksidan minuman Metode DPPH

(Kubo et al., 2002; Molyneux, 2004).

Sebanyak 2 ml larutan buffer asetat (pH 5,5) ditambah dengan 3.75

metanol, 200 µl larutan DPPH 3mM dalam metanol dan dilakukan

pengocokan dengan menggunakan vortex. Kemudian ditambahkan 50 µl

larutan sampel atau larutan standar antioksidan dan diinkubasi pada suhu 37

°C selama 30 menit. Absorbansi sampel dibaca pada panjang gelombang

517 nm. Aktivitas antioksidan dihitung berdasarkan kesetaraannya dengan

aktivitas antioksidan asam askorbat yang dinyatakan dalam ppm AEAC

(Ascorbic acid Equivalent Antioxidant Capacity).

3.2.3.3 Uji Organoleptik metode skala hedonik (Meilgaard et al., 1999)

Uji organoleptik dilakukan dengan skala kesukaan atau hedonik terhadap

formula minuman yang telah dibuat. Sebanyak lima puluh panelis diminta

mencicipi sampel dan diantara masing-masing pencicipan sampel

diharuskan mengkonsumsi air minum sebagai penetral, kemudian panelis

diminta untuk memberikan penilaian tingkat kesukaannya terhadap warna

dan citarasa (aroma dan rasa) sampel dengan menggunakan 5 tingkat skala

hedonik [dimulai dari sangat tidak suka (=1) sampai sangat suka (=5)].

Formulir lembar uji kesukaan panelis terhadap citarasa dan warna model

minuman dapat dilihat pada lampiran 21.

3.2.4. Karakteristik minuman beras kencur formula terpilih

Penelitian ini bertujuan membandingkan karakteristik minuman beras

kencur berbasis beras merah formula terpilih dengan minuman beras kencur

komersial dilihat dari aktivitas antioksidan dan aspek sensori atribut warna,

31

aroma, rasa, dan after taste. Metode yang digunakan pada tahap ini adalah

pembuatan minuman beras kencur, pengujian aktivitas antioksidan minuman beras

kencur dan pengujian organoleptik skala hedonik seperti yang telah dijelaskan

pada penelitian sebelumnya.

3.2.5 Pengamatan kestabilan minuman formula terpilih

Pengamatan kestabilan minuman formula terpilih dilakukan selama 15 hari

penyimpanan. Metode yang digunakan adalah analisis total mikroba (total plate

count), analisis sensori individu, analisis pH, dan analisis aktivitas antioksidan.

analisis antioksidan pada minuman menggunakan metode yang telah dijelaskan

diatas, sedangkan metode yang lain sebagai berikut:

3.2.5.1 Total Mikroba (Total Plate Count) (Maturin dan Peeler, 2001)

Sebanyak satu ml sampel diambil dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan

pengencer. Selanjutnya dilakukan pengocokan hingga homogen dengan

vorteks. Pengenceran dan pemupukan dilakukan hingga tingkat pengenceran

10-2

. Dari tiap-tiap pengenceran, dipipet secara aseptis 1 ml untuk

dimasukkan ke dalam cawan petri steril (pemupukan) secara duplo dan

ditambahkan media PCA (Plate Count Agar) steril sebanyak 15-20 ml.

Segera setelah penuangan, cawan petri digerakkan di atas meja secara

hati-hati untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata, yaitu dengan

gerakan melingkar atau angka delapan. Setelah medium membeku, cawan

petri diinkubasikan dengan posisi terbalik pada inkubator suhu 37°C selama

2 hari (48 jam). Perhitungan jumlah total mikroba dilakukan dengan

menggunakan Standard Plate Count (SPC) metode Harrigan.

3.2.5.2. Nilai pH (AOAC, 2005)

Sebanyak 30-50 ml sampel langsung diukur nilai pH-nya dengan

menggunakan pH meter. Sebelum digunakan, pH meter harus dikalibrasi

terlebih dahulu dengan larutan buffer pH 4.0 dan pH 7.0.

3.3 Analisis Data

Data kuantitatif yang diperoleh merupakan hasil rata-rata dari tiga ulangan.

Untuk melihat perbedaan kemampuan antioksidan, kandungan flavonoid,

komposisi kimia dan warna maka akan diuji nilai tengahnya secara statistik

32

(ANOVA) dengan rancangan percobaan acak lengkap menggunakan program

SPSS pada taraf α=0.05 dan dilakukan uji lanjut menggunakan uji beda nyata

terkecil pada taraf α=0.05. Rancangan percobaan formulasi minuman instan

digunakan program statistik Design Expert 7.0®

dengan tipe studi mixture, mode

D-optimal dan model desain quadratic pada taraf α=0.05.