LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

PERCOBAAN 2

PERCOBAAN ANALISIS DNA HASIL ISOLASI DENGAN

SPEKTROFOTOMETRI

Tanggal praktikum: 10 April 2013

DISUSUN OLEH:

ALDI ASTRAYUDHA

10613214

KELOMPOK C6

LABORATORIUM BIOLOGI FARMASIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS ISLAM INDONESIAYOGYAKARTA

1

I. JUDUL

Percobaan Analisis DNA Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometri.

II. TUJUAN

Dapat melakukan analisis kuantitatif/kualitatif DNA mamalia hasil isolasi.

III. LATAR BELAKANG

DNA merupakan materi genetik yang mengkode semua informasi yang

dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. Molekul DNA ini

terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria, dan kloroplas.

DAN yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun

helix ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua “benang” polinukleotida

saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara

nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat(1).

Isolasi DNA adalah suatu tehnik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni,

yaitu tanpa Protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pada proses isolasi DNA

ini, sel eukariotik harus dihancurkan terlebih dahulu melalui cara mekanik dan

enzimatis. Hal ini disebabkkan membran sel dari membran inti sebagian besar

tersusun atas lipida(2).

DNA dapat di ukur pada panjang gelombang 260nm menggunakan

spektrofotometri UV(3). Konsentrasi DNA yang dapat diukur ini untuk A260nm = 1

setara dengan 50µg/ml DNA untai ganda. Kemurnian larutan DNA dapat dilihat

bahwa larutan murno mempunyai rasio kurang dari 1,8 menunjukan adanya RNA,

oleh karena RNA juga diserap pada panjang gelombang yang sama. Sedangkan jika

rasio kurang dari 1,8 menunjukan adanya pengotor protein atau fenol, untuk itu jika

diperlukan dapat dimurnikan kembali dengan melakukan ekstraksi kloroform

isoamilalkohol (24:1) dan dilanjutkan dengan presipitasi menggunakan Na asetat 3M

pH 4,8 (0,1 kali volume) dan etanol absolute (2 kali volume). Berikut adalah Rumus

untuk menghitung konsentrasi DNA :

Konsentrasi DNA (µg/ml) = OD260 x Faktor pengenceran x 50 µg/ml (3).

1000

IV. METODE

2

A. Alat dan bahan

Alat :

1. Blue tip

2. Ependorf

3. Gelas beaker

4. Mikropipet

5. Spektro UV

6. Yellow tip

Bahan :

1. Aquadest

2. Sampel DNA yang mengandung informasi genetik

B. Cara kerja

Cara kerja pada Spektrofotometri :

3

Dipipet 5µl sampel DNA hasil isolasi larutan

Di add aquadest 1ml, campur lalu dipindahkan pada kuvet spektrofotometer

Blangko spektrofotometer dengan kuvet berisi 1ml Aquadest

Dibaca absorbansi sampel dengan spektrofotometer pada α260nm

Dilakukan absorbansi yang kedua pada α280nm

Ditentukan rasio absorbansi yang kedua pada α260nm dan α280nm

Dihitung konsentrasi DNA untai sampel, dan tentukan konsentrasi DNA yang diperoleh

Dipilih fotometri

4

Dilakukan pengujian pada panjang gelombang yang berbeda, ditekan tombol

return

Langkah berikutnya dilakukan dengan panjang gelombang yang berbeda. Ditekan tombol return, kemudian ulangi langkah dari setting panjang

gelombang

Dibaca absorbansinya

Ditekan start, dicatat absorbansinya

Diganti blanko dengan kuvet uji DNA

Dibaca blanko

V. HASIL dan PEMBAHASAN

1. Hasil :

α 260nm Absorbansi

Blanko 0,0809

Sampel 0,0764

α 280nm Absorbansi

Blanko 0,0747

Sampel 0,0692

Perhitungan Konsentrasi DNA

Faktor pengenceran = 5ml 1000 µl = 200 x

Konsentrasi DNA λ260 nm = OD260 x FP x 50µg/ml

1000

= -0,0045 x 200 x 50 µg/ml = -45µg/ml

Konsentrasi DNA λ280 nm = OD280 x FP x 50µg/ml

1000

= -0,0055 x 200 x 50µg/ml = -55µg/ml

Rasio A260/A280 = -45/-55

= 0,8181 adanya pengotor protein atau fenol

5

2. Pembahasan :

Pada praktikum kali ini, yaitu melakukan anasilis DNA hasil isolasