Laporan Praktikum Mikrobiologi

1. Penjelasan secara teknis mengenai1.1 Prosedur mengambil plak gigi (termasuk alat dan bahan)Alat yang dibutuhkan untuk mengambil plak gigi adalah cotton bud atau tusuk gigi, ependrof pipet, ependrof tube, sarung tangan, masker. Sedangkan untuk bahan yang diperlukan adalah 1ml aquadest steril, Brucella agar dasar+vit K+ Menandione. Prosedur yang dilakukan untuk mengambil plak pertama, operator yang akan mengambil plak menggunakan sarung tangan. Kemudian cotton bud atau tusuk gigi steril docelupkan pada aquadest steril lalu diusapkan ke permukaan buccal dan palatal gigi posterior rahang atas. Cotton bud atau tusuk gigi tersebut dicelupkan pada ependorf tube yang berisi 1ml aquadest steril, lalu homogenisasi (vortexing) selama 15 detik. 1.2. Cara kultivasi sampel plak pada tersebut pada media agarCara kultivasi plak pada media agar pada praktikum ini menggunakan metode bentang rata, Metode bentang rata akan menuangkan medium lebih dahulu kemudian setelah medium memadat ditetesi suspense sampel (biasanya tidak lebih dari 0,1 mL) dan diratakan pada permukaan medium menggunakan batang gelas steril bentuk huruf L.

1.3 Cara menghitung koloni bakteri Terdapat berbagai cara untuk menghitung koloni bakteri, namun dalam percobaan kali ini digunakan cara pembagian kuadran bakteri pada cawan petri berisi agar. Setelah dibagi berdasarkan kuadran (rata-rata menggunakan 4-8 kuadran) jumlah koloni dalam satu kuadran dihitung kemudian dikalikan dengan jumlah kuadrannya. Dengan begitu didapatkan jumlah koloni bakteri pada cawan petri tersebut.Hasil perhitungan koloni bakteri:

1.4. Hal yang diamati pada morfologi koloni bakteriKultur bakteri yang telah diisolasi dideterminasi dengan menentukan karakteristik sebagai berikut;1. Ukuran titik-titik (koloni bakteri) pada agar: kecil, moderat/sedang, atau besar.2. Pigmentasi (warna koloni) yang menentukan jenis dari koloni: putih, kuning, merah, ungu, dan lain lain.3. Form (bentuk koloni) Sirkuler: bulat, bertepi Ireguler: tidak beraturan, bertepi Rhizoid: bentuk seperti akar, pertumbuhan menyebar4. Margin (bentuk tepian luar) Entire: tepian rata Lobate: tepian berlekuk Undulate: tepian bergelombang Serrate: tepian bergerigi Filamentous: tepian seperti benang-benang5. Elevasi (ketinggian pertumbihan koloni bakteri Flat: ketinggian tidak teratur, nyaris rata dengan medium Raised: ketinggian nyata terlihat, namun rata pada seluruh permukaan Convex: bentuk cembung seperti tetesan airUmbonate: bentuk cembung, di bagian tengah lebih menonjolBakteriUkuranPigmentasiFormMarginElevasi

1.5 Prosedur teknik pewarnaan Gram (termasuk alat dan bahan yang digunakan)Alat yang dibutuhkan untuk pewarnaan Gram meliputi gelas objek, sengkelit, spirtus. Bahan yang dibutuhkan adalah zat warna Gentian Violet, zat warna Lugol, zat warna merah Fuschin, alcohol 90%.Pertama, ambil satu ose cairan homogenisasi plak dan aquadest mengunakan sengkelit yang terlah dipanaskan, kemudian oleskan pada gelas objek. Gelas objek tersebut dilewatkan di atas api bebera kali sehingga terlihat warna putih. Lalu, teteskan zat warna Gentian Violet pada permukaan putih di gelas objek tersebut dan biarkan selama 60 detik. Setelah itu, bilas zat warna Gentian Violet dengan sir air mengalir perlahan-lahan. Kemudian, teteskan zat warna Lugol sehingga menutupi permukaan dan biarkan selama 60 detik. Bilas zat warna tersebut dengan air mengalir secara perlahan-lahan. Setelah dibilas dengan air, gelas objek dimasukkan dan digoyang-goyangkan kedalan tempat yang berisi alcohol 90% selama 10 detik. Setelah itu teteskan zat warna tersebut dengan air mengalir secara perlahan-lahan. Keringkan preparat dengan kertas saring. 1.6. Prosedur uji sensitivitas antibiotika pada media agar Ambil 100 ul cairan dari BHI broth menggunakan ependorf pipet dengan tip 1 ml, tuangkan ke media agar BHI Ratakan cairan di atas permukaan agar, biarkan selama kurang lebih lima menit Tempelkan antibiotic disc (tetrasiklin/metronidazole/amoksilin/cfrofoksasin) pada permukaan agar Keram agar pada suhu 37C selama 7X24 jam di dalam suasana anaerob dalam anaerobic jar.Hasil uji sensitivitas antibiotika

