KEBERHASILAN DALAM TEKNOLOGI SERTA PENGGUNAAN METODE KULTUR JARINGAN (IN VITRO) SANGAT TERGANTUNG PADA JENIS MEDIA YANG DIGUNAKAN.MEDIUM KULTUR

Macam Media Kultur Jarigan Medium Murashige & Skoog (MS)Media MS hampir digunakan untuk semua macam tanaman, terutama tanaman herbaceus. Media ini mempunyai konsentrasi garam- garam mineral yang tinggi dan kandungan Nitrat ynag tinggi (NO3- ) Medium B5konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanamanMedium Scheck dan HildebrandtMerupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil. Media SH ini cukup luas penggunaannya, terutama untuk tanaman legume

Macam Media Kultur Jarigan Medium WPMMerupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman berkayu. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohonMedium N6Media N6 mempunyai ciri perbandingan NHdan NOyang jauh perbandinganya. Amonium yangdiberikan dalam bentuk (NH)SOhanya sebanyak 363 mg/l, sedangkan KNO2830 mg/ldll(Suryowinoto, M. 1991)

komponen utama penyusun media kultur.Garam mineral Hara Makro: N,P,K,Ca,S,Mg & Mikro :Fe,Mn,B,Cu,Mo,Cl dan Co.Sumber karbon: sukrosa 1-5% dan glukosa, maltosa, galaktosa, laktosa (terbaik)Vitamin : Tiamin, piridoksin, asam nikotin dan mio-inositol.Pengatur tumbuh: untuk menginduksi pembelahan sel Auksin : IAA,NAA & 2,4-Diklrofenoksi- asetat(2,4-D). Sitokinin : kinetin, benziladenin(BA), 6-benzilaminopurin (BAP).Pelengkap organik: dapat merangsang laju pertumbuhan sel (air kelapa, jus jeruk, ekstrak ragi, dll)

GARAM-GARAM MINERALUnsur hara makro & mikro diberikan dalam bentuk Garam anorganik pada media.Unsur makro biasanya diberikan dalam bentuk NH4NO3, KNO3, CaCl2, 2H2O, MGSO4.7H2O, dan KH2PO4. Unsur mikro diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3, KI, NaMoO4.2H2O, CuSO4.5H2O, dan CoCl2.6H2O.Perbaikan pada penambahan garam mineral NO3 & K Menunjang pertumbuhan kalus, pertumbuhan pucuk dan embriogenesis pada banyak tanaman.

SUMBER KARBON Tanaman kultur tumbuh secara heterotrof dan laju fotosintesisnya rendah sehingga sintesis karbonnya tidak cukupPerlu ditambah gula sebagai sumber karbon dan energi untuk induksi kalusSukrosa dalam media dihidrolisa jadi monosakarida selama masa kultur.Dalam kultur kalus dan pucuk 2-4 % optimum, sdgkan kultur embrio dapat mencapai 12%Selain sumber energi, gula berfungsi sebagai tekanan osmotik dalam media

VITAMINVitamin memiliki fungsi katalitik pada sistem enzim dan dibutuhkan dalam jumlah kecilThiamine(B1) yang paling sering dan penting digunakan, berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang menghasilkan energi dari karbohidrat dan memindahkan energi Piridoksin (B6) dan Niasin (asam nikotianat) dapat meningkatkan pertumbuhan kalus. Mio-inositol (vit.tanaman) untuk membantu diferensiasi & pertumbuhan jaringan kalusAsam Karbonat bertujuan untuk mencegah terjadinya pencoklatan pada permukaan irisan jaringanVit.E juga dapat merangsang pembentukan kalus dalam kultur embrio jagung.

ZAT PENGATUR TUMBUHAUKSIN digunakan untuk merangsang pertumbuhan kalus, pemanjangan sel tanaman dan pembentukan akar adventifKonsentrasi auksin yang rendah dapat meningkatkan pembentukan akar adventif, sedangkan konsentrasi tinggi akan merangsang pembentukan kalus dan menekan morfogenesisAlamiah: indole acetic acid (IAA)Sintetik: Naphthaleneaceic acid (NAA), dan 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4D)SITOKININ berperan dalam pembelahan sel, pembentukan tunas dan proliferasi tunas aksiler, serta dpt menghambat pembentukan akarAlamiah: Zeatin dan 2iPSintesis: Kinetin, BAP & BA (benzyladenine ).Bila rasio antara auksin dan sitokinin tinggi maka akan memacu inisiasi akar dan induksi pembentukan kalusBila rasio antara auksin dan sitokinin rendah maka akan memacu proliferasi pucuk adv.

ZAT PENGATUR TUMBUHGiberelin atau GA3 digunakan untuk meningkatkan pemanjangan pucuk2 yang sangat kecil dan merangsang pembentukan embrio dari kalus.Namun GA3 tidak begitu sering digunakan karena senyawa tersebut tidak tahan panas dan tidak dapat diautoklaf.

Asam Absisat (ABA) berfungsi sebagai zat penghambat tumbuhEtilen merupakan ZPT yang berbentuk gasEtilen dapat mengakibatkan terhambatnya perkembangan kultur, namun pada kisaran kons.rendah dapat meningkatkan pembentukan pucuk adventif

BAHAN PEMADAT MEDIAPaling banyak digunakan adalah agar agar mengandung Ca,Mg,K dan Na atau pengganti agar seperti, Geltrite atau PhytagelKeuntungan pemakaian agar-agar : 1. Membeku pd suhu 45 C dan cair pd suhu 100 C. 2. gel agar bersifat stabil pada suhu inkubasi 3. Tidak dicerna oleh enzim tanaman. 4. Tdk bereaksi dgn penyusun media yang lain.Kons agar : 0,5-1,0%Konsentrasi agar yang terlalu tinggi dapat mengurangi difusi persenyawaan dari dan ke arah eksplan shg pengambilannya kurang sedangkan zat penghambat dari eksplan tetap berkumpul disekitar eksplan.

PELENGKAP ORGANIKAir kelapa dapat digunakan untuk mempertahankan pertumbuhan.Kandungannya: as.amino, as.organik, as.nukleat, purin, gula, gula alkohol dan zat pengatur tumbuhanJus Jeruk merupakan sumber gula, vitamin dan zat pengatur tumbuh.Ekstrak Ragi digunakan pd awal sejarah KJT oleh White dan RobbinsAs.amino,peptida, vitamin untuk pertumbuhan kultur akar Penggunaan suplemen organik sering dihindari karena tidak spesifik dan hasil yang diperoleh kadang tidak dapat diulangi kembali

ARANG AKTIFDapat ditambahkan kedalam media pada berbagai tahap perkembangan kultur. Pengaruh arang aktif : 1. Mengadsorpsi senyawa toksik yg terdapat dlm media sprti Senyawa Fenol 2. Mengadsopsi zat pengatur tumbuh shg mencegah pertumbuhan liar & membantu embriogenesis. 3. Menstimulasi pertumbuhan sel 4. Dapat mempengaruhi kepadatan agar yang terbentukKonsentrasi; 0,5-3%

pH MEDIAHarus diatur agar tdk mengganggu fungsi membran sel dan pH sitoplasmaSel tanaman membutuhkan pH media yang sedikit asam 5,6 5,8.Beberapa tanaman membutuhkan pH yang berbeda untuk pertumbuhan optimum

pH yang tinggi >6.0 membuat media agar menjadi keras pH

Teknik Aseptik dalam Pembuatan Media a. Sterilisasi PeralatanSterilisasi peralatan (glassware dan logum) dan aquades dilakukan dengan sterilisasi kering (oven 1300c-1700c selama 2-4 jam).Sterilisasi peralatan dengan autoclave dilakukan pada suhu 1210c takanan 15 PSI selama 1 jam.Sterilisasi peralatan logam (pinset, gunting, jarum) yang digunakan dengan merendam perakitan tsb dalam alcohol 95% diikuti dengan pembakaran dan pendinginan.

b. Sterilisasi medium kulturMetode autoclaveMedium dalam botol kultur ditutup dengan alumunium foil pada suhu 1210C, tekanan PSI selama 15-40 menit dari waktu medium mencapai suhu yang diperlukan.Metode FiltrasiYaitu sterilisasi menggunakan membrane filter berukuran 0,45-0,22 mm di dalam kontiener steril.(Sriyanti, 1994)

Jenis Kontaminan Media InternalKontaminasi internal umumnya disebabkan oleh ketidaksterilan bahan eksplan itu sendiri.Pencegahan kontaminasi Internal dapat dilakukan dengan sterilisasi kontak.

