materi praktikum

KATA PENGANTAR

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa dengan terselesainya penyusunan Buku

Petunjuk Praktikum Blok 3. Blok Sel & Molekul merupakan blok ketiga dari keseluruhan

blok belajar dalam Kurikulum Pendidikan Dokter di Fakultas Kedokteran Universitas

Jember.. Pada blok ini peserta didik belajar menyiapkan diri sebagai seorang

mahasiswa kedokteran dan calon dokter dengan membangun suatu pemahaman yang

komprehensif tentang sel dan molekul sebagai dasar ilmu kedokteran, untuk menunjang

karirnya di masa depan.

Dalam blok 3, terdapat 6 kegiatan praktikum yang menunjang materi tutorial

dimana diskusi tutorial sebagai jantung dari seluruh kegiatan. Materi praktikum blok 3

yaitu. Buku petunjuk praktikum disusun untuk memudahkan dan menunjang kegiatan

praktikum mahasiswa supaya tujuan pembelajaran tercapai.

Terima kasih kepada narasumber, sejawat, dan seluruh pihak yang terlibat dalam

penyusunan buku petunjuk praktikum ini. Semoga buku ini dapat digunakan sesuai tujuan

yang diharapkan. Kritik dan saran untuk perbaikan sangat diharapkan demi kesempurnaan

buku ini.

Jember, Nopember 2012

Tim Penyusun

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul ii

DAFTAR ISI

halaman

HALAMAN JUDUL....................................................................................................... i

KATA PENGANTAR..................................................................................................... ii

DAFTAR ISI.................................................................................................................... iii

1. Praktikum 1: Histologi Jaringan Ikat & Epitel............................................................. 1

2. Praktikum 2: Farmakokinetik....................................................................................... 6

3. Praktikum 3: Jejas Sel & Adaptasi............................................................................... 8

4. Praktikum 4: Pengaruh PH Dan Suhu Terhadap Reaksi Enzimatik............................. 18

5. Praktikum 5: Isolasi DNA............................................................................................ 23

6. Praktikum 6: Statistik Uji Komparatif Tidak Berpasangan.......................................... 28

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul iii

PRAKTIKUM 1

HISTOLOGI JARINGAN IKAT & EPITEL

I. Judul Blok

Blok 3 (Sel & Molekul)

II. Topik Praktikum

Jaringan ikat & epitel

III. Laboratorium Pelaksana

Laboratorium Histologi

IV. Tujuan Belajar

Setelah menyelesaikan proses pembelajaran ini, mahasiswa akan mampu:

a. Menjelaskan perbedaan secara histologi jenis jaringan ikat & epithel

b. Menunjukkan ciri-ciri histologi macam-macam jaringan ikat dan epithel pada preparat

praktikum

c. Menyebutkan macam-macam sel yang terdapat pada jaringan ikat

d. Menunjukkan ciri-ciri histologi sel-sel yang terdapat pada jaringan ikat pada preparat

praktikum

V. Alat dan Bahan

1. Slide demo

2. preparat praktikum

3. mikroskop cahaya

VI. Prosedur

Tahap Kegiatan PengajarKegiatan

Mahasiswa

Media & Alat

Belajar

Pendahuluan 1. Membuka pertemuan

2. Menjelaskan cakupan materi

3. Menjelaskan kompetensi-

kompetensi TIK

Memperhatikan Pengeras

suara

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul 1

Penyajian 1. Menyebutkan jenis jaringan

ikat & epithel

2. Menjelaskan ciri histologi

jenis jaringan ikat dan epithel

3. Menjelaskan macam-macam

sel pada jaringan ikat

4. Menjelaskan ciri-ciri

histologi sel-sel yang

terdapat pada jaringan ikat

Brainstrorming

materi yang

pernah

didapatkan

sebelumnya

Aktif

Mendengarkan

Mencatat

Slide Demo

Preparat

praktikum

Penutup 1. Menjelaskan kembali

materi yang belum

dimengerti mahasiswa

2. Merangkum praktikum

yang telah diberikan

3. Menunjuk beberapa

mahasiswa secara acak

diberi pertanyaan yang

berkaitan dengan materi

4. Menutup pertemuan

Mendengarkan

Mencatat

Menjawab

pertanyaan

Slide Demo

Preparat

praktikum

VII. Metode

1. Ceramah.

2. Pengamatan.

3. Diskusi.

VIII. Dasar Teori

JARINGAN EPITEL

Epitel

Epitel selapis pipih capsula bowman pada ginjal [52]

Epitel selapis kubis TC I, TC II, ductus colligentes pada ginjal [52]

Epitel selapis silindris dengan striated border usus halus (intestinum) [20,21]


kinocilia tuba falopii [62]

Epitel berlapis piph tanpa tanduk vagina, oesophagus [58, 12-14]

bertanduk kulit tebal & tipis [82-86]

Epitel berlapis kubis kelenjar keringat pars ekskretoris [82,85]

Epitel berlapis silindris

Epitel berderet silindris dengan stereocilia epididimis [49]

Kinocilia trachea, cavum nasi [36, 38]

Epitel peralihan vesica urinaria [55]

Berdasarkan Cara Membentuk Sekret

Kelenjar merokrin kelj pancreas [30], parotis [27], submaxilaris [28], sub

lingualis [29]

Kelenjar apokrin kelj keringat axila [85], kelj seruminous

Kelenjar holokrin kel sebacea kulit [82, 85]

