6

MANFAAT SIRIH UNTUK KESEHATAN GIGI DAN MULUT

2.1 Sirih

Tanaman sirih mempunyai banyak spesies dan memiliki jenis yang beragam,

seperti sirih gading, sirih hijau, sirih hitam, sirih kuning dan sirih merah. Semua jenis

tanaman sirih memiliki ciri yang hampir sama yaitu tanamannya merambat dengan

bentuk daun menyerupai hati dan bertangkai yang tumbuh berselang seling dari

batangnya.

2.1.1 Sirih Merah (Piper Crocatum)

Tanaman sirih merah (Piper crocatum) termasuk dalam famili Piperaceae,

tumbuh merambat dengan bentuk daun menyerupai hati dan bertangkai, yang tumbuh

berselang-seling dari batangnya serta penampakan daun yang berwarna merah

keperakan dan mengkilap. Dalam daun sirih merah terkandung senyawa fitokimia

yakni alkoloid, saponin, tanin dan flavonoid. Sirih merah sejak dulu telah digunakan

oleh masyarakat yang berada di Pulau Jawa sebagai obat untuk meyembuhkan

berbagai jenis penyakit dan merupakan bagian dari acara adat (Manoi, 2007).

Penggunaan sirih merah dapat digunakan dalam bentuk segar, simplisia

maupun ekstrak kapsul. Secara empiris sirih merah dapat menyembuhkan berbagai

jenis penyakit seperti diabetes militus, hepatitis, batu ginjal, menurunkan kolesterol,

mencegah stroke, asam urat, hipertensi, radang liver, radang prostat, radang mata,

keputihan, maag, kelelahan, nyeri sendi dan memperhalus kulit. Hasil uji praklinis

pada tikus dengan pemberian ekstrak hingga dosis 20 g/kg berat badan, aman

dikonsumsi dan tidak bersifat toksik. Sirih merah banyak digunakan pada klinik

herbal center sebagai ramuan atau terapi bagi penderita yang tidak dapat di-

sembuhkan dengan obat kimia. Potensi sirih merah sebagai tanaman obat multi fungsi

sangat besar sehingga perlu ditingkatkan dalam penggunaannya sebagai bahan obat

moderen.Tanaman sirih merah (Piper crocatum) termasuk dalam famili Piperaceae,

tumbuh merambat dengan bentuk daun menyerupai hati dan bertangkai, yang tumbuh

berselang-seling dari batangnya serta penampakan daun yang berwarna merah

keperakan dan mengkilap. Dalam daun sirih merah terkandung senyawa fitokimia

yakni alkoloid, saponin, tanin dan flavonoid. Sirih merah sejak dulu telah digunakan

oleh masyarakat yang berada di Pulau Jawa sebagai obat untuk meyembuhkan

berbagai jenis penyakit dan merupakan bagian dari acara adat. Penggunaan sirih

merah dapat digunakan dalam bentuk segar, simplisia maupun ekstrak kapsul. Secara

empiris sirih merah dapat menyembuhkan berbagai jenis penyakit seperti diabetes

millitustushepatitis, batu ginjal, menurunkan kolesterol, mencegah stroke, asam urat,

hipertensi, radang liver, radang prostat, radang mata, keputihan, maag, kelelahan,

nyeri sendi dan memperhalus kulit. Hasil uji praklinis pada tikus dengan pemberian

ekstrak hingga dosis 20 g/kg berat badan, aman dikonsumsi dan tidak bersifat toksik.

Sirih merah banyak digunakan pada klinik herbal center sebagai ramuan atau terapi

bagi penderita yang tidak dapat disembuhkan dengan obat kimia. Potensi sirih merah

sebagai tanaman obat multi fungsi sangat besar sehingga perlu ditingkatkan dalam

penggunaannya sebagai bahan obat moderen (Manoi, 2007).

Sirih merah (Piper crocatum) adalah salah satu tanaman obat potensial yang

sejak lama telah diketahui memiliki berbagai khasiat obat untuk menyembuhkan

berbagai jenis penyakit, disamping itu juga memiliki nilai-nilai spritual yang tinggi.

Sirih merah termasuk dalam satu elemen penting yang harus disediakan dalam setiap

upacara adat khususnya di Jogyakarta. Tanaman ini termasuk di dalam famili

7

Piperaceae dengan penampakan daun yang berwarna merah keperakan dan

mengkilap saat kena cahaya (Manoi, 2007).

Sirih merah tumbuh merambat di pagar atau pohon. Ciri khas tanaman ini

adalah berbatang bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya

bertangkai membentuk jantung hati dan bagian ujung daun meruncing. Permukaan

daun mengkilap dan tidak merata. Yang membedakan dengan sirih hijau adalah selain

daunnya berwarna merah keperakan, bila daunnya disobek maka akan berlendir serta

aromanya lebih wangi(Manoi, 2007).