EksternalKontaminasi eksternal dapat disebabkan oleh jamur dan bakteri.Untuk mengatasi kontaminasi eksternal dapat digunakan penggunaan fungisida, HgCl2 dan klorin karena dengan sterilisasi berlapis dapat mereduksi resiko kontaminan baik yang berasal dari cendawan, bakteri maupun kotoran-kotoran lain yangmenempel pada permukaan eksplan(Gunawan, 2007)

Pembuatan Larutan Stok

Rumus perhitungan larutan stokUntuk menentukan larutan stok yang ingin digunakan kita dapat menghitungnya dengan menggunakan rumus:V1.M1 = V2.M2Dimana : V1 = volume yang akan dibuatV2 = volume larutan stok yang akan diambilM1 = banyaknya kebutuhan senyawa dalam media MSM2 = banyaknya senyawa larutan stok

(Marlin dan Romaida, 2008)

Pembuatan Media Kultur JaringanAlat; Beker glass: Tempat pembuatan mediaStirer: Mengaduk BahanPlastik wrap: Menutup tempat mediaBotol kultur: Tempat membiakkan eksplanAutoclave: Menyimpan mediaMicrowave: Pemanas/ mengentalkan larutanMikropipet: Mengambil media MSGelas ukur: Mengukur media MS yang diperlukanNeraca analitik: Menimbang bahan- bahanPipet ukur: Mengambil bahan cairpH meter: Mengukur pH larutanKaret: Mengikat plastik penutup botolKertas label: Memberi nama pada botol kulturLabu ukur: Menampung dan mencampur larutan kimiaErlenmeyer: tabung tempat larutan sebelum di masukan pada botol kultur Bahan;Makro : 25 mLMikro A: 2,5 mLFe-Na-EDTA: 2,5 mLVitamin: 2,5 mLFungsi: Sebagai bahan pembuatan larutan stokSukrosa: Membuat larutan menjadi tercampur rata (7,5 gram)Agar-agar: Mengentalkan Larutan (1,75 gram)Aquades: Bahan dasar mediaHCL: untuk ditambahkan ke larutan jika larutan bersifat basaKOH: untuk ditambahkan ke larutan jika larutan bersifat asam

Pembuatan Media Kultur JaringanPipet larutan stok (Makro 25 mL, mikro 2,5 mL , Vitamin 2,5 mL, Fe-Na-EDTA 2,5 mL)Masukan dalam Beaker gelas dan tambahkan Aquades sampaiVolume 250 mLMasukan Magnet Stirer kedalam Beaker gelasdan letakan pada Plate Magnetic StirerNyalakan magnetic stirrer supaya larutan homogendan tambahkan Sukrosa (7,5 g/L) sampai larutStrelisasi semua peralatan

Pembuatan Media Kultur JaringanJika pH sudah sesuai, tambahkan agar-agar (1,75 g/L) yang sudah di siapkan,panaskan dengan microwave sampai mendidih dan larut sempurnaTiriskan sampai tidak terlalu panas dan tuangkan dalam botol kultur (Masing-masing 20 mL)Tutup botol dengan plastic yang sudah di siapkan dan media siap di sterilisasi dengan Autoclave pada tekanan 1.5 psi selama 20 menitSetelah di autoclave botol media di pindahkan ke ruang kultur jaringan dan selanjutnya siap untuk digunakan sebagai media tanamUkur pH Larutan sesuai ketentuan (5,6-5,8), dengan pH Meter

Media merupakan salah satu komponen yang penting dalam metode kultur jaringan. Kesuksesan aplikasi prosedur kultur jaringan sebagian besar dipengaruhi oleh medium dengan komposisi yang tepat. Media yang baik, harus memenuhi syarat nutrisi yang diperlukan eksplan untuk tumbuh dan berkembang. Oleh karena itu, di dalam media kultur jaringan ditambahkan berbagai macam mineral, vitamin, sumber karbohidrat, dan zat pengatur tumbuh (hormon)( Evans et al. 2003)

*******