I. Hari/tanggal : Selasa, 5 April 2010

II. Judul Praktikum : Pewarnaan Tahan Asam ( Zeihl neelsen )

III. Tujuan Praktikum

1. Melihat morfologi dan sifat tahan asam dari bakteri

2. Untuk mencari BTA

IV. Dasar Teori

Pemeriksaan dahak secara mikroskopik dengan pewarnaan

Basil Tahan Asam (BTA) merupakan pemeriksaan yang sederhana,

cepat, murah, dan cukup sensitif untuk mendukung diagnosis

penyakit tuberkulosis serta untuk menilai kemajuan pengobatan.

Penelitian ini bertujuan untuk menentukan metoda pewarnaan

BTA terbaik yang dapat digunakan secara rutin terutama di

laboratorium dengan beban pekerjaan yang cukup tinggi.

Sensitivitas, spesifisitas, nilai prediksi positif dan negatif tiga

macam metode pewarnaan BTA, yaitu Tan Thiam Hok, Ziehl

Neelsen, dan Fluorokrom, dibandingkan terhadap hasil biakan

dahak pada medium padat Lowenstein Jensen sebagai baku emas.

Intepretasi hasil pewarnaan mengacu pada skala IUTLD.

Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis didapatkan pada 27

dari 98 spesimen sputum (27,6%) berasal dari 98 penderita

tersangka tuberculosis. Sensitivitas metoda pewarnaan Tan Thiam

Hok, Ziehl Neelsen, dan Fluorokrom adalah 62,9%, 81,5%, dan

92,6%, sedangkan spesifisitasnya berturut-turut adalah 92,9%,

91,6%, dan 91,1%. Nilai prediksi positif berturut-turut adalah

77,3%, 78,6%, dan 71,4%, sedangkan nilai prediksi negatif adalah

86,8%, 92,9%, dan 96,8%. Dari penelitian ini didapatkan bahwa

Ziehl Neelsen merupaka metoda terbaik dan dapat dilakukan di

laboratorium sederhana.

Salah satu bahan yang digunakan untuk mendiagnosa adalah

dahak atau sputum. Dahak yang diperiksa paling sedikit 3-5 cc.

Jika jumlah kuman kurang dari 5000 dalam 1 cc dahak, maka itu

tidak akan kelihatan di bawah mikroskop.

1

Dahak yang diambil ialah dahak yang kental kuning

kehijauan sebanyak 3-5 cc, dengan waktu pengambilan sebagai

berikut :

Dahak sewaktu, penderita datang berobat dengan keluhan apa

saja ke poliklinik.

Dahak pagi, yang diambil besok paginya begitu bangun tidur

Dahak sewaktu, yang diambil sewaktu penderita mengantar

dahak pagi tersebut.

Ludah tidak dapat diperiksa karena ludah berasal dari

kelenjar dalam rongga mulut. Biasanya dalam ludah tidak

terdapat kuman TB.

Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat

warna karbol-fuchsin (fuchsin basayang dilarutkan dalam suatu

campuran phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam

klorida dalam alkohol. Sediaan sel bakteri pada gelas alas disiram

dengan cairan karbol fuchsin kemudian dipanaskan sampai keluar

uap. Setelah itu, zat warna dicuci dengan asam alkohol dan

akhirnya diberi warna kontras (biru atau hijau). Bakteri-bakteri

tahan asam (spesies Mycobakterium dan beberapa Actinomycetes

yang serumpun) berwarna merah dan yang lain-lain akan

berwarna sesuai warna kontras.

Mycrobakteria adalah bakteri aerob berbentuk batang,

yang tidak membentuk spora. Walaupun tidak mudah diwarnai

bakteri ini tahan terhadap penghilangan warna (deklorisasi) oleh

asam atau alkohol dan karena itu dinamakan basil tahan asam.

Ciri –ciri khas Mycobakterium tuberculosis dalam jaringan, basil

tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0,4

x 3 µm. Pada perbenihan buatan terlihat bentuk coccus dan

filamen. Mycobakteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai gram

positif atau gram negatif. Sekali diwarnai dengan zat warna basa,

warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan alkohol, meski

dibubuhi dengan iodium. Basil tuberkel yang sebenarnya ditandai

oleh sifat tahan asam misalnya 95 % etil alkohol yang

mengandung 3 % asam hidroklorida (asam alkohol) dengan cepat

2

akan menghilangkan warna semua bakteri kecuali Mycobakteria.

Sifat tahan asam ini bergantung pada integritas struktur selubung

berlilin. Pada dahak atau irisan jaringan, Mycobakteria dapat

diperlihatkan karena memberi fluoresensi kuning jingga setelah

diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya auramin,

rodamin).

V. Alat dan Bahan

Alat

o Mikroskop

o Ose

o Lampu spritus

o Objek gelas

o Gelas sediaan

Bahan

o Sputum/dahak

o Carbol Fuchsin

o Alkohol 70%

o methylen blue 0,3%

o Minyak Immersi

VI. Metode Kerja :

1. Pakailah masker sebelum mulai praktikum

2. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

3. Diambil kaca sediaan yang bersih, bebas lemak dan tidak ada

goresan.

4. Disiapkan sebuah kaca sediaan yang diberi tanda ukuran 2X3

cm sebagai pola.