Berdasarkan Jenis Sekret

Kelenjar serous pancreas [30], parotis [27]

Kelenjar mucous kelj weber (lidah) [7]

Kelenjar seromucous kelj submaxilaris [28], sub lngualis 29]

Berdasarkan Cara Mengeluarkan Sekret

Kelenjar eksokrin

Kelenjar endokrin thyroid [74], hypofise [72], adrenal [76], parathyroid [75], pulau

langerhans [30]

Sel

Sel payung

Sel raket

Sel basal [55]

BAS (BAHAN ANTAR SEL) DAN JARINGAN IKAT


BASA (Bahan Antar Sel Amorf)

Cairan jaringan jaringan ikat umum

Bahan dasar setengah padat jaringan ikat embryonal [3, 66, 71]

Bahan dasar padat lunak jaringan tulang rawan [91-93]

Bahan dasar padat keras jaringan tulang muda & dewasa [90, 88]

BASB (Bahan Antar Sel Berbentuk)

Sabut kolagen dalam jaringan ikat kendor [82-85]

jaringan ikat teratur tendon, ligamentum nuchae [96, 95]

jaringan ikat tak teratur

Pada pewarnaan HE: merah

Pada pewarnaan MA: biru

Sabut elastis dinding pembuluh darah [43, 44]

tulang rawan elastis [92]

ligamentum nuchae [95]

Pada pewarnaan VvG: hitam, bergelombang

Sabut retikuler kelenjar getah bening [97]

Pada pewarnaan Ag impregnasi: coklat kehitaman, halus bercabang

JARINGAN

Jaringan ikat embrional

Jaringan ikat padat teratur tendon, ligamentum nuchae [96, 95]

Jaringan ikat padat tidak teratur pada dermis kulit [82-85]

Jumlah sabut banyak, arah tidak teratur

Jaringan ikat kendor pada lamina propria, subcutis [12-14]

Sabut kolagen sedikit, arah tak beraturan

Sel fibrosit/fibroblast +

Jaringan limforetikuler kelenjar getah bening [97]

Jaringan lemak payudara, subcutis [70, 82-85]

Jaringan berpigmen mata


Jaringan tulang rawan chondrosit [91-93]

Jaringan tulang muda trabekel [90]

Jaringan tulang dewasa sistem havers [88]

Sediaan

Tendon [96]

Ligamentum nuchae [95]

Sel

Stellate fibroblast

Fibroblast

Fibrosit

Makrofag

Mast cell (=basophil jaringan)

Sel plasma

Lmfosit T [97]

Tissue eosinophyl

Sel tendon potongan membujur

Winged cell potongan melintang


PRAKTIKUM 2

FARMAKOKINETIK

I. Judul Blok

Blok 3 (Sel & Molekul).

II. Topik Praktikum

Farmakokinetik.


Laboratorium Farmakologi.

IV. Tujuan Belajar

1. Menjelaskan perjalanan obat dari mulai absorbsi, distribusi, metabolisme, dan

ekskresi

2. Menjelaskan hubungan waktu dengan proses absorbsi, distribusi, metabolisme, dan

ekskresi

3. Membuat dan melakukan inform concent untuk praktikum menggunakan manusia

sebagai subyek

V. Alat dan Bahan

1) Probandus (subyek yang diamati)

2) Obat: rifampisin atau eritromisin kaplet

3) Kantong plastik ukuran 1 kg 20 buah

4) Tabung reaksi 10 buah

5) Spuit 5 cc /pipet

6) Kolorimeter

7) Lembar inform concent

VI. Pengantar

Farmakokinetik adalah ilmu yang mempelajari perjalanan obat mulai dari absorbsi, distribusi,

metabolisme dan ekskresi.


Absorbsi obat dapat melalui berbagai cara tergantung pada jalur pemberiannya. Obat dapat

diberikan melaluo oral, suntikan intravena, suntikan intramuskular atau subkutan, serta jalur

lain (inhalasi, rektal, sublingual, topikal). Proses absorbsi dipengaruhi banyak faktor, namun

yang paling berperan adalah kelarutan obat dalam lemak. Obat dapat melewati membran sel

dengan cara difusi pasif atau transporta aktif.

Bioavailabilitas adalah jumlah obat yang diabsorbsi setelah pemberian melalui jalur tertentu

dibandingkan dengan jumlah obat yang diabsorbsi jika diberikan secara intravena (iv).

Dengan kata lain bioavailabilitas adalah proporsi obat yang diberikan yang mencapai

sirkulasi sistemik.

Distribusi obat ke seluruh tubuh terjadi saat obat mencapai sirkulasi. Selanjutnya obat akan

masuk ke jaringan untuk bekerja. Waktu paruh (t½) adalah waktu yang dibutuhkan sehingga

konsentrasi obat dalam darah berkuang setengah dari jumlah awal. Volume distribusi (VD)

adalah volume yang menunjukkan distribusi obat. Bersihan (Clearance) adalah volume darah

atau plasma yang dibersihkan dari obat dalam satuan waktu.

Hati merupakan organ utama untuk metabolisme obat. Metabolisme obat mempunyai dua

efek penting yaitu

a. obat menjadi lebih hidrofilik, hal ini mmepercepat eksresi melalui ginjal

b. obat menjadi kurang aktif daripada obat asalnya, namun sebagian obat justru menjadi lebih aktif

(prodrug)

Ekskresi ginjal memegang tanggung jawab utama untuk eliminasi sebagian besar obat. Obat

terdapat dalam filtrat glomerulus, tetapi bila larut lemak obat ini dapat direabsorbsi dalam

tubulus ginjal melalui difusi pasif. Metabolisme obat sering menghasilkan senyawa yang

kurang larut lemak sehingga membantu ekskresi ginjal. Ekskresi bilier dilakukan bila obat

terkonsentrasi dalam empedu sehingga diekskresikan ke dalam usus halus.

VII. Tugas

1) Tetapkan pemimpin kelompok sebelum memulai bekerja

2) Pemimpin kelompok membagikan tugas dalam kelompok

3) Tetapkan probandus atau subyek penelitian (bisa salah satu dari anggota kelompok)

4) Buatlah inform concent untuk probandus.

5) Selesai makan siang probandus mengosongkan urine dan ditampung dalam kantong

plastik, setelah itu minum obat yang sudah ditetapkan


6) Selanjutnya setiap kali mengosongkan urine probandus menampung dalam kantong

plastik dan dicatat waktunya.

7) Pindahkan masing-masing urine tampung ke tabung reaksi menggunakan spuit atau pipet

sebanyak 3 cc.

8) Lakukan pengamatan warna menggunakan kolorimetri

9) Laporkan hasil diskusi kelompok dengan sistematika sebagai berikut:

a) Judul

b) Pendahuluan

c) Metode

d) Hasil pengamatan

e) Pembahasan

f) Kesimpulan dan Saran

g) Kepustakaan

h) Lampiran (foto-foto)


PRAKTIKUM 3

JEJAS SEL & ADAPTASI

I. Judul Blok


II. Topik Praktikum

Jejas sel & adaptasi


Laboratorium Patologi Anatomi

IV. Tujuan Belajar

Mahasiswa dapat menjelaskan gambaran makros & mikroskopis jejas, adaptasi, & kematian

sel yang terdapat pada sediaan:

pielonefritis kronik

chorio carsinoma

mola hidatidosa

hiperplasia endometrium

BPH

hidrosalfing

polip servix

V. Alat dan Bahan

1. Slide demo

2. preparat praktikum

3. mikroskop cahaya

VI. Prosedur

Pengamatan preparat

VII. Metode

1. Ceramah.

2. Pengamatan.


3. Diskusi.

VIII. Tugas

PIELONEFRITIS KRONIK

Makroskopik :

Ginjal mengalami kontraksi dengan pembentukan jaringan parut

Besarnya tidak teratur

Perlekatan kapsul

Mikroskopik :

Degenerasi hyaline

Epitel tubuli kontorti bengkak, batas sel tidak jelas, sitoplasma eosinofilik dan

granular

Lumen tubuli sempit

Epitel rupture

Hyaline bodies dalam lumen tubuli (silinder albumin)

Pembesaran Obyektif 10 x :



CHORIO CARSINOMA

Makroskopik :

Tumor lunak putih kekuningan pada dinding uterus

Didapatkan daerah nekrosis, perdarahan dan peradangan

Mikroskopik :

Degenerasi mukoid

Musin terdiri dari glikoprotein dan asam asetat, disekresi epitel

Infiltrasi sel trofoblas yang proliferatif dan anaplasi ke miometrium

Sel-sel trofoblas anaplasi, bengkak, sitoplasma berisi musin

Hemoragik karena menginvasi vaskular




MOLA HYDATIDOSA

Makroskopik :

Uterus lebih besar dari umur kehamilan normal

Terdapat gelembung-gelembung mola, bentukan buah anggur

Pada umumnya tidak ada janin

Mikroskopik :

Stroma vili korealis renggang, avaskular

Degenerasi hidrofik

Gangguan membran sel → vakuola intrasel

Proliferasi trofoblas




HIPERPLASIA ENDOMETRIUM

Mikroskopik:

Kelenjar endometrium bertambah banyak karena pengaruh hormon estrogen

Epitel kelenjar normal sampai atypic

Kelenjar lebih banyak, berkelok-kelok dan berdesakan

Lumen kelenjar melebar dan tidak sama besar

Proliferasi struma sehingga tampak padat




BENIGN PROSTAT HIPERPLASIA

Makroskopik :

Ukuran prostate membesar

Nodul pada lobus medius berwarna putih kekuningan atau putih abu-abu

Pseudokapsul

Mikroskopik :

Hyperplasia nodular

Proses fisiologis

Pengaruh dihidro testosterone

Kelenjar hiperplasi

Sel epitel kuboid, sitoplasma jernih, membentuk papil-papil

Sel basal normal

Proliferasi sel otot dan fibroblast pada struma

Terdapat corpora amilacea (degenerasi hyaline), atau secret pada lumen




HIDROSALFING

Makroskopik :

Ukuran tuba fallopi membengkak

Dinding tipis

Lumen berisi cairan serous

Mikroskopik :

Atrofi tekan


Lumen tuba fallopii terisi eksudat, jaringan nekrotik, sel lekosit

Epitel tuba atrofi

Sel epitel selapis silindris berubah menjadi sel epitel pipih



POLIP SERVIKS


Makroskopik :

Massa bertangkai, berasal dari endoserviks

Permukaan licin

Mikroskopik:

Metaplasia epitel

Kelainan pada endoserviks

Metaplasia epitel kolumnar menjadi epitel squamosa

Tangkai polip +/-




PRAKTIKUM 4

PENGARUH PH DAN SUHU TERHADAP REAKSI ENZIMATIK

I. Judul Blok


II. Topik Praktikum

Pengaruh pH dan suhu terhadap reaksi enzimatik


Laboratorium Biokimia

IV. Tujuan Belajar

1. Mahasiswa dapat menjelaskan perjalanan reaksi enzimatis (progess curve)

2. Mahasiswa dapat mengetahui perbedaan antara kecepatan sesaat, keceaptan awal dan

kecepatan rata-rata reaksi enzimatik

3. Mahasiswa dapat mengetahui pengaruh pH dan suhu terhadap reaksi enzimtis.

4. Mahasiswa dapat menjelaskan pH optimum dan suhu optimum

V. Alat dan Bahan

Reagen yang digunakan pada praktikum ini, adalah:

Larutan enzim amilase

Larutan NaCl 0,9 %

Larutan amilum 1 %

Larutan penyangga, masing-masing kelompok dengan satu macam pH ( 4; 5; 6,5; 8 dan 10 )

Larutan KI-KIO3 : KI 5,0 g

KIO3 0,357 g

NaOH 1 N 2,0 ml

Aqua ad 1 L

Larutan HCL 0,05 N


VI. Prosedur

1. Prosedur Pengaruh pH terhadap Reaksi Enzimatik

Sediakan 5 tabung reaksi, berilah tanda masing-masing 0’, 5’, 10’, 15’, dan 20’.

Masukkan ke dalam sebuah labu erlenmeyer 15 ml larutan penyangga dengan berbagai

pH yang telah ditentukan, 3 ml larutan amilum dan 6 ml larutan NaCl 0,9 %. Kocoklah

agar semua larutan tercampur.

Isilah masing-masing tabung reaksi yang telah diberi tanda dengan 1 ml larutan HCl 0,05

N.

Ambillah 1 ml cairan dari labu erlenmeyer dan masukkan ke dalam tabung reaksi dengan

tanda 0’, kocok sebentar.

Tambahkan 1 ml larutan enzim ke dalam labu erlenmeyer dan campur dengan cepat.

Tepat pada saat penambahan enzim ini catatlah waktunya (jalankan stopwatch).

Mendekati 5 menit setelah enzim dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer, pipetlah 1 ml

larutan dari labu erlenmeyer. Masukkan larutan dalam pipet tersebut ke dalam tabung

reaksi bertanda 5’ tepat pada saat penunjuk waktu menunjukkan 5 menit. Kocok

sebentar.

Demikian seterusnya : tepat setiap 5 menit kemudian masukkan 1 ml larutan dari labu

erlenmeyer berturut-turut ke dalam tabung-tabung reaksi dengan tanda 10’, 15’, dan 20’

seperti di atas. Kocok sebentar.

Setelah semua selesai, ke dalam tiap tabung reaksi tambahkan 1 ml larutan KI-KIO3,

campur baik-baik sampai merata, tunggu 5 – 10 menit.

Tentukan intensitas warna yang terjadi dengan spektrofotometer dengan panjang

gelombang 660 nm.

Jumlah substrat yang dicerna pada setiap waktu yang telah ditentukan dapat dihitung

dengan rumus:

(Absorbance) waktu t

% Substart yang dicerna = 100% - -------------------------- X 100%

(Absorbance) waktu to

Catat hasil yang didapat, kemudian berdasarkan data tersebut buatlah gafik hubungan antara

% subtrat yang dicerna ( ordinat ) dengan waktu ( absis ).


2 Prosedur Pengaruh Suhu Terhadap Reaksi Enzimatik

Isilah labu erlenmeyer dengan:

15 ml larutan penyangga pH 6,5; 3 ml larutan amilum, 6 ml larutan NaCl 0,9%. Campur

baik-baik, lalu letakkan pada suhu yang telah ditentukan selama kira-kira 30 menit.

Sediakan 5 tabung reaksi, beri tanda 0’, 5’, 15’ dan 20’.

Isilah masing-masing dengan 10 ml larutan HCl 0,05 N.

Ambillah 1 ml larutan dari erlenmeyer, masukkan ke dalam tabung reaksi tanda 0’.Lalu

masukkan 1 ml larutan enzim ke dalam erlenmeyer. Campur dengan cepat dan jalankan

pencatat waktu. Setiap 5 menit setelah ini, masukkan 1 ml, larutan dari erlenmeyer

berturut-turt ke dalam tabung 5’, 10’ 15’ dan 20’.

Setelah semua selesai, tambahkan 1 ml larutan KI-KO3 ke dalam tiap-tiap tabung reaksi,

campur baik-baik dan tunggu 5-10 menit.

Tentukan intensitas warna yang timbul dengan spektrofotometer dengan panjang

gelombang 660 nm.

Buat gafik yang menunjukkan hubungan antara % substrat tercerna (ordinat) dengan

waktu (absis) pada bermacam suhu di atas.

Prinsip Praktikum

Enzim sebagai katalisator ikut bereaksi dan mempercepat reaksi kimia, tetapi pada

akhir reaksi akan didapatkan kembali dalam bentuk semula, sehingga dapat mengkatalisis

reaksi kimia berikutnya. Kenyataan ini mengakibatkan tubuh tidak perlu memproduksi enzim

dalam jumlah yang besar (kadar enzim di dalam tubuh kecil), sehingga pengukuran enzim

tidak bisa dilakukan secara langsung. Pengukuran jumlah enzim dilakukan berdasarkan

kecepatan reaksi yang dikatalisisnya. Pengukuran tersebut dilakukan dengan cara :(1)

dibandingkan dengan enzim murni yang diketahui kadarnya (satuan: µg); (2) berdasarkan

jumlah substrat yang bereaksi atau produk yang terbentuk per satuan waktu (Satuan: unit).

Satu internasional unit merupakan jumlah enzim yang mengkatalisis pembentukan 1 µ mol

produk per menit pada kondisi tertentu.

Untuk mengetahui pengaruh pH pada reaksi enzimatik, dilakukan pengamatan reaksi

antara amilum sebagai substrat dan amilase sebagai enzim yang dilakukan pada beberapa pH

yang berbeda. Faktor-faktor lain yang dapat mempengaruhi reaksi enzimatik dibuat sama.

Amilum merupakan suatu polisakarida yang berwarna biru bila bereaksi dengan yodium.

Enzim amilase mencerna amilum secara bertahap, menghasilkan produk diantaranya suatu


disakarida yang tidak berwarna bila direaksikan dengan yodium. Perubahan warna yang

terjadi (berkurangnya warna biru) menunjukkan sebagian substrat telah dicerna oleh enzim

amilase. Perubahan warna tersebut dapat diukur menggunakan alat spektrofotometer.

Untuk mengetahui pengaruh suhu terhadap reaksi enzimatik dilakukan percobaan

seperti diatas menggunakan pH 6,5 dan dilakukan pada beberapa macam suhu yang berbeda

yaitu, 0, 27, 40 dan 70o Celsius sedangkan faktor-faktor lain yang berpengaruh pada reaksi

enzimatik dibuat sama.

Dasar Teori

Untuk mempercepat reaksi kimia dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu (1)

Menaikkan suhu; (2) menambahkan katalisator. Manusia mempunyai suhu yang cenderung

konstant (normal), karena itu untuk mempercepat reaksi kimia tergantung pada cara ke-dua.

Katalisator mempercepat reaksi kimia dengan cara menurunkan energi aktivasi. Energi

aktivasi adalah jumlah energi yang diperlukan untuk membawa semua molekul dalam satu

mole suatu bahan pada suatu suhu tertentu dari keadaan awal menuju keadaan transisi. Pada

keadaan transisi kemungkinan terbentuk dan terputusnya ikatan kimia sangat besar.

Secara umum katalisator mempunyai sifat-sifat sebagai berikut:

1. Ikut bereaksi

2. Mempercepat reaksi dan tercapainya keseimbangan

3. Tidak merubah Keq dan perubahan energi bebas (∆G).

4. Tidak mempunyi hubungan stoikiometrik

5. Pada akhir reaksi didapat kembali dalam bentuk semula.

Enzim merupakan protein yang bertindak sebagai biokatalisator. Reaksi enzimatik

dipengaruhi oleh pH, suhu, kadar substrat, kadar enzim, aktivator dan inhibitor. Enzim

merupakan protrein jadi peka terhadap perubahan pH. Enzim hanya aktif dalam batas-batas

pH tertentu, pH dapat mempengaruhi muatan enzim maupun subtrat. Pada pH yang terlalu

tinggi atau terlalu rendah, enzim akan mengalami denaturasi.

Pada umumnya reaksi kimia berjalan lebih cepat pada suhu yang lebih tinggi, tetapi

pada suhu yang tinggi enzim dapat mengalami denaturasi ( pada suhu 70˚C, sebagian besar

enzim menjadi inaktif). Kenaikan suhu akan menyebabkan energi kinetik dari molekul-

molekul yang bereaksi menjadi semakin besar, sehingga kecepatan suatu reaksi kimia


menjadi bertambah besar. Suhu yang tinggi juga dapat menyebabkan perubahan stuktur

molekul protein. Enzim merupakan suatu protein yang pada suhu tertentu dapat mengalami

denaturasi.

VII. Tugas Pendahuluan

1. Buatlah bagan dari percobaan yang akan saudara lakukan secara singkat/jelas.

2. Sebutkan faktor-faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas suatu reaksi enzimatik ?

3. Jelaskan perbedaan antara kecepatan sesaat, kecepatan awal (initial velocity) dan

kecepatan rata-rata suatu reaksi enzimatik?

4. Apa yang dimaksud dengan pH optimum pada reaksi enzimatik?

5. Apa fungsi larutan NaCl, HCl, HGCl2 dan KI-KIO3 pada percobaan di atas ?


PRAKTIKUM 5

ISOLASI DNA

I. Judul Blok


II. Topik Praktikum

Sel & molekul


Laboratorium Biomol

IV. Tujuan Belajar

Mahasiswa dapat menjelaskan prosedur isolasi DNA genom

Mahasiswa dapat menjelaskan prosedur isolasi DNA plasmid

Mahasiswa dapat menjelaskan fungsi masing-masing reagen & tahapan dalam proses

isolasi DNA genom & DNA plasmid

V. Alat dan Bahan

ISOLASI DNA GENOM

Bahan: Tanaman sampel, alkohol 70%, alkohol 96 %, akuades, CTAB

(cetyltrimethylammonium bromide), β-merkaptol, KIA (kloroform: isoamilalkohol= 24:1),

isopropanol, bufer TE, SDS,RNA-se

RNAse, amonium asetat.

Alat: Tabung reaksi, beaker glass, spatula, mikropipet beserta tipnya, tabung mikrosentrifuga

1,5 ml, vortex, waterbath, mikrosentrifuga, LAF, freezer, dan sarung tangan.