Klasifikasi sirih merah menurut Backer (1963) adalah sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Divisio : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Order : Piperales

Family : Piperaceae

Genus : Piper

Species : Piper crocatum

Tanaman sirih merah (Piper crocatum) menyukai tempat teduh, berhawa

sejuk dengan sinar matahari 60-75%, dapat tumbuh subur dan bagus di daerah

pegunungan. Bila tumbuh pada daerah panas, sinar matahari langsung, batangnya

cepat mengering. Selain itu, warna merah daunnya akan pudar (Manoi 2007).

Ramuan sirih merah telah lama dimanfaatkan oleh lingkungan kraton

Jogyakarta sebagai tanaman obat yang beguna untuk ngadi saliro. Pada tahun 1990-an

sirih merah difungsikan sebagai tanaman hias oleh para hobis, karena penampilannya

yang menarik. Permukaan daunnya merah keperakan dan mengkilap. Pada tahun-

tahun terakhir ini ramai dibicarakan dan dimanfaatkan sebagai tanaman obat. Dari

8

beberapa pengalaman, diketahui sirih merah memiliki khasiat obat untuk berbagai

penyakit. Dengan ramuan sirih merah telah banyak masyarakat yang tersembuhkan

dari berbagai penyakit. Oleh karena itu banyak orang yang ingin membudidayakannya

(Manoi, 2007).

Tanaman memproduksi berbagai macam bahan kimia untuk tujuan tertentu,

yang disebut dengan metabolit sekunder. Metabolit sekunder tanaman merupakan

bahan yang tidak esensial untuk kepentingan hidup tanaman tersebut, tetapi

mempunyai fungsi untuk berkompetisi dengan makhluk hidup lainnya. Metabolit

sekunder yang diproduksi tanaman bermacam-macam seperti alkaloid, terpenoid,

isoprenoid, flavonoid, cyanogenic, glucoside, glu-cosinolate dan non protein amino

acid. Alkaloid merupakan metabolit sekunder yang paling banyak di produksi

tanaman. Alkaloid adalah bahan organik yang mengandung nitrogen sebagai bagian

dari sistim heterosiklik. Nenek moyang kita telah memanfaatkan alkaloid dari

tanaman sebagai obat. Sampai saat ini semakin banyak alkaloid yang ditemukan dan

diisolasi untuk obat moderen (Manoi, 2007).

Para ahli pengobatan tradisional telah banyak menggunakan tanaman sirih

merah oleh karena mempunyai kandungan kimia yang penting untuk menyembuhkan

berbagai penyakit. Dalam daun sirih merah terkandung senyawa fitokimia yakni

alkoloid, saponin, tanin dan flavonoid. Dari buku ”A review of natural product and

plants as potensial antidiabetic” dilaporkan bahwa senyawa alkokoloid dan flavonoid

memiliki aktivitas hipoglikemik atau penurun kadar glukosa darah (Manoi, 2007).

Kandungan kimia lainnya yang terdapat di daun sirih merah adalah minyak

atsiri, hidroksikavicol, kavicol, kavibetol, allylprokatekol, karvakrol, eugenol, p-

cymene, cineole, caryofelen, kadimen estragol, terpenena, dan fenil propada. Karena

banyaknya kandungan zat/senyawa kimia bermanfaat inilah, daun sirih merah

9

memiliki manfaat yang sangat luas sebagai bahan obat. Karvakrol bersifat

desinfektan, anti jamur, sehingga bisa digunakan untuk obat antiseptik pada bau mulut

dan keputihan. Eugenol dapat digunakan untuk mengurangi rasa sakit, sedangkan

tanin dapat digunakan untuk mengobati sakit perut (Manoi, 2007).

Dalam Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia (JKKI) di dapatkan

kesimpulan dari bahwa ekstrak etanol sirih merah (Piper crocatum) mempunyai efek

antibakteri terhadap bakteri gram positif dan terhadap gram negatif. Konsentrasi

hambat minimum (KHM) dan Konsentrasi bunuh minimum (KBM) Staphylococcus

aureus pada konsentrasi 25% sementara untuk Escherichia coli KHM dan KBM pada

konsentrasi 6,25% (Juliantina dkk, 2011).

2.1.2 Sirih Hijau (Piper Betle L)

Daun sirih (Piper betle L) adalah nama sejenis tumbuhan merambat, daun dan

buahnya dimakan orang dikunyah bersama gambir, pinang dan kapur. Sirih termasuk

sebagai tanaman obat (fitofarmaka) (Sukmono, 2009).

Minyak atsiri dari daun sirih mengandung minyak terbang (betlephenol),

seskuiterpen, pati, diatase, gula dan zat samak dan chavicol yang memiliki daya

mematikan kuman, antioksidasi dan fungisida, anti jamur. Sirih berkhasiat

menghilangkan bau badan yang ditimbulkan bakteri dan cendawan (Sukmono, 2009).

