Makalah Seminar

5/21/2018 Makalah Seminar

1/18

1

I.

Pendahuluan

Amlodipine besylate (AML), 2-[(2-amino etoksi-(metil]-4-(2-klorofenil)-

1,4-dihidro-6-metil-3,5-piridin asam dikarboksilat 3-etil-5-metil ester,

benzosulfonat, adalah kalsium dihidropiridin ampuh sebagai agen antihipertensi.

Valsartan (Vals)N-[p-(O-1H-Tetrazol-5-ylphenyl)benzil]-N-valeryl-L-valin,

adalah angiotensin II reseptor blocker dan secara klinis digunakan sebagai agen

antihipertensi. Hidroklorotiazid (HCT),6-kloro-3,4-dihidro-2H-1,2,4-

benzothiadiazine-7-sulfonamida digunakan sebagai diuretik. AML resmi di BP,

Vals resmi di EP dan USP, sedangkan HCT resmi di BP dan EP. USP (The United

States Pharmacopeia) adalah standar resmi untuk resep semua obat-obatan,

suplemen makanan, eksipien dan produk kesehatan lainnya yang diproduksi dan

dijual di Amerika Serikat. BP (British Pharmacopoeia) dan EP (European

Pharmacopoeia) adalah obat standar lainnya. Ketiga obat ini dipasarkan sebagai

formulasi tablet dosis gabungan dalam rasio 10:160:12,5 mg (AML:Vals:HCT).

Survei literasi mengungkapkan bahwa sejumlah metode telah digunakan untuk

estimasi AML, Vals dan HCT secara individual atau dalam kombinasi dengan

obat lain. Namun, sangat sedikit metode analisis yang digunakan untuk analisis

simultan dari obat ini dalam formulasi dosis gabungan. Metode yang telah

digunkan adalah spektrofotometri UV, HPLC Spectrofluorimetric, HPTLC,

elektroforesis kapiler dan metode elektrokimia.

Tujuan dari penelitian tersebut adalah pengembangan metode analisis yang

sederhana, sensitif dan akurat untuk penentuan dari amlodipine besylate, valsartan

dan hidroklorotiazid secara simultan dalam campuran tanpa perlu adanya

pemisahan sebelumnya. Metode yang dikembangkan mampu menentukan konten

dari obat dikutip dalam tablet komersial dan ditambahkan sedikit dalam plasma

manusia.


2/18

2

II.

Pengembangan dan Validasi Metode HPLC untuk Penentuan

Simultan dari Amlodipine, Valsartan, Hidroklorotiazid dalam

Dosis Obat dan Sejumlah Plasma Manusia

2.1 Tinjauan Pustaka

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) adalah salah satu teknik

kromatografi dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair.

Pemisahan dengan kromatografi ini didasarkan pada perbedaan

kesetimbangan komponen-komponen campuran diantara fasa gerak dan fasa

diam. (Hendayana, 2005: 243)

Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut, dengan bantuan pompa,

fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor, cuplikan dimasukkan ke

dalam fasa gerak dengan penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan

kompenen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara

solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya

dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu, sebaliknya solut-

solut yang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih

lama. Setiap komponen campuran yang keluar dideteksi oleh detektor

kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Kromatogram HPLC serupa

dengan kromatogram gas. (Hendayana, Sumar.2006:69)

Gambar 1. Diagram kromatografi Cairan Kinerja Tinggi atau HPLC

Selain untuk pemisahan, kromatografi juga berguna untuk analisis

kualitatif atau analisis kuantitatif yang cepat (beberapa menit) dan


3/18

3

memerlukan sedikit cuplikan (beberapa mikroliter). Komputer dapat

digunakan untuk mengontrol sistem kerja HPLC dan mengumpulkan serta

mengolah data hasil pengukuran HPLC.