1.7. Cara mengeram (inkubasi) bakteri secara aerob dan anaerob1.7.1. Inkubasi AerobTerdapat berbagai cara untuk inokulasi bakteri aerob. Sebagian besar laboratorium memilih medium sesuai dengan sifat dan asal specimen.Sebagian besar specimen dioleskan ke media agar dengan metode pengolesan empat kuadran (four quadran streaking method). Apabila diinginkan hasil kuantitatif dapat digunakan metode pengolesan hitung koloni (colony count streaking method). Medium agar didalam tabung diinokulasikan dengan mengoleskan specimen ke permukaan agar yang miring.Suhu inokulasi standar untuk biakan aerobic adalah 35C sampai 37C. Suhu inkubasi yang lain dapat digunakan dalam keadaan tertentu. Atmosfer inkubasi harus medapat pasokan CO2 sebesat 5 sampai 10 persen selama inkubasi primer medium agar yang mengandung darah atau agar coklat yang mengandung darah karena pasokan CO2 . judibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri dan beberpa pathogen penting.Durasi inkubasi bervariasi sesuai pathogen yang dicari. Umumnya durasi pada medium agar dan lempeng berkisar 48-72 jam, namun apabila dicurigai ada pathogen yang tumbuh secara lambat, durasi dapat diperpanjang.1.7.2. Inkubasi AnaerobAda beberapa hal yang perlu ditekankan dalam inkubasi anaerob, seperti; Specimen tidak diambil dari bagian tubuh yang umumbya dikolonisasi anaerob Specimen harus dikirim ke laboratorium dengan cara yang konsisten dengan kelangsungan hidup mikroba anaerob.Untuk mencegah terkontaminasi atau rusaknya bakteri akibat bakteri lain yang tumbuh lebih cepat, perlu ditambahkan bahan-bahan khusus untuk mematikan kontaminan secara efektif.Seperti pada inkubasi aerob, suhu yang diperlukan adalah 35C sampai 37C dan kandungan CO2 juga 5-10%.

2. Penjelasan Teoritis mengenai:2.1. Phosphate Buffer Saline adalah larutan garam seimbang yang umumnya digunakan pada laboratorium biologi. Fungsi esensial dari PBS adalah untuk mempertahankan PH dan keseimbangan osmosis seperti menyediakan air dan ion anorganik untuk sel. PBS umumnya digunakan untuk mempertahankan keseimbangan sel dalam jangka pendek saat dimanipulasi diluar area pertumbuhan mikroorganisme tersebut.Dengan begitu fungsi PBS dalam praktikum ini adalah untuk mempertahankan keseimbangan mikroorganisme (dalam percobaan ini bakteri) agar tetap dapat tumbuh walaupun bukan dalam lingkungan regulernya. 2.2. kegunaan media padat dan cair (Brucella agar dara, Brain heart Infusion agar, Brain Heart Infusion Broth) pada praktikum kali iniBrucella Blood Agar (BRU) adalah media agar non-selektif. Brucella Agar Darah dimaksudkan untuk isolasi, kuantisasi dan identifikasi parsial bakteri anaerob obligat dari spesimen klinis. Brucella agar darah ini dilengkapi dengan vitamin K1 dan Hemin untuk memfasilitasi pemulihan dan pigmen produksi Prevotella melaninogenica. Darah domba telah ditambahkan untuk pengamatan reaksi hemolitik seperti yang terlihat oleh zona ganda b - hemolisis Clostridium perfringens. Media ini juga akan mendukung pertumbuhan bakteri aerobik dan mikroaerofilik jika diinkubasi tepat. Brucella Agar Darah ini juga cocok untuk digunakan dalam uji kerentanan, pemeriksaan diferensial disk antibiotik dan tempat tes biokimia. Media ini disiapkan, disimpan dan dikeluarkan dalam kondisi bebas oksigen untuk mencegah pembentukan produk teroksidasi sebelum digunakan. Media agar darah ini juga menunjukkan adanya produksi hemolisis