Daun sirih juga bersifat menahan perdarahan, menyembuhkan luka pada kulit,

dan gangguan saluran pencernaan. Selain itu juga bersifat mengerutkan,

mengeluarkan dahak, meluruhkan ludah, hemostatik, dan menghentikan perdarahan

(Sukmono, 2009).

10

Sirih dikenal dalama beberapa nama Betel (Perancis), Betel, Betelhe, Vitele

(Portugal), Suruh, Sedah (Jawa), Seureuh (Sunda) dan Ju jiang (China) (Sukmono,

2009).

Tanaman merambat ini bisa mencapai tinggi 15 m. Batang sirih berwarna

coklat kehijauan, berbentuk bulat, beruas dan merupakan tempat keluarnya akar.

Daunnya yang tunggal berbentuk jantung, berujung runcing, tumbuh berselang-seling,

bertangkai, dan mengeluarkan bau yang sedap bila diremas (Sukmono, 2009).

Minyak atsiri daun Piper betel L. mempunyai aktivitas terhadap bakteri Gram

dan Bacillus subtilits, B. megaterium, Diplococcus pnemoniae, Eschericia coli,

Erwinia carotovora, Micrococcus pyogenes, proteus vulgaris, Pseudomonas

solanacearum, Salmonella typhosa, Sarcinia lutea, Shigella dysentriae, Streptococcus

pyogens, Vibrio comma (aktivitas antimikroba tersebut diperkirakan dari kavikol)

(Sukmono, 2009).

Di samping terhadap bakteri, aktivitas tersebut dapat pula terhadap berbagai

jamur (Asperlgillus niger, A. oryzae, Curvilaria lunata Fusarium oxysporum).

Triterpen dan triterpenoid dapat berefek sebagai antiplateled dan anti-inflamasi

(Sukmono, 2009).

Pada pengunyahan campuran daun Piper betel, biji pinang (Areca catechu)

dan kapur akan merubah arekolin menjadi arekaidin sehingga dapat menyebabkan

terjadinya stimulasi syaraf pusat (Sukmono, 2009).

Daya hambat terhadap pertumbuhan Staphyllococcus aureus dan Entamoeba

coli minyak atsiri yang diperoleh dengan metode ekstraksi lebih kuat dari pada

minyak atsiri yang diperoleh secara destilasi (Sukmono, 2009).

Minyak atsiri daun pada pengenceran 1:10.000 dapat mematikan

Paramoecium caudatum dalam jangka waktu 5 menit; sedangkan pada pengenceran

11

1:4000 dapat menghambat pertumbuhan Vibrio cholerae. Pengenceran 1:3000 dan

1:2000 dapat menghambat berturut-turut Salmonella typhosum, Shigella flexneri dan

Escherichia coli, Micrococcus pyogenes var. aureus. Krotepoksida mempunyai

potensi sitotoksik. Senyawa fenolik bunga Piper betle dapat berefek pada sekresi

katekolamin (Sukmono, 2009).

Di masyarakat sirih hijau dipakai untuk tujuan pengobatan pada hidung

berdarah (mimisen-Jawa), mulut berbau, mata sakit, radang tenggorokan. Daun

dikunyah bersama kapur (injet-Jawa) bersama biji pinang untuk penguat gigi dan

stimulansia; Campuran tersebut berasa pedas, astringent; menyebabkan air ludah

berwarna merah dan gigi menjadi berwarna hitam (Wijayakusuma, 2009).

Banyak digunakan untuk pengobatan penyakit asma, rheumatic arthritis,

rheumatalgia, luka-luka (Wijayakusuma, 2009).

2.1.3 Mekanisme Daun Sirih Membunuh Bakteri

Komponen aktif sirih hijau yaitu kavikol dan fenol, yang merupakan turunan

fenol dan sirih merah mengandung Flavonoid dan polifenolat yang merupakan

senyawa fenol (Juliantina, 2010; Hayne, 1987).

Fenol atau asam karbolat atau benzonel adalah zat kristal tidak berwarna yang

memiliki bau khas. Rumus kimianya adalah C6H5OH dan strukturnya memiliki gugus

hidroksil (-OH). Fenol memiliki sifat kelarutan terbatas dalam air, cenderung asam,

dan mempunyai titik didih yang tinggi. Daya bunuhnya disebabkan fenol

mempresipitasikan protein secara aktif, dan merusak membran sel dengan cara

menurunkan tegangan permukaannya (Waluyo, 2004).

12

Fenol terhidroksilasi yang bersifat toksik terhadap bakteri. Sisi dan jumlah

grup hidroksil pada fenol memiliki hubungan dengan toksisitas terhadap bakteri.

Hidroksi yang meningkat menyebabkan toksisitas yang meningkat. Mekanisme

terhadap toksisitas fenolik terhadap bakteri meliputi inhibitor enzim oleh senyawa

yang teroksidasi, kemungkinan melalui reaksi dengan grup sulfidril atau melalui

interaksi non spesifik dengan protein (Rini dan Mulyono, 2003).