ISOLASI DNA PLASMID

A. BAHAN

1. Solution I (150mM glukosa, 25mM Tris C1 (pH 8.0), 10mM EDTA (pH 8.0))

2. Solution II (0,2 n NaOH, 1% SDS)

3. Solution III (60 ml 5M potassium acetate, 11,5 ml Glacial acetic acid, 28,5 ml H20)

4. PCI/phenol : chloroform Isoamylalcohol (24:1)


5. Buffer TE

6. Ethanol pa

7. NaAc

B. ALAT

1. Mini sentrifuge berpendingin

2. Micropipet

3. Vortex

4. Pengering DNA

VI. Prosedur

A. CARA KERJA ISOLASI DNA GENOM

1. 2 gram sampel gerus dengan N2

2. Pindahkan serbuk sampel halus dalam kondisi beku ke tabung sentrifugasi

3. add 8 ml buffer ekstraksi, 10 µl betamercopto, 400 µl 20% SDS

4. Vortex sampai homogen, inkubasi pada suhu 65°C for 10min

5. Tambahkan 2,6 ml 5 M potasium acetat, mix dengan membolak-balik

6. Inkubasi on ice 20 min

7. Sentrifugasi 10.000 rpm, 20 min, 40°C

8. Take supernantan + 5 ml 1sopropanol, mix gentle

9. Jika DNA tampak melayang-layang, keringkan, larutkan dengan 600 µl TE buffer

10. Bila tidak inkubasikan suhu -20°C, for 30 min

11. Sentrifugasi 10.000 rpm, 10 min 4°C

12. Take pellet, keringkan +600 µl TE buffer

PURIFIKASI DNA

13. +5 µl RNA-se (10 mg/ml), inkubasi suhu 37°C, for 15 min

14. +PCI 700 µl, vortex,


16. Kloroform equal volume, kemudian sentrifugasi seperti PCI

17. Pindahkan larutan bagian atas + 0,8 vol isoprapanol dan 0,2 vol 3M sodium asetat

18. Campur, inkubasi suhu -80°C, for 15 h


20. Pellet cuci dengan 70% ethanol, kemudian disentrifugasi lagi.


21. Pellet DNA dikeringkan dengan vacum + 200 µl TE buffer

22. Estimasi kandungan DNA dengan spektrofotometer.

CARA KERJA ISOLASI DNA PLASMID

1. Transfer single koloni bakteri pada media LB 2 ml yang mengandung antibiotik dan

diinkubasi selama satu malam pada suhu 37°C di dalam penggojok dengan kecepatan 120

rpm

2. Masukkan 1,5 ml kultur bakteri pada ependolf. Sentrifuge pada 12.000 rpm selama 10

menit pada suhu 4°C, kemudian supernatan dibuang

3. Tambahkan 100 µl solution I, padfa pellet bakteri dan di vortex sampai bakteri benar-

benar tersuspensi

4. Tambahkan 200 µl fresh solution II, kemudian dibolak-balik 5c (swirling) dan jangan di

vortex. Inkubasi selama 5 menit sampai bening (menunjukkan lisis terjadi)

5. Tambahkan 150 µl solution III, lakukan swirling dan letakkan dalam es selama 5 menit

6. Sentrifuge 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4°C. Transfer supernatan pada tube

sentrifuge baru.

7. Selanjutnya ukur volume supernatan dan tambahkan PCI equal volume, lakukan vortex

dan sentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm selam 10 menit

8. Ambil supernatan (lap. Atas) lalu tambahkan ethanol pa dan 3M NaAc, ditambahkan

masing-masing sebanyak 2,5 dan 0,1 dari volume supernatan. Selanjutnya dipresipitasi

pada suhu -20°C selama satu jam

9. Kemudian di sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm 10 menit pada suhu 4°C

10. Pellet dicuci dengan 1ml 70% ethanol dan disentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm 5

menit pada suhu 4°C

11. Pellet dikeringkan dan diresuspensi dalam 20 µl buffer TE dan disimpan pada suhu 4°C

dan disimpan sampai siap digunakan

VII. DASAR TEORI

Komponen utama kromosom pada eukariota adalah DNA dan protein histon. Protein

histon ini bersifat basa, sehingga dapat menetralkan sifat asam dari DNA. Pada dasarnya sel

mengandung dua asam nukleat, yaitu RNA dan DNA. DNA yang terdapat di nukleus disebut

DNA kromosomal, sedangkan DNA lain yang terdapat di dalam sel dan di luar nukleus yaitu


DNA mitokondria, DNA kloroplas, dan DNA plasmid, ketiganya disebut DNA

ekstrakromomal.

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA

dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel, yaitu pada motokondria dan

kloroplas. Untuk mengekstrak DNA, diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk

memecahkan dinding sel dan membran inti, yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari

berbagai komponen sela yang lain. Pada saat melakukannya, DNA harus dijaga agar tidak

rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang.

Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Ekstraksi DNA

Proses pengeluaran DNA dari nukleus, mitokondria maupun organel lain – dengan

cara diekstraksi atau dilisiskan – biasanya dilakukan dengan homogenasi dengan penambahan

bufer ekstraksi atau bufer lisis untuk mencegah DNA rusak. Pada kondisi sampel tertentu,

untuk membantu lisis dari membran sel/nukleus/organel atau juga dinding sel, maka sampel

daun dimasukkan dulu ke nitrogen cair dan langsung digerus sebelum ditambahkan bufer

ekstraksi. Senyawa yang biasa digunakan untuk memaksimalkan hasil isolat DNA yang

murni ditambahkan yaitu fenol, kloroform, dan isoamil alkohol.