Komponen-komponen atau instrumentasi dari HPLC ialah sebagai berikut :

1. Fasa gerak

Fasa gerak berupa zat cair yang disebut eluen (pelarut) dalam HPLC, fasa

gerak selain bertugas membawa komponen-komponen campuran menuju

detektor, juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Pada penelitian yang

dilakukan, mode elusi yang digunakan yaitu elusi isokratik, yaitu hanya

digunakan satu macam pelarut dengan komposisi yang sama. Mode

lainnya yaitu gradien, pada elusi ini digunakan 2 macam pelarut yang

perbandingannya diubah-ubah secara kontinyu selama proses elusi. Fasa

gerak yang digunakan pada analisis yang dilakukan peneliti adalah

asetonitril-buffer fosfat (0,05 M), pH 2,80,2 di proporsi (40/60, v/v).

2.

Pompa

Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair malalui

kolom yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi

dalam metoda ini sebagai akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat

cair yang akan sukar mengalir dalam kolom yang dipadatkan dengan sebuk

halus.Oleh karenanya agar zat cair dapat melewati kolom secara cepat

maka dibutuhkan bantuan pompa bertekanan tinggi.

3. Pemasukan cuplikan

Kebanyakan pemasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan

band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecil

mungkin, beberapa puluh miroliter. Teknik pemasukan cuplikan kedalamsistem HPLC melalui injeksi srynge, injeksi stop-flow, dan kran

cuplikan.

4. Kolom

Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang

terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utma berisi fasa diam, tepat

teradinya pemisahan camppuran menjadi komonen-komponennya.

Bergantung keperluannya koom utama dapat digunakan untuk analisis atau


4/18

4

preparatif. Untuk keperluan preparatif, setiap komponen yang keluar

kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC

dihubungkan dengan fraction colector. Selain kolom utama dikenal pula

kolom pengaman (guard kolom). Kolom utama berisi fasa diam dan

jenisnya bervariasi bergantung keperluan, misalnya dikenal kolom C-18,

C-8, cyanopropyl, penularan ion. Pada kolom yang digunakan dalam

penelitian ini adalah dengan fasa diam jenis C-18. Fasa diam jenis terikat

ini dapat dibuat dengan mereaksikan silika dengan alkilklorosilana yang

dikenal dengan reaksi silanisasi.

5. Detektor

Detektor HPLC dikelompokkan ke dalam tiga jenis detektor yaitu detektor

umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan

adanya solut. Sebaliknya, detektor spesifik memberi respon terhadap

beberapa sifat solut yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detektor

yang brsifat umum terhadap solut setelah fasa gerak dihilangkan dengan

penguapan.

Tabel 1. Karakteristik detektor HPLC

Dasar Pendeteksian JenisMaksimum

Sensitifitas

Peka terhadap

kecepatan alir

Sensitivitas

suhu

Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-

Tidak Rendah

Absorbsi IR Spesifik 10-

Tidak Rendah

Flourometri Spesifik 10- Tidak Rendah

Indek bias Umum 1 x 10-

Tidak + 10-

C

Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% C

Spektometri massa Umum 10-

Tidak Tidak ada

Elektrokimia Spesifik 10- Ya 1,5 % C

Dalam penelitiannya, peneliti menggunakan detektor UV. Detektor ini

terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organik. Semua

senyawa organik dapat mengabsorpsi cahaya, sebab semua senyawa

organik mengandung elektron valensi yang dapat dieksitasi ke tingkat

energi yang lebih tinggi. Namun, pengabsorpsian sinar ultra violet yang


5/18

5

panjang gelombangnya lebih besar terbatas pada sejumlah gugus

fungsional (disebut chromopore) yang mengandung elektron valensi

dengan energi eksitasi rendah. (Hendayana,1994:156).

Penyerapan sinar tampak atau ultraviolet oleh suatu molekul dapat

menyebabkan terjadinya eksitasi molekul tersebut dari tingkat energi dasar

(ground stated) ke tingkat energi yang lebih tinggi (excited stated). Proses

ini melalui dua tahap:

Tahap 1 : M + hvM*

Tahap 2 : M* M +heat

Pengabsobsian sinar ultra violet atau sinar tampak oleh suatu molekul

umumnya menghasilkan eksitasi elektron bonding; akibatnya, panjang

gelombang absorbsi maksimum dapat dikorelasikan dengan jenis ikatan

yang ada di dalam molekul yang sedang diselidiki. (Hendayana, 1994:

155-156)

Zat yang dianalisis kadarnya dalam sampel peneliti yaitu Amlodipine,

Valsartan, dan Hidroklorotiazid. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur

panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang digunakan

dapat dipilih yaitu 230 nm sesuai dengan jenis cuplikan yang diukur.

Berikut ini adalah struktur dari ketiga molekul diatas :

6. Rekorder

Untuk mencetak hasil percobaan pada lembaran kertas berupa kumpulan

puncak (kromatogram). Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan

dicatat sebagai puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai

kromatogram.


6/18

6

2.2 Alat dan Bahan

2.2.1Alat

Alat yang digunakan adalah HPLC 1200 series, terdiri dari vakum

degasser, auto injektor, oven kolom G1316A/G1316B, detektor UV, pompa

quatenary (Jerman). Kolom kromatografi; Phenomenex Kinetex (150 4,6

mm i.d) P.N. 00F-4462-E0. Puncak kromatografi secara elektronik

terintegrasi dan dicatat dengan menggunakan software chemstation (Agilent

Chemstation V. B.03.01, Jerman).

2.2.2Bahan

Bahan yang digunakan adalah Amlodipine, Valsartan dan

Hidroklorotiazid. Tablet formulasi obat gabungan yang digunakan adalah

Exforge HCT (B.No. B8022) yang mengandung 10 mg AML, 160 mg Vals

dan 12,5 mg HCT per tablet. Untuk fasa gerak digunakan asetonitril, kalium

dihidrogen fosfat dan asam ortofosfat. Dalam preparasi fasa gerak

menggunakan air suling ganda.

2.3

Kondisi Kromatografi

Analisis kromatografi dilakukan pada rentang suhu (22C-25C).

Senyawa dipisahkan secara isokratik dengan fase gerak yang terdiri dari

asetonitril-penyangga fosfat (0,05 M), pH 2,80,2 di proporsi (40/60, v/v),

laju alir 0,8 mL/menit dan volume injeksi 20 L. Eluen dipantau

spektrofotometri pada panjang gelombang 227 nm. Fase gerak disaring

dengan melewati 0,45 L membran filter (Millipore, Bradford, MA), dan

kemudian diultrasonik selama 15 menit.

2.4 Prosedur Kerja

2.4.1Penyiapan Larutan Stok

Larutan stok primer dari AML, Vals dan HCT disiapkan secara

terpisah dengan melarutkan 25 mg masing-masing dalam labu volumetrik

25 mL (1,0 mg/mL).


7/18

7

2.4.2Pembuatan Larutan Standar

Larutan standar disiapkan dari pengenceran larutan stok dengan fasa

gerak untuk menghasilkan rentang konsentrasi 4-28 g/mL untuk AML, 5-

40 g/ml untuk Vals dan 1-12 g/ml untuk HCT. Injeksi 20 L dilakukan

tiga kali untuk masing-masing konsentrasi dan dikromatografi dengan

kondisi yang dijelaskan di atas. Area puncak dari masing-masing

konsentrasi diplot terhadap konsentrasi untuk mendapatkan grafik kalibrasi

dan persamaan regresi dihitung.

2.4.3Penyiapan Sampel Dosis Tablet

Kandungan dari dua puluh tablet pada label terdapat 10 mg AML,

160 mg Vals dan 12,5 mg HCT yang masing-masing ditimbang, dicampur

dan dihaluskan dalam mortar. Jumlah dari bubuk tersebut yang setara

dengan isi satu tablet ditimbang secara akurat, dimasukkan ke dalam labu

volumetrik 100 mL dan diencerkan dengan fase gerak. Larutan sampel

kemudian disaring menggunakan filter 0,45 m (Millipore, Milford, MA).

Prosedur diselesaikan seperti yang disebutkan di atas dan konsentrasi AML

dan PER diperoleh dari persamaan regresi yang sesuai.

2.4.4Penyiapan dari Sejumlah Sampel Serum

Untuk 1,0 mL plasma, 100 L dari masing-masing larutan standar

dipipet ke dalam 5 mL tabung sentrifugasi dan volume ditambah oleh

asetonitril. Campuran dicampur sebentar, didiamkan selama 5 menit pada

suhu kamar, kemudian vortex selama 3 menit, lalu campuran itu

disentrifugasi pada 4000 r/menit selama 10 menit. Satu mL dari campuranyang bening dimasukkan ke deret 10 mL labu volumetrik lalu

ditandabataskan dengan fasa gerak, maka konsentrasi akhir dari sampel

sejumlah serum mengandung 4 g/mL dari AML, 5 g/mL vals dan 1

g/mL HCT diperoleh dengan pengenceran lebih lanjut dengan fase gerak.

Lalu 20 L dari sampel tersebut diinjeksikan ke kromatografi cair.


8/18

8

2.5 Kalibrasi dan Linearitas

Kurva kalibrasi dibuat dalam kisaran 4-28, 5-40 dan 1-12 g/mL

untuk AML, Vals dan HCT untuk mencakup konsentrasi yang diharapkan

dalam sampel yang diukur. Sebanyak tiga kali pengulangan 20 L

diinjeksikan untuk setiap larutan kerja standar. Area puncak untuk

konsentrasi masing-masing dicatat dan kemudian diplot terhadap

konsentrasi yang sesuai untuk mendapatkan grafik kalibrasi.

2.6 Hasil dan Pembahasan

Dalam rangka untuk mempengaruhi elusi simultan lebih dari salah

satu komponen dalam kondisi isokratik, kondisi kromatografi yang berbeda

(pengubah organik, laju alir, dan pH) telah diselidiki. Berbagai fasa diam

yang digunakan seperti C8 dan C18 serta kolom fenil, puncak terdistorsi

diamati dengan kolom fenil sementara C8 dan C18 memberikan penyelesaian

yang memuaskan. Fase gerak yang mengandung metanol atau asetonitril saja

belum bisa mengelusi senyawa dengan baik. Peningkatan konsentrasi

asetonitril untuk lebih dari 65% buffer menyebabkan pemisahan memadai.

Pada konsentrasi asetonitril rendah (


9/18

9

dari metode LC. Sistem tes kesesuaian digunakan untuk memverifikasi bahwa

efisiensi kolom (N), faktor selektivitas (resolusi) dan kemampuan untuk

memproduksi kromatografi dengan sistem yang memadai untuk analisis. Tes

sistem kesesuaian disiapkan dari stok larutan standar dari AML, Vals dan

HCT. Sistem ini ditemukan akan sama seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2.

Gambar 2. Kromatogram representatif dari amlodipine, valsartan dan

hidroklorotiazid murni

Tabel 2. Parameter analitik untuk tes kesesuaian dalam metode HPLC

Parameter Nilai acuan Amlodipine Valsartan HCT

Laju alir (mL/menit) -------- 0,8

Waktu retensi (menit) -------- 2,29 3,44 11,75

Resolusi (R) R > 0,8 1,43 4,51 5,54A (Faktor selektivitas) >1 3,29 3,65 1,70

K (Kapasitas kolom) 0,1 -10 diterima 0,21 0,70 4,99

Simetri


10/18

10

Tabel 3. Spektral data terpilih untuk penentuan obat yang dikutip oleh

metode HPLC

Parameter Amlodipine Valsartan Hidroklorotiazid

Rentang linear (g mL-

) 4 - 28 5 - 40 112

Intersep (a) -125,85 -34,47 211,64

SE dari intersep (Sa) 14,38 29,04 9,73

Kemiringan (b) 45,48 67,29 82,40

SE dari kemiringan 0,81 1,25 1,34

Koefisien korelasi (r) 0,9991 0,9992 0,9994

Koefisien determinasi (r ) 0,9983 0,9984 0,9988

SD dari residu (Sy.x) 17,60 35,97 13,53

LOD (g mL-1

) 1,04 1,42 0,39

LOQ (g mL-1

) 3,16 4,31 0,81

2.7.2 Ketepatan

Akurasi pengukuran ditentukan dengan menggunakan kalibrasi

standar dari tiga obat, di mana rata-rata persentase 99,94, 99,96 dan 99,78

untuk AML, Vals dan HCT diperoleh pada Tabel 4. Akurasi juga dinilai

oleh pemulihan standar menambahkan, lima konsentrasi masing-masing

dalam rangkap dua untuk mengetahui konsentrasi tablet komersial

menggunakan HPLC prosedur yang diusulkan.

Tabel 4. Evaluasi ketepatan metode HPLC yang diusulkan

No.

Sampel

Amlodipine Valsartan Hidroklorotiazid

Diambil

g mL-1

Ditemukan

g mL-1

%

Pemulihan

Diambil

g mL-1

Ditemukan

g mL-1

%

Pemulihan

Diambil

g mL-1

Ditemukan

g mL-1

%

Pemulihan

1 8 8,12 101,5 10,0 9,89 98,8 2,0 1,94 97,0

2 10,0 9,80 98,0 16,0 16,16 101,0 4,0 4,11 102,75

3 12,0 11,96 99,7 20,0 20,22 100,2 6,0 5,92 98,67

4 16,0 15,92 99,5 25,0 25,12 100,48 8,0 8,09 101,1

5 20,0 20,20 101,0 30,0 29,78 99,26 10,0 9,94 99,4

Mean 99,94 99,96 99,78

+ S.D 1,37 0,86 2,21

+

R.S.D 1,37 0,86 2,21

2.7.3 Ketelitian

Injeksi pengulangan: RSD dari area puncak obat dalam pengulangan

injeksi tiga kali dari lima larutan obat standar yang ditetapkan setiap hari

selama tiga hari berturut-turut. Intraday dan Interday presisi dinilai dengan

menggunakan tiga konsentrasi dan tiga kali ulangan dari masing-masing

konsentrasi. Dihitung relatif nilai standar deviasi yang ditemukan kecil di


11/18

11

bawah 2% menunjukkan pengulangan yang baik dan keandalan metode

yang diusulkan. Hasil dan statistik mereka analisis yang diringkas dalam

Tabel 5.

2.7.4 Kekhususan

Waktu retensi dari puncak dalam kromatogram tablet dan sejumlah

kecil plasma manusia adalah sama dengan standar obat tanpa Interferensi

dari eksipien, aditif atau komponen cairan biologis. Oleh karena itu,

spesifisitas metode HPLC dievaluasi dengan aplikasi yang sukses untuk

menentukan obat dalam tablet mereka dengan pemulihan rata-rata 99,25%

0,73% untuk Exforge HCT tab. Hasilnya dirangkum dalam Tabel 5.

Tabel 5. Evaluasi kelitian metode HPLC yang diusulkan

Parameter


10 g

mL-1

16 g

mL-1

20 g

mL-1

16 g

mL-1

25 g

mL-1

30 g

mL-1

4 g

mL-1

6 g

mL-1

8 g

mL-1

Intraday

1 101,07 101,74 100,89 99,51 99,70 100,91 99,12 100,73 99,61

2 101,80 100,65 101,08 99,82 100,54 101,10 99,51 100,24 98,43

3 100,42 100,94 100,92 100,13 100,98 100,44 98,91 99,87 99,42

Mean 101,09 101,11 100,96 99,82 100,41 100,82 99,18 100,28 99,15

S.D 0,690 0,564 0,351 0,310 0,650 0,339 0,305 0.431 0,634R.S.D 0,682 0,557 0,347 0,311 0,647 0,336 0,307 0,429 0,639

Interday

1 99,63 101,03 100,56 100,35 99,33 101,19 98,37 100,61 99,11

2 99,83 100,44 99,82 101,04 98,86 100,17 99,22 100,80 99,75

3 100,24 101,27 99,33 100,91 99,63 100,22 98,81 99,88 98,94

Mean 99,90 100,91 99,90 100,76 99,27 100,53 98,80 100,43 99,27

S.D 0,311 0,427 0,619 0,367 0,388 0,575 0,425 0,486 0,427

R.S.D 0,310 0,423 0,619 0,364 0,390 0,572 0,430 0,484 0,430

2.7.5 Robustnessand Ruggedness

Untuk evaluasi ketahanan metode, beberapa parameter yang diatur

seperti pH, organik fase rasio fase gerak dan suhu oven kolom. Kapasitas

tetap tidak terpengaruh oleh variasi kecil yang disengaja. Kekasaran metode

dinyatakan sebagai R.S.D. % Dari prosedur yang sama diterapkan dengan

menggunakan dua instrumen yang berbeda pada hari yang berbeda. Hasil

menunjukkan tidak ada perbedaan secara statistik antara instrumen yang

berbeda.


12/18

12

2.8 Aplikasi untuk Dosis

Metode yang diusulkan peneliti berhasil diterapkan untuk simultan

penentuan tiga obat di Exgorge tablet HCT tanpa campur tangan dari

adanya eksipien dan tanpa pemisahan sebelumnya. Kemampuan dari metode

yang diusulkan telah diverifikasi dengan mereplikasi estimasi sediaan farmasi

dan hasil yang diperoleh dievaluasi secara statistik Tabel 6.

Sebuah perbandingan statistik dari hasil yang diperoleh dengan

metode yang diusulkan dan metode HPLC ditunjukkan pada Tabel 7. Nilai-

nilai t hitung dan F kurang daripada yang ditabulasikan, yang

mengungkapkan bahwa ada perbedaan yang signifikan sehubungan dengan

akurasi dan presisi antara metode yang diusulkan dan dilaporkan. Selain itu,

metode yang diusulkan diperpanjang untuk menganalisis obat dalam sejumlah

kecil plasma manusia (Gambar 3 dan 4) dengan ekstraksi sederhana dan

deproteination dengan asetonitril, diikuti dengan sentrifugasi dan supernatan

yang jelas mengandung obat telah disesuaikan. Hampir ekstraksi non-

destruktif diperoleh sebagai jelas dari rata-rata % dari 98,19 - 98,87 dari

plasma, Tabel 8.

Tabel 6. Penentuan obat dikutip dalam sediaan farmasi (Tablet Exforge HCT)

dengan menggunakan metode HPLC yang diusulkan

Obat Diambil g mL-1

Ditemukan g mL-1

% Pemulihan + SD

Amlodipine 10 9,96 99,60 + 1,39

Valsartan 160 158,8 99,25 + 1,33

Hidroklorotiazid 12,5 12,72 101,76 + 1,67

Tabel 7. Penentuan obat dalam tablet gabungan menggunakan metode yang

diusulkan dibandingkan dengan metode HPLC referensiDosis

FarmasiObat

% Pemulihan + SDNilai-t Nilai-f

Metode usul Metode lapor

Exforge HCT

Amlodipine 10 mg 100,54 + 0,34 100,31 + 0,87 0,54 3,94

Valsartan 120 mg 99,38 + 0,91 100,05 + 0,62 1,37 2,14

Hidroklorotiazid 12,5 mg 100,2 + 0,91 99,72 + 1,15 0,36 1,55

Tabel 8. Penentuan obat dikutip dalam sejumlah plasma manusia

No.Sampel


Diambil

g mL-1

Ditemukan

g mL-1

%

Pemulihan

Diambil

g mL-1

Ditemukan

g mL-1

%

Pemulihan

Diambil

g mL-1

Ditemukan

g mL-1

%

Pemulihan

1 10 8,7 87 16 14,2 88,75 4 3,1 77,5


13/18

13

2 12 10,8 90 20 18,3 91,5 6 4,95 82,5

3 16 14,6 91,25 25 21,9 87,6 8 6,89 86,25

4 20 18,3 91,5 30 27,24 90.8 10 7,85 78,5

Rata-

Rata89,94 89,66 81,18

+ S.D 2,06 1,80 2,21+

R.S.D2,29 2,00 2,21

Gambar 3. Blank Plasma

Gambar 4. Kromatogram representatif dari amlodipine, valsartan dan

hidroklorotiazid dalam sejumlah plasma manusia.


14/18

14

III.

Kesimpulan

Metode HPLC yang diusulkan peneliti adalah spesifik dan mudah

dilakukan serta memungkinkan penentuan dari AML, Vals dan HCT secara

simultan dan cepat dalam tablet obat dan plasma manusia. Validasi prosedur yang

diusulkan dilakukan sesuai dengan ICH dan pedoman USP

DAFTAR PUSTAKA

Clark, Jim. (2007). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). [Online].

Tersedia: http://www.chem-istry.org yang direkam pada 6-10-2007. [21

September 2012].

Hendayana, Sumar. (1994). Kmia Instrumen Edisi Kesatu. Semarang : IKIP

Semarang Press.

Hendayana, Sumar. (2006). Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan

Elektroforensis Modern. Bandung : PT. Remaja Rosdakarya.

Putra, Effendy De Lux. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang

Farmasi. Sumatera Utara : Jurusan Farmasi FMIPA USU.

Suhanda, Hokcu. (2001). Handout Perkuliahan Kimia Analitik Instrumen :

KCKT/HPLC. Jurusan Pendidikan Kimia UPI : tidak diterbitkan.
http://www.chem-istry.org/http://www.chem-istry.org/


15/18

15

LAMPIRAN

Pertanyaan dari Mahasiswa :

1.

Mengapa pH harus asam pada 2,8? Bagaimana jika pHnya basa?

Jawab : Karena pH 2,8 adalah pH hasil optimasi yang memberikan hasil

paling baik. pH fasa gerak yang digunakan tidak mungkin basa karena

menggunakan asetonitril-buffer fosfat yang bersifat asam.

2. Mengapa komposisi AML, Vals, dan HCT dalam pengukuran dibuat dalam

komposisi yang berbeda?

Jawab : Karena disesuaikan dengan komposisi dalam obat komersial yang

biasa dipasarkan.

3. Mengapa tidak digunakan pemisahan terlebih dahulu?

Jawab : Karena disesuaikan dengan tujuan peneliti untuk menggunakan

metode yang lebih sederhana dengan cepat dan akurat.

4.

Apa yang menyebabkan pada kromatogram yang terdeteksi terlebih dahulu

adalah HCT baru kemudian AML dan Vals?

Jawab : Kolom yang digunakan adalah dengan fasa terbalik, yaitu fasa diam

berupa nonpolar dan fasa geraknya berupa polar. Dari literatur yang saya

baca, hanya disebutkan bahwa HCT sangat polar, AML polar dan Vals cukup

polar, tidak ada data yang berupa angka. Sesuai prinsip like dissolve like,

maka jika fasa geraknya polar, maka komponen yang bersifat lebih polar akan

lebih cepat keluar dari kolom dan terdeteksi oleh detektor sedangkan yang

kurang polar akan lebih lama tertahan di dalam kolom oleh fasa diam

sehingga lebih lama keluar dari kolom dan terdeteksi oleh detektor.

5.

Mengapa digunakan panjang gelombang 227 nm?Jawab : Karena telah dioptimasi dengan berbagai panjang gelombang dan

pada panjang gelombang 227 nm menunjukkan hasil yang paling baik untuk

penentuan ketiga obat tersebut secara simultan. Jika secara teoritis, maka

pada panjang gelombang 227 nm ketiga obat tersebut dapat terdeteksi dengan

baik atau terdapat dalam wilayah ketiga grafik yang dihasilkan dari masing-

masing obat tersebut jika diplot berdasarkan panjang gelombang dan

absorbansinya.


16/18

16

6. Apa yang dimaksud dengan vorteks?

Jawab : Proses pengendapan, yang akan dipakai hanyalah cairannya saja

sehingga untuk memudahkan proses pemisahan dilakukan vorteks.

7.

Apa yang dimaksud dengan ketahanan dan ketidakrataan?

Jawab : Maksudnya jika sampel tersebut dideteksi pada HPLC yang berbeda

namun dengan tipe yang sama dan jika dilakukan pada hari serta jam yang

berbeda, maka akan menunjukkan hasil yang tidak jauh berbeda.

8. Mengapa menggunakan mode isokratik, tidak gradien saja?

Jawab : Karena dengan mode isokratik saja sudah dapat memisahkan sampel

dengan baik. Sampel yang digunakan hanya tiga komponen sehingga lebih

sederhana dan mudah jika menggunakan mode isokratik.

9. Apa yang dimaksud dengan metode linear pada rentang konsentrasi berbeda

pada ketiga obat tersebut?

Jawab : Sampel dibuat deret dalam konsentrasi yang ditentukan sesuai dengan

komposisinya dalam tablet obat di pasaran.

10. Apakah ada penelitian lain yang menggunakan alat selain HPLC dalam

penentuan ketiga obat itu secara simultan?

Jawab : Sebelumnya belum ada penelitian tentang penentuan ketiga obat itu

secara simultan. Penelitian-penelitian sebelumnya hanya melakukan

pendeteksian pada salah satu sampel secara terpisah.

Pertanyaan dari Dosen

1. AML resmi di BP, Vals resmi di EP dan USP sedangkan HCT resmi di BP

dan EP, penjelasannya bagaimana?

Jawab : USP (The United States Pharmacopeia), EP (EuropeanPharmacopoeia) dan BP (British Pharmacopoeia) adalah standar resmi untuk

resep semua obat-obatan, suplemen makanan, eksipien dan produk kesehatan

lainnya yang diproduksi dan dijual di seluruh dunia. USP diproduksi di

Amerika, EP diproduksi di Eropa dan BP diproduksi di Inggris.

2. Apa yang dimaksud HPTLC?

Jawab : Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi (HPTLC) adalah bentuk

kromatografi yang disempurnakan dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT).


17/18

17

Sejumlah perangkat tambahan dapat dibuat dengan metode dasar

kromatografi lapis tipis untuk mengotomatisasi langkah-langkah yang

berbeda, untuk meningkatkan resolusi yang dicapai dan untuk memungkinkan

pengukuran kuantitatif lebih akurat.

3. Apa bedanya HPLC yang dipresentasikan dengan HPLC fluorometri?

Jawab : Berbeda di penggunaan detektornya. Pada HPLC yang

dipresentasikan detektor yang digunakan adalah detektor UV sedangkan pada

HPLC fluorometri, detektor yang digunakan adalah detektor fluorometer.

Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang

terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar

dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan monokromator, biasanya

penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi

pendaran pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya.

4.

Apa yang dimaksud elektroforesis kapiler?

Jawab : Elektrolisis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan

untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida

dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Metode

ini mulai digunakan secara luas pada akhir tahun 1940. Untuk aplikasi dalam

berbagai bidang seperti bioteknologi, kimia, lingkungan, dan analisis farmasi.

Elektrolisis kapiler menggunakan listrik bertegangan tinggi yang

menyebabkan semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda.

Deteksi dapat dilakukan dengan teknik pendeteksian spektrometri atau

elektrokimia. Teknik pemisahan ini dipengaruhi oleh tegangan listrik,

koefisien difusi, panjang, dan diameter pipa kapiler, serta konsentrasi sampel.

Metode ini memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik namun boros listrikkarena menggunakan tegangan tinggi dan alatnya juga mahal.

5.

Digunakan untuk apa ketiga obat tersebut?

Jawab : Sebagai obat hipertensi

6. Kenapa obat yang digunakan diujinya pada plasma darah, bukan pada hati?

Jawab : Karena obat yang dikonsumsi akan mengalir dalam darah sehingga

untuk mengetahui obat apa yang dikonsumsi pasien dapat diketahui dari

darah/plasma darah.


18/18

18

7. Mengapa diambil secara simultan di panjang gelombang 227 nm jika dilihat

dari grafik?

Jawab : Secara teoritis dalam grafik, maka pada panjang gelombang 227 nm

ketiga obat tersebut dapat terdeteksi dengan baik atau terdapat dalam wilayah

ketiga grafik yang dihasilkan dari masing-masing obat tersebut jika diplot

berdasarkan panjang gelombang dan absorbansinya. Setelah menentukan

panjang gelombang, maka langsung melihat datanya, kapasitas kolom, lalu

melihat standarnya yang ditentukan masing-masing. Siapa tau ada faktor

matriks yang tidak bisa dipertanggungjawabkan.

Makalah Seminar

Documents

Transcript of Makalah Seminar