5. Diletakkan kaca pola dibawah kaca sediaan.

6. Lampu speritus dinyalakan dan ose dipanaskan sampai

membara mulai ujung sampai kepangkal.

3

7. Dengan menggunakan ose steril lalu diambil bagian sputum

yang kental berwarna putih kekuninggan atau putih kehijauan,

lalu diletakkan pada kaca sediaan.

8. Sputum diratakan

9. Kemudian tangkai ose digoyangkan pelan-pelan untuk

melepaskan sisa partikel sputum yang melekat pada ose.

10. Letakkan ose berdekatan pada api spiritus, setelah kering

barulah dibakar sampai pijar.

11. Keringkan sediaan pada suhu kamar, jangan dikeringkan

di atas nyala api. sediaan dilewatkan diatas nyala api lampu

speritus sebanyak 3 X selama 3-5 detik.

12. Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan dengan apusan

menghadap ke atas.

13. Tuangkan Carbol Fuchsin sampai menutupi seluruh

permukaan kaca sediaan.

14. Panaskan kaca sediaan secara hati-hati dengan caara

melewatkan nyala api pada bagian bawah kaca sehingga keluar

uap(jangan sampai mendidih) selama 3 menit.

15. Sediaan dibiarkan hingga dinginn selama 5 menit.

16. Sediaan dicuci dengan air mengalir.

17. Tuangkan asam alkohol 70% di atas kaca sediaan sampai

warna merah dari fuchsin hilang.

18. Sediaan dicuci dengann air mengalir

19. Tuangkan larutan methylen blue 0,3% diatas sediaan dan

biarkan selama 10-20 detik atau larutan methylen blue 0,1%

selama 1 menit.

20. Sediaan dicuci dengan air mengalir dan keringkan pada

suhu kamar.

21. Sediaan yang sudah kering diperiksa dibawah mikroskop.

22. Teteskan satu tetes minyak emersi diatas sediaan,

periksa dengan okuler 10X dan objektif 100X.

23. Carilah basil tahan asam (BTA) yang berwarna merah

dengan latar belakang biru.

4

24. Periksa paling sedikit 100 lapangan pandang dengan cara

menggeserkan sediaan dari kiri ke kanan atau dari kanan ke

kiripada garis lurus.

25. Foto hasil pengamatan dan buatkan laporan

VII. Pembahasan

Pewarnaan Basil Tahan Asam (BTA) merupakan uji

makroskopik yang memiliki nilai diagnosa yang tinggi karena

pemeriksaan tersebut dapat memangkas isolasi bakteri yang akan

memakan waktu sampai 8 minggu. Cara pengambilan spesimen

harus di perhatikan, contohnya dalam pengambilan sampel darah

atau dahak / sputum bukan hanya harus dilakukan secara aseptik

untuk menghindari kontaminasi, namun juga harus diperhatikan

waktu pengambilannya, karena infeksi bakteri memiliki siklus

tertentu. Hati-hati dengan hasil false positive dan false negative.

False positif maksudnya dalam sampel seharusnya tidak

ditemukan bakteri namun dalam pelaporan / pengerjaan

ditemukan bakteri. Hal ini bisa terjadi bila dalam pengerjaan

terjadi kontaminasi. False negatif maksudnya dalam sampel

seharusnya terdapat bakteri namun dalam pengerjaan / pelaporan

tidak ditemukan bakteri. Hal ini bisa terjadi karena kurangnya

ketelitian dalam penggunaan ose.

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3%

dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan

diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih

atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin

selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci

dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam

alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan

dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama

1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue

0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1

menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir.

5

Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan

lemak yang sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan

pemanasan maka lapisan lilin dan lemak itu dapat ditembus cat

basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin dan lemak yang

terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam

alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak

tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen

blue.

Pembacaan hasil dilakukan dengan menggunakan skala IUATLD

sebagai berikut :

Tidak ditemukan BTA dalam 100 lapangan pandang : Negatif

Ditemukan 1-9 BTA/ 100 lapangan pandang : Ditulis jumlah

kuman yang ditemukan.

Ditemukan 10-99 BTA/ 100 lapangan pandang : + (1+)

Ditemukan 1-10 BTA/ 1 lapangan pandang : ++ (2+)

Ditemukan > 10 BTA/ 1 lapangan pandang : +++ (3+)

VIII. Hasil Pengamatan

IX. Kesimpulan

Setelah dilakukan pewarnaan di laboratorium secara

mikroskopik, dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen dapat dilakukan

6

Basil Tahan Asam

identifikasi bakteri tahan asam, dimana bakteri akan terbagi

menjadi dua golongan:

Bakteri tahan asam, adalah bakteri yang pada pengecatan

Ziehl-Neelsen tetap mengikat warna pertama, tidak luntur oleh

asam dan alkohol, sehingga tidak mampu mengikat warna

kedua. Dibawah mikroskop tampak bakteri berwarna merah

dengan warna dasar biru muda.

Bakteri tidak tahan asam, adalah bakteri yang pada

pewarnaan Ziehl-Neelsen, warna pertama, yang diberikan

dilunturkan oleh asam dan alkohol, sehingga bakteri akan

mengikat warna kedua. Dibawah miskroskop tampak bakteri

berwarna biru tua dengan warna dasar biru yang lebih muda.

Interpretasi hasil : BTA : warna merah dan Non BTA : warna

biru

7