Proses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau

kontaminan yang tidak diinginkan. Pemisahan DNA dari komponen sela yang lain, termasuk

debris sel, dilakukan dengan sentrifugasi.

Kontaminan yang umum ditemukan di antaranya adalah polisakarida yang dapat

mengganggu proses lanjutan seperti PCR, dimana terjajdi hambatan aktifitas Taq polimerase,

atau kontaminan lainnya yaitu polifenol yang dalam bentuk teroksidasi akan mengikat DNA

secara kovalen. Untuk menghindari terjadinya hal ini, maka jaringan yang digunakan dijaga

tetap dingin sebelum dan selama proses ekstraksi.

Setelah dilakukan ekstraksi, maka proses dilanjutkan dengan presipitasi DNA dengan

menggunakan etanol absolut atau isopropanol. Selain DNA, semua bahan yang lain akan larut

dalam etanol dingin. Dengan demikian, saat dilakukan sentrifugasi, maka DNA akan

mengendap dan terpisah dari senyawa-senyawa atau bahan lain. Pada sampel darah,

presipitasi dilakukan dengan salting-out yaitu supernatan dipisahkan dari protein dan debris

sela dengan pemberian larutan garam berkonsentrasi tinggi. Biasanya akan diperoleh

supernatan DNA yang kental pada saat dimasukkan ke etanol absolut. Bila hal ini terjadi,


siapkan tabung yang berisi 70%-etanol, dan segera ambil DNA tadi dengan mikropipet 1000

µL, dan pindahkan ke tabung yang berisi 70%-etanol.

Sebagai bahan dasar untuk analisis lanjutan seperti PCR, RFLP, kloning atau sekuensing,

maka DNA yang digunakan harus bersih dari kontaminan (mempunyai kemurnian tinggi) dan

memiliki berat molekul yang tinggi. Selama proses ekstraksi DNA, beberapa hal yang dapat

terjadi antara lain :

DNA patah-patah selama proses isolasi.

DNA terdegradasi oleh enzim nuklease.

Terjadi kontaminasi oleh polisakarida.

Metabolit sekunder ikut terisolasi.

Denaturasi dan Renaturasi DNA

Proses denutarasi dan renaturasi melekul DNA tergantung pada banyak faktor, antara lain:

1. Suhu. Suhu leleh (melting temperature, Tm) yang tinggi menyebabkan untai ganda DNA

akan terurai menjadi untai tunggal, tetapi bila suhu ini diturunkan secara perlahan, maka

akan terjadi renaturasi menjadi untai heliks ganda DNA seperti semula.

2. Derajat keasaman (pH) yang ekstrem (pH<3 atau pH>10) dapat menyebabkan DNA

terdenaturasi.

3. Konsentrasi isoelektrolit seperti Na+ dan K pada larutan ekstraksi yang digunakan.

4. Perbandingan kandungan antara basa nukleotida GC terdapat AT. Tingginya kandungan

GC akan memperlambat proses denaturasi molekul DNA. Sebaliknya, kandungan AT

yang tinggi akan menyebabkan pita DNA mudah putus/patah.


PRAKTIKUM 6

STATISTIK UJI KOMPARATIF TIDAK BERPASANGAN

I. Judul Blok


II. Topik Praktikum

Sel & molekul


Laboratorium IKM/biostatistika

IV. Tujuan Belajar

1. Memahami dan dapat menggunakan Uji T tidak berpasangan

2. Memahami dan dapat menggunakan Uji Mann-Whitney

3. Memahami dan dapat menggunakan Uji One Way ANOVA

4. Memahami dan dapat menggunakan Uji Kruskal-Walis

V. Alat dan Bahan :

a. Media audiovisual

b. Program Statistik SPSS v.17

c. Laptop instruktur yang telah teristall SPSS

d. Laptop mahasiswa yang telah terinstall SPSS

e. Set data untuk latihan

f. Alat Tulis (ATK) dan Papan tulis

VI. Prosedur Umum Pelaksanaan Praktikum :

1. Mahasiswa sebanyak 60 orang dengan didampingi oleh 3 istruktur dan 1 asisten

2. Mahasiswa terlebih dahulu menginstal serta meng-copy set data latihan sebelum

praktikum


3. Intsruktur dan asisten menmeriksa dan memastikan setiap mahasiswa sudah

menginstall SPSS dan set data latihan pada laptop mahasiswa sebelum memulai

praktikum

4. Saat praktikum Instruktur terlebih dahulu menjelaskan dasar teori dan langkah-

langkah pengujian statistik komparatif data numerik tidak berpasangan

5. Instruktur memberi contoh pengujian statistik komparatif variabel data numerik tidak

berpasangan

6. Mahasiswa berlatih melakukan pengujian statistik dibantu oleh instruktur dan asisten

7. Melakukan diskusi dan tanya jawab

8. Membuat kesimpulan atas praktikum yang telah dilakukan

VII. Metode

Uji T Tidak Berpasangan :

1) Data yang akan diuji adalah set data 2 kelompok dengan variabel numerik tidak

berpasangan

2) Memeriksa syarat uji T Tidak berpasangan :

i. Data harus Berdistribusi Normal (WAJIB)

ii. Varians data boleh sama, boleh juga tidak sama

3) Jika memenuhi syarat (data berdistribusi normal), maka dipilih uji T tidak berpasangan

4) Jika tidak memenuhi syarat uji (data tidak berdistribusi normal) dilakukan dahulu

Transformasi data

5) Jika data hasil transformasi berdistribusi normal, maka dipakai uji T tidak berpasangan

6) Jika variabel baru hasil transformasi tidak berdistribusi normal, maka dipilih uji Mann-

Whitney

7) Langkah pengujian dengan uji T tidak berpasangan adalah sebagai berikut :

i. Bukalah file Unpaired t-test

ii. Lakukanlah uji normalitas terlebih dahulu :

Lihat variable View dab Data View terlkebih dahulu, pilih mana yang akan diuji

Noramliatasnya AnalyzeDescrptives StatisticsExploreMasukkan Variabel

dependent dalam Dependent List


Pilih Both pada displaybiarkan kotak Statsitics sesuai defaultklik Plotspilih

Factor levels together pada Boxplots, pilih Histogram pada Descriptives, pilih

Normality with testContinueOK

iii. Buka lagi file Unpaired T-testAnalyzeCompare meansIndependent-sample T

iv. Masukkan variabel dependent pada kotak Test variable

v. Masukkan faktor/variable independent pada kotak Grouping Variable

vi. Aktifkan Define Group

vii. Masukkan angka 1 untuk grup 1 dan angka 2 untuk grup 2

viii. Continue OKlakukanlah interpretasi hasil uji

Uji Mann-Whitney :

1) Data yang akan diuji adalah set data 2 kelompok dengan variabel numerik tidak

berpasangan

2) Memeriksa syarat uji T Tidak berpasangan :

i. Data harus Berdistribusi Normal (WAJIB)

ii. Varians data boleh sama, boleh juga tidak sama

3) Karena data tidak memenuhi syarat (data berdistribusi normal), maka dipilih Mann-

Whitney

4) Karena variabel baru hasil transformasi tidak berdistribusi normal, maka dipilih uji

Mann-Whitney, langkahnya adalah sebagai berikut :

i. Buka file Mann-Whitney

ii. AnalyzeNonparametrics test2 independent samples

iii. Masukkan variabel yg diuji kedalam Test variables

iv. Masukkan faktor kedalam Grouping Variable

v. Aktifkan uji Mann-Whitney

vi. Klik Define groupmasukkan angka 1 pada kotak grup 1 dan 2 pada kotak grup 2

vii. ContinueOKinterpretasilah hasil uji

Uji One Way ANOVA :

1) Data yang akan diuji adalah set data > 2 kelompok dengan variabel numerik tidak

berpasangan


2) Memeriksa syarat Uji One Way ANOVA untuk >2 kelompok tidak berpasangan :

i. Distribusi data harus normal (WAJIB)

ii. Varians data harus sama (WAJIB)

3) Jika tidak memenuhi syarat diupayakan melakukan transformasi data supaya distribusi

menjadi normal dan varians menjadi sama

4) Jika syarat terpenuhi, maka dipilih uji one way ANOVA

5) Jika syarat tidak terpenuhi maka alternatifnya dipakai uji Kruskal-Wallis

6) Jika pada Uji ANOVA atau Kruskal-Wallis menghasilkan nilai p<0,05 maka

dilanjutkan dengan melakukan analisis Post Hoc

7) Langkah pengujian data dengan One Way ANOVA adalah sebagai berikut :

i. Bukalah file One Way ANOVA

ii. AnalyzeCompare meansOne-Way ANOVA

iii. Masukkan variabel dependen kedalam Dependent List

iv. Masukkan variabel independent kedalam Factor list

v. Aktifkan kotak Options

vi. Pilih Homogenity of Variance

vii. Klik ContinueOKlakukan analisis hasil uji

8) Analisis Post Hoc :

i. Analyze Compare meansOne-Way ANOVA

ii. Masukkan variabel Dependent 1 dalam Dependent list

iii. Masukkan variabel kelompok Independent kedalam Factor list

iv. Aktifkan kkotak Post hoc

v. Pilih LSD pada kotak Equal variances Assumed

vi. Klik ContinueOKlakukan analisis

Uji Kruskal-Wallis :

1) Data yang akan diuji adalah set data > 2 kelompok dengan variabel numerik tidak

berpasangan

2) Memeriksa syarat Uji One Way ANOVA untuk >2 kelompok tidak berpasangan :


3) Distribusi data harus normal (WAJIB)

4) Varians data harus sama (WAJIB)

5) Jika syarat tidak terpenuhi maka alternatifnya dipakai uji Kruskal-Wallis

6) Jika pada Uji ANOVA atau Kruskal-Wallis menghasilkan nilai p<0,05 maka

dilanjutkan dengan melakukan analisis Post Hoc

7) Langkah uji Kruskal-Wallis adalah sebagai berikut :

i. Bukalah file data Kruskal-Wallis

ii. Analyze non-parametric testsk-independent samples

iii. Masukkan Variabel Independen kedalam Test Variable list

iv. Aktifkan Uji Kruskal-Wallis

v. Masukkan faktor dependent dalam Grouping Variabel

vi. Aktifkan Define range

vii. Masukkan angka 1 (sebagai kode buruk/lemah) pada kotak Minimum

viii. Masukkan angka 3 (sebagai kode baik/kuat) pada kotak Maksimum

ix. Klik ContinueOKlakukan analisis hasil uji


materi praktikum

Documents

Transcript of materi praktikum