Kavikol pada sirih hijau merupakan turunan fenol, dan mempunyai daya

antibakteri lima kali lebih kuat dari pada fenol. Kavikol inilah yang memberi bau khas

pada daun sirih. Fenol memiliki kemampuan untuk mendenaturasi protein dan

merusak membran sel. Kehadiran fenol yang merupakan senyawa toksik,

mengakibatkan struktur tiga dimensi protein terganggu, dan terbuka menjadi struktur

acak tanpa adanya kerusakan pada struktur kerangka kovalen. Hal ini menyebabkan

protein terdenaturasi. Deret asam amino protein tersebut tetap utuh setelah denaturasi,

namun aktivitas biologisnya menjadi rusak, sehingga protein tidak dapat melakukan

fungsinya. Akibat yang ditimbulkan karena ikatan yang dibentuk oleh fenol adalah

dinding sel bakteri menjadi tidak stabil, dan pengendalian susunan protein bakteri

menjadi terganggu. Kerusakan dinding sel tersebut berakibat pada lolosnya

makromolekul, dan ion dari sel. Sel bakteri menjadi kehilangan bentuknya, dan

terjadilah lisis (Rini, 2005; Heyne, 1987).

Perbedaan kandungan kimia antara daun sirih hijau dan daun sirih merah juga

terletak pada kandungan flavanoid dan polifenolat, yang terdapat dalam sirih merah,

dimana keduanya memiliki efek yang besar untuk menghambat sintesis protein

bakteri gram positif seperti S. mutans, dan kurang efektif terhadap bakteri gram

negatif. Pada tumbuhan tingkat tinggi kandungan flavanoid lebih banyak dari pada

polifenolat, tetapi keduanya memiliki sifat yang hampir sama. Cara kerja

13

antibakterinya sebagai koagulator protein bakteri, sehingga mengakibatkan protein

menggumpal dan tidak dapat berfungsi lagi (Dwidjoseputro, 1994; Robinson, 1995)

2.1.4 Ektraksi Daun Sirih

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair (Armando,

2005).

Ada beberapa metode ekstraksi, yaitu :

1. Cara Dingin

a. Maserasi

Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut

dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (kamar).

Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan

penyaringan maserat pertama, dan seterusnya (Armando, 2005).

b. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna

yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan. Proses terdiri dari tahap

pengembangan bahan, tahap maserasi antara dan tahap perkolasi sebenarnya

(penetesan/penampungan) (Armando, 2005).

2. Cara Panas

a.Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titih didihnya, selama

waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya

pendingin balik (Armando, 2005).

14

b. Sokletasi

Sokletasi adalah ekstraksi dengan menggunakan pelarut yang selalu baru yang

umumnya dilakukan dengan menggunakan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi

kontiniu dengan jumlah pelarut yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik

(Armando, 2005).

c. Digesti

Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur

yang lebih tinggi dari temperatur ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada

temperatur 40-50 C (Armando, 2005).

d. Infus

Infus adalah proses penyarian yang umumnya digunakan untuk menyari zat

kandungan aktif yang larut dalam air dari bahan-bahan nabati. Infus adalah sediaan

cair yang dibuat dengan menyari simplisia menggunakan air pada temperatur 96-980

C selama 15-20 menit (Armando, 2005).

e. Dekok

Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama ( ≥ 300 C) dan temperur

sampai titik didih air (Armando, 2005).

Metode ekstraksi yang digunakan untuk membuat ekstrak baik dari sirih

merah maupun sirih hijau adalah metoda ekstraksi Soxhlet. Metoda ini merupakan

pengembangan dari metoda maserasi dengan kelebihan antara lain: penggunaan

jumlah pelarut yang sedikit, ekstrak langsung terpisah dari sampel, waktu yang relatif

singkat. Ekstraksi sampel dilakukan secara bertahap menggunakan 3 pelarut yaitu n-

heksana, etilasetat dan etanol, sehingga diperoleh fraksi-fraksi ekstrak. Setiap

tahapan ekstraksi yang dilakukan diharapkan akan mengekstrak senyawa yang

15

mempunyai kepolaran sesuai dengan kepolaran pelarut yang sesuai kaidah ”like

dissolve like” (Armando, 2005).

Komponen yang dapat terekstrak diharapkan semaksimal mungkin karena

setiap tahapan ekstraksi dihentikan setelah pelarut yang keluar dari ekstraktor sudah

tidak berwarna (+ 20 sirkulasi). Ekstraksi komponen daun sirih dilakukan

menggunakan Soxhlet dengan metode ekstraksi bertahap, menggunakan pelarut non

polar (n-heksana) dilanjutkan dengan pelarut yang kepolarannya sedang (etilasetat)

dan terakhir menggunakan pelarut polar etanol. Pelarut n-heksana merupakan pelarut

non polar, sehingga ekstraksi menggunakan pelarut n-heksana diharapkan yang

terekstrak senyawa-senyawa yang mempunyai kepolaran yang rendah. Ekstraksi

menggunakan pelarut etilasetat yang merupakan pelarut dengan kepolaran sedang,

maka diharapkan yang terekstrak senyawa-senyawa dengan kepolaran yang sedang,

sedangkan pelarut etanol dengan kepolaran yang tinggi, diharapkan dapat

mengekstrak senyawa-senyawa yang mempunyai kepolaran tinggi (Armando, 2005).

Fraksi n-heksana akan menunjukkan komponen non-polar dari daun sirih yang

kemungkinan merupakan senyawa minyak atsiri, lemak atau minyak. Etilasetat

diharapkan akan mengekstrak komponen daun sirih yang semi polar. Tidak terlalu

banyak senyawa yang dapat terekstrak dalam pelarut yang bersifat semi polar

dibandingkan dengan fraksi n-heksana dan sekaligus hal juga menunjukkan bahwa

penggunaan n-heksana sebagai pelarut pengekstrak awal berhasil memfraksinasi

komponen non-polar dari daun sirih merah. Fraksi etanol lebih sederhana tampilan

kromatogramnya dan menunjukkan bahwa hanya senyawa yang bersifat polar yang

terdapat di dalam fraksi etanol dengan waktu retensi berkisar 28 – 32 menit, sehingga

fraksi etanol ini relatif terbebas dari komponen non-polar dan semi polar (Armando,

2005).

16

2.2 Streptokokus Mutans

Klasifikasi Streptococcus mutans menurut Bergey adalah :

Divisi : Firmiculares

Kelas : Firmicutes

Ordo : Lactobacilalles

Famili : Streptococcaceae

Genus : Streptococcus

Species : Streptococcus mutans

(Kidd & Bechall, 1991)

Streptococcus mutans adalah salah satu jenis bakteri yang mempunyai

kemampuan dalam proses pembentukan plak dan karies gigi. Bakteri ini pertama kali

diisolasi dari plak gigi oleh Clark pada tahun 1924 yang memiliki kecendrungan

membentuk kokus dengan formasi rantai panjang apabila ditanam pada medium (Kidd

& Bechall, 1991)

Streptococcus mutans menjadi yang paling banyak menyebabkan gigi

berlubang di sekitar luka tetapi sampai pada tahun 1960-an mikroba tersebut tidak

ditemukan (Kidd & Bechall, 1991)

Streptococcus mutans merupakan bakteri gram positif, bersifat nonmotil (tidak

bergerak), bakteri anaerob fakultatif. Memiliki bentuk kokus berbentuk bulat atau

bulat telur dan tersusun dalam rantai. Bakteri ini tumbuh secara optimal pada suhu

sekitar 180C – 400C. Streptococcus mutans biasanya ditemukan pada rongga gigi

manusia yang luka dan menjadi bakteri yang paling kondusif menyebabakan karies

untuk email gigi (Kidd & Bechall, 1991)

17

Streptococcus mutans adalah bersifat asidogenik yaitu menghasilkan asam,

asidourik, mampu tinggal pada lingkungan asam, dan menghasilkan suatu

polisakarida yang dapat melekat, yang disebut dextran. Oleh karena kemampuan ini,

S. mutans bisa menyebabkan melekatnya dan mendukung bakteri lain menuju ke

email gigi. Dengan demikian pH turun dan keadaan pH asam ini dapat melarutkan

email gigi sehingga terjadi karies gigi (Kidd & Bechall, 1991).

2.3 Uji Aktivitas Antibakteri

Kemampuan antimikroba dalam melawan bakteri dapat diukur menggunakan

metode yang biasa dilakukan yaitu (Jawetz dkk, 2008):

A. Metode konvensional : dilusi (agar atau kaldu), difusi dan Etest

B. Uji kepekaan komersial

2.3.1 Persiapan Sebelum Uji Dilakukan

Beberapa persiapan yang diperlukan untuk melaksanakan uji dengan metode

dilusi dan difusi yaitu meliputi persiapan inokulum dan antimikroba yang akan

digunakan (Dwidjoseputro, 1994; Jawetz dkk, 2008).

2.3.1.1 Persiapan Inokulum

Persiapan inokulum yang tepat penting untuk uji kepekaan untuk mendapatkan

hasil yang akurat dan konsisten. Ada dua persiapan yang harus dilakukan yaitu:

biakan murni dan pembuatan inokulum standar (Jawetz dkk, 2008).

Biakan murni diperlukan karena interpretasi berdasarkan inokulum

yang tercampur tidak dapat diterima dan akan menghambat mendapatkan hasil.

Biakan murni dilakukan dengan mengambil empat atau lima koloni yang sama secara

18

morfologi dan ditanam pada media perbenihan cair dan dibiarkan tumbuh subur, pada

umumnya memerlukan waktu inkubasi 3 sampai 5 jam. Bisa juga sebagai alternative

4 sampai 6 koloni berusia 16 sampai 24 jam dipilih dari media agar dan dibuat

suspensi dengan NaCl 0,85% untuk mendapatkan suspensi yang keruh. Kemudian

kekeruhan dibandingkan dengan suspensi standar Mc Farland, pada latar belakang

hitam. Standar Mc Farland dibuat dengan mencampur asam sulfat 1% dan barium

klorida 1,175% untuk mendapatkan kekeruhan standar. Standar kekeruhan 0,5 Mc

Farland telah tersedia secara komersial, yang memiliki kekeruhan sebanding dengan

1,5 x 108 colony forming unit (CFU)/ml (Jawetz dkk, 2008).

2.3.1.2 Memilih Antimikroba Untuk Uji Kepekaan

Pemilihan antimikroba dilakukan oleh staf medis terutama dokter spesialis

penyakit infeksi dan bila perlu disertai ahli farmasi. Pemilihan berdasarkan kelompok

bakteri, hasil identifikasi bakteri (karena ada beberapa antimikroba spesifik hanya

untuk bakteri tertentu. Deretan antimikroba secara umum didasarkan pada kelompok

organisme ,secara umum dibagi menjadi (Dwidjoseputro, 1994):

i. Enterobacteriaceae

ii. Pseudomonas aeruginosadan Acinetobacterspp

iii. Staphylococcusspp

iv. Enterococcus spp

v. Streptococcus spp (kecuali S. pneumoniae)

vi. Streptococcus pneumonia

vii. Haemophilus influenza

viii. Neisseria gonorrhoeae

19

2.3.2 Metode Konvensional

2.3.2.1 Metode Dilusi

Metode dilusi terdiri dari dua teknik pengerjaan yaitu teknik dilusi perbenihan

cair dan teknik dilusi agar. Yang bertujuan untuk penentuan aktifitas antimikroba

secara kuantitatif, antimikroba dilarutkan kedalam media agar atau kaldu, yang

kemudian ditanami bakteri yang akan dites. Setelah diinkubasi semalam, konsentrasi

terendah yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri di sebut dengan MIC (minimal

inhibitory concentration). Nilai MIC dapat pula dibandingkan dengan konsentrasi obat

yang didapat di serum dan cairan tubuh lainnya untuk mendapatkan perkiraan respon

klinik (Ansel, 1989; Jawetz dkk, 2008)

a) Dilusi perbenihan cair

Dilusi perbenihan cair terdiri dari makrodilusi dan mikrodilusi. Pada

prinsipnya pengerjaannya sama hanya berbeda dalam volume. Untuk makrodilusi

volume yang digunakan lebih dari 1 ml, sedangkan mikrodilusi volume yang

digunakan 0,05 ml sampai 0,1 ml. Antimikroba yang digunakan disediakan pada

berbagai macam pengenceran biasanya dalam satuan µg/ml, konsentrasi bervariasi

tergantung jenis dan sifat antibiotik. (misalnya cefotaxime untuk uji kepekaan

terhadap Streptococcus pneumonia, pengenceran tidak melebihi 2 μg/ml, sedangkan

untuk Escherichia coli pengenceran dilakukan pada 16 µg/ml atau lebih) (Ansel,

1989; Jawetz dkk, 2008).

Secara umum untuk penentuan MIC pengenceran antimikroba dilakukan

penurunan konsentrasi setengahnya misalnya mulai dari 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,25

µg/ml) konsentrasi terendah yang menunjukkan hambatan pertumbuhan dengan jelas

baik dilihat secara visual atau alat semiotomats dan otomatis, disebut dengan

20

konsentrasi daya hambat minimum/ MIC (minimal inhibitory concentration) (Ansel,

1989; Jawetz dkk, 2008)

.

b) Dilusi agar

Pada teknik dilusi agar, antibiotik sesuai dengan pengenceran akan

ditambahkan kedalam agar, sehingga akan memerlukan perbenihan agar sesuai jumlah

pengeceran ditambah satu perbenihan agar untuk kontrol tanpa penambahan

antibiotik, konsentrasi terendah antibiotik yang mampu menghambat pertumbuhan

bakteri merupakan MIC antibiotik yang di uji. Salah satu kelebihan metode agar dilusi

untuk penentuan MIC Neisseria gonorrhoeae yang tidak dapat tumbuh pada teknik

dilusi perbenihan cair (Ansel, 1989; Jawetz dkk, 2008).

c. Penentuan MBC dari MIC perbenihan cair

Dasar penentuan antimikroba secara invitro adalah MIC (minimum inhibition

concentration) dan MBC (minimum bactericidal concentration). MIC merupakan

konsentrasi terendah bakteri yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan

hasil yang dilihat dari pertumbuhan koloni pada agar atau kekeruhan pada pembiakan

kaldu. Sedangkan MBC adalah konsentrasi terendah antimikroba yang dapat

membunuh 99,9% pada biakan selama waktu yang ditentukan.Agar antimikroba

efektif pada MIC atau MBC. Sedapat mungkin mencapai tempat infeksi. Absorpsi

obat dan distribusi antimikroba akan mempengaruhi dosis, rute dan frekuensi

pemberian antimikroba untuk mendapatkan dosis efektif di tempat terjadinya infeksi

(Ansel, 1989; Dwidjoseputro, 1994; Jawetz dkk, 2008)

21

Penentuan konsentrasi minimum antibiotik yang dapat membunuh bakteri /

minimum bactericidal concentration (MBC) dilakukan dengan menanam bakteri pada

perbenihan cair yang digunakan untuk MIC ke dalam agar kemudian diinkubasi

semalam pada 37ºC. MBC adalah ketika tidak terjadi pertumbuhan lagi pada agar

(Ansel, 1989; Dwidjoseputro, 1994; Jawetz dkk, 2008)

.

2.3.2.2 Metode Difusi.

Cakram kertas, yang telah dibubuhkan sejumlah tertentu antimikroba,

ditempatkan pada media yang telah ditanami organism yang akan di uji secara merata.

Tingginya konsentrasi dari antimikroba ditentukan oleh difusi dari cakram dan

pertumbuhan organism uji dihambat penyebarannya sepanjang difusi antimikroba

(terbenuk zona jernih disekitar cakram), sehingga bakteri tersebut merupakan bakteri

yang sensitif terhadap antimikroba. Ada hubungan persamaan yang hampir linear

(berbanding lurus) antara log MIC, seperti yang diukur oleh metode dilusi dan

diameter zona daya hambat pada metode difusi (Ansel, 1989; Jawetz dkk, 2008)..

Hasil dari tes kepekaan, mikroorganisme diklasifikasikan ke dalam dua atau

lebih kategori. Sistim yang sederhana menentukan dua kategori yaitu sensitif dan

resisten. Meskipun klasifikasi tersebut memberikan banyak keuntungan untuk

kepentingan statistik dan epidemiologi, bagi klinisi merupakan ukuran yang terlalu

kasar untuk digunakan. Dengan demikian hasil dengan 3 klasifikasi yang biasa

digunakan, (sensitif, intermediate, dan resisten) seperti pada metode Kirby-Bauer.

Terapi antimikroba idealnya berdasarkan penentuan bakteri penyebab dan

antimikroba sesuai yang sensitif terhadap bakteri tersebut (Ansel, 1989; Jawetz dkk,

2008).

22

Di laboratorium klinik, uji kepekaan lebih banyak digunakan metode cakram

difusi. Pada metode ini inokulum bakteri ditanam secara merata pada permukaan agar.

Cakram antimikroba diletakkan pada permukaan agar dan dibiarkan berdifusi ke

dalam media sekitarnya. Hasilnya dilihat zona hambat antimikroba terhadap

pertumbuhan bakteri. Ukuran zona jernih tergantung kepada kecepatan difusi

antimikroba, derajat sensitifitas mikroorganisme dan kecepatan pertumbuhan bakteri.

Zona hambat cakram antimikroba pada metode difusi berbanding terbalik dengan

MIC. Semakin luas zona hambat, maka semakin kecil konsentrasi daya hambat

minimum MIC. Untuk derajat kategori bakteri dibandingkan terhadap diameter zona

hambat yang berbeda-beda setiap antimikroba, sehingga dapat ditentukan kategori

resisten, intermediate atau sensitif terhadap antimikroba uji (Ansel, 1989; Jawetz dkk,

2008).

Uji kepekaan Metode agar difusi Kirby-Bauer:

Bahan yang diperlukan :

ü Agar Muller Hinton

ü Cakram antibiotik

ü Inokulum Standar Mc farland 0,5

(Ansel, 1989; Dwidjoseputro, 1994; Jawetz dkk, 2008)

Cara kerja:

1) Disiapkan agar Muller Hinton kondisikan pada suhu ruangan dan

permukaan agar kering

23

2) Persiapkan inokulum 0,5 Mc Farland (dibuat baru dari 4-6 koloni dalam

2 ml NaCl fisiologis, digunakan tidak lebih dari 15 menit dan supaya homogen bisa

dibantu dengan vortex

3) Penanaman pada agar Muller Hinton

Celupkan swab steril ke dalam inokulum bakteri , angkat swab kemudian di

atas permukaan suspensi inokulum pada sisi tabung putar swab dengan sedikit ditekan

agar tidak berlebih

4) Goreskan swab pada agar Muller Hinton dengan memutar agar sekitar 60

derajat 2 sampai 3 kali untuk memastikan seluruh permukaan agar tergores

5) Putarkan swab pada pinggiran agar untuk mengambil kelebihan suspensi

bakteri pada sekeliling cawan petri

6) Tempatkan cakram antibiotik pada permukaan agar yang telah ditanami

bakteri dengan memperhatikan jarak penyimpanan cakram. Dapat dilakukan

menggunakan pinset steril atau disk feeder (Ansel, 1989; Dwidjoseputro, 1994;

Jawetz dkk, 2008)

2.3.2.3 E-test

Metode yang digunakan selain metode Kirby-Bauer dalam uji kepekaan adalah

E-test (Epsilometer test) yang juga berdasarkan prinsip difusi. E-test digunakan untuk

pemeriksaan mikrobiologis untuk kepekaan bakteri dan jamur (Dwidjoseputro, 1994).

Etest menggunakan strip persegipanjang yang telah mengandung antibiotik.

Bakteri ditanam pada perbenihan agar kemudian diletakkan strip Etest pada

permukaan agar, setelah antibiotik berdifusi ke dalam agar akan terbentuk zona

hambat pada konsentrasi antibiotik yang bertingkat terdapat pada strip Etest. Setelah

24 jam inkubasi akan tampak zona hambat yang berbentuk elips, ketika sampai pada

24

garis zona yang telah melekat pada strip (tidak ada zona hambat lagi) pada

konsentrasi tersebut merupakan pembacaan hasil MIC (Dwidjoseputro, 1994).

2.3.3 Uji kepekaan Metode Komersial

Pada dasarnya metode komersial merupakan penggabungan metode

konvensial dilusi dan difusi dan keakuratan metode komersial ini dievaluasi dengan

cara membandingkan dengan metode konvensional. Media perbenihan , kondisi

lingkungan disesuaikan dengan standar metode konvensional dan ujuan dari metode

tetap sama seperti metode konvensional, hanya pengerjaan dan cara penggunaan

alatnya yang lebih praktis, dimana pencapaian tujuan bervariasi tergantung kepada

(Sacher dan McPherson, 2000):

Susunan bakteri dan komposisi antimikroba yang digunakan

Tingkat otomatisasi dalam penanaman, inkubasi, interpretasi dan

pelaporan

Metode yang digunakan untuk mengukur hambatan pertumbuhan

bakteri

Kecepatan memperoleh hasil

Akurasi

Jenis-jenis Metode komersial (Sacher dan McPherson, 2000) :

1. Metode mikrodilusi perbenihan cair (broth microdilution methods)

2. Secara umum metode ini didesain untuk menrima inokulum dan diinkubasi

pada kondisi sesuai petunjuk penggunaan, biasanya untuk pembacaannya

memerlukan alat semiotomatis.

3. Agar dilusi derivatif (agar dilution derivations)

25

4. Pada metode ini telah disediakan perbenihan agar yang telah mengandung

antimikroba melingkar, dimulai dari tengah-tengah /pusat lingkaran

perbenihan agar dengan konsentrasi tertinggi, terus melingkar ke arah tepi

dengan konsentrasi semakin menurun. Penanaman bakteri dimulai dari tepi

perbenihan dengan satu goresan tegak lurus. Difusi antibiotik akan tampak

zona hambat dari konsentrasi tinggi (pusat lingkaran) ke rendah (tepi)

5. Difusi pada agar derivatif (diffusion in agar derivations)

6. Pada metode ini digunakan perbenihan Muller Hinton yang diletakkan di

atasnya strip antibiotik secara melingkar

7. System pengujian otomatis (automated antimicrobial susceptibility test

system)

8. Metode ini dalam persiapan inokulum dan penanamam bakteri dilakukan

secara otomatis, cara pembacaan dan interpretasi kategori menggunakan

system algoritma

9. Metode pengujian alternative dan suplemen. Metode pengujian yang

bertujuan untuk mengetahui mekanisme resistensi

10. Metode yang langsung mendeteksi mekanisme resistensi spesifik

11. Metode dengan pengukuran antimikroba berdasarkan keberadaan

mekanisme khusus, misalnya berdasarkan metode fenotip, deteksi

asetiltransferase kloramfenikol.

12. Metode khusus untuk mendeteksi kompleks interaksi antimikroba-organisme

13. Tes kombinasi aktifitas antimikroba

14. Spiral Gradient Endpoint Test (SGE), merupakan uji kepekaan pada satu

agar terdiri dari 15 suspensi mikroba dapat digoreskan swab dengan arah

memutar melalui beberapa konsentrasi. Software dibutuhkan untuk

26

menghitung konsentrasi yang sebenarnya dari setiap mikroba yang tumbuh

yang menghambat pertumbuhan. Teknik ini digunakan untuk

menghilangkan keterbatasan metode konvensional dimana setiap media agar

hanya satu konsentrasi, menghemat waktu dan bahan karena satu plate SGE

sama dengan 8 plate pada metode konvensional (Sacher dan McPherson,

2000).

27