Brain Heart Infusion (BHI Agar) adalah media non-selektif untuk isolasi dan budidaya sebagian bakteri anaerob dan mikroorganisme lainnya. Media ini dilengkapi dengan hemin dan vitamin K1 sebagai faktor pertumbuhan untuk sebagian besar bakteri anaerob. Media ini disiapkan, dibagikan, disimpan dan dikemas dalam kondisi bebas oksigen untuk mencegah pembentukan produk teroksidasi sebelum digunakan.

Brain Heart Infusion Broth ( BHI ) adalah media non - selektif ditujukan untuk budidaya sebagian bakteri anaerob dan mikroorganisme lainnya . Media ini digunakan dalam persiapan inokulum untuk pengujian kerentanan antimikroba, sangat berguna sebagai dasar untuk kultur darah dan juga digunakan dalam prosedur uji antimikroba kaldu - disc seperti yang dijelaskan oleh Wilkins dan Theil. Media ini juga akan mendukung pertumbuhan mikroorganisme aerobik dari berbagai spesimen klinis dan non - klinis . Medium basal pada BHI ini berasal dari otak dan jantung sapi dan ditambah dengan vitamin K1 dan hemin sebagai faktor pertumbuhan untuk sebagian besar anaerob . Media ini disiapkan , dibagikan , disimpan dan dikemas dalam kondisi bebas oksigen untuk mencegah pembentukan produk teroksidasi sebelum digunakan . Media ini berisi resazurin sebagai indikator redoks yang berubah warna menjadi pink setelah terpapar oksigen yang signifikan .

2.3 Konsep Pewarnaan GramPewarnaan gram termasuk pewarnaan diferensial yang digunakan untuk membedakan bakteri gram negatif dan bakteri gram positif. Pewarnaan ini menggunakan 4 jenis larutan yaitu Kristal violet sebagai pewarna utama, larutan lugol sebagai pengintensifan warna utama, aseton alkhol untuk pencucian dan safranin sebagai pewarna penutup. Bakteri yang bersifat gram positif yang berarti bakteri dapat mengikat dengan kuat warna utama cristal violet berwarna ungu. Pada saat bakteri Gram positif ditambahkan dengan kristal violet maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel, dengan pemberian larutan lugol maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel, pemberian alkohol menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Sedangkan bakteri yang bersifat gram negatif tidak dapat mengikat kuat warna utama dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin.Prinsip dasar dari pewarnaan gram yaitu bakteri akan menyerap zat warna tertentu yaitu Kristal violet. Dengan penguatan lugol, bakteri Gram positif akan tetap mengikat warna ungu meskipun ada penambahan safranin sedangkan bakteri Gram negatif akan melepaskan warna ungu dengan adanya penambahan alkohol dan akan mengikat safranin menjadi warna merah.

2.4 Zona Hambatan bakteri pada uji sensitivitas antimikrobaAntibiotik merupakan suatu substansi kimia yang diperoleh atau dibentuk oleh berbagai spesies mikroorganisme, yang dalam konsentrasi rendah mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain. Sensitifitas bakteri terhadap antibiotika adalah suatu istilah yang digunakan untuk menggambarkan kerentanan bakteri pada antibiotik. Uji kerentanan antibiotik biasanya dilakukan untuk menentukan antibiotik yang mampu mengobati infeksi yang disebabkan oleh bakteri. Jika sensitif terhadap antibiotik maka akan terbentuk lingkaran (berbentuk cincin) yang jelas atau disebut dengan zona inhibisi yang terlihat disekitar paper dish yang menunjukkan bakteri tidak dapat tumbuh di sekitar antibiotik yang sensitif bagi bakteri tersebut. Dalam uji sensitivitas dapat diketahui beberapa jenis bakteri yang sensitif terhadap antibiotika yang diujikan. Antibiotika ditempatkan pada media agar yang telah dituang cairan dari BHI broth. Bakteri yang sensitif terhadap antibiotika akan menunjukkan lingkaran seperti cincin disekitar antibiotika yang diletakkan diatas media agar, dimana lingkaran ini disebut zona hambatan atau zona inhibisi. Zona hambat merupakan daerah dimana bakteri terhambat pertumbuhannya akibat antibakteri atau antimikroba. Sensitivitas bakteri terhadap antibiotik tergantung kapada kemampuan antibiotik tersebut untuk menembus dinding sel bakteri. Antibiotik lebih banyak yang efektif bekerja terhadap bakteri Gram positif karena permeabilitas dinding selnya lebih tinggi dibandingkan bakteri Gram negatif. Jadi suatu antibiotik dikatakan mempunyai spektrum sempit apabila mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif, sedangkan antibiotik berspektrum luas jika pertumbuhan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dapat dihambat oleh antibiotik tersebut

3. Analisa hasil pekerjaan/praktikum mencakup:3.1. masalah yang dihadapi selama praktikumAdapun kendala yang ditemui pada saat pelaksanaan praktikum mikrobiologi farmakologi IKGK 2 adalah:1.Kontaminasi udara paling sering menjadi masalah karena udara selalu kontakdengan partikel debu dan umumnya banyak komunitas mikroorganisme didalamnya.2. Penggunaan bahan sampel yang berlebihan dapat menyebabkan kerusakan pada preparat.3. Tidak didapatkan bakteri dari percobaan yang dilakukan (media tetap kosong)4. Adanya kekurangan alat yang disediakan seperti mikroskop pada praktikum kedua menyebabkan mahasiswa menghadapi kendala ketika akan menganalisa hasil karena harus bergantian5. Selain itu kadang masih ada praktikan yang belum benar-benar mampu dalam mengoperasikan mikroskop, sehingga membutuhkan waktu yang lama untuk mendapatkan hasil pengamatan yang diinginkan/yang sesuai dengan teori.

3.2. Hasil yang didapat apakah sudah sesuai dengan teori/diharapkan, bila hasilnya tidak speerti yang diharapkan dijelaskan mengapa hal tersebut terjadiAnalisis Hasil

3.3 Gambar hasil pengamatan bakteri dibawah mikroskop setelah dilakukan pewarnaan GramPada pewarnaan Gram, bakteri Gram positif akan tetap mengikat warna ungu meskipun ada penambahan safranin. Sehingga jika didapatkan hasil pewarnaan ungu maka dapat diketahui bahwa bakteri tersebut adalah bakteri Gram postif. Sedangkan bakteri Gram negatif akan melepaskan warna ungu dengan adanya penambahan alkohol dan akan mengikat safranin yang berwarna merah. Sehingga jika didapatkan hasil pewarnaan merah maka dapat diketahui bahwa bakteri tersebut adalah bakteri Gram negatif.Hasil pewarnaan gram(bakteri anaerob Streptococcus berantai)Dari hasil pewarnaan didapatkan warna ungu yang menunjukan bakteri merupakan bakteri gram positif. Bentuk bakteri coccus dan merupakan bakteri dari genus streptococcus.

Referensi:1. Departemen Biologi Oral FKG Universitas Indonesia. Buku Panduan Praktikum Mikrobiologi dan Patologi. 2014.2. Dwidjoseputro. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta3. Pbs (phosphate-buffered saline)). (n.d.). Retrieved from http://www.cytospring.com/pages/DPBS.pdf4. Sacher, R. A., & Mcpherson, R. A. (2004). Tinjauan klinis hasil pemeriksaan, laboratorium. (11th ed., pp. 409-410). Jakarta: EGC. Retrieved from http://books.google.co.id/books?id=XTQ7NuDtzEEC&printsec=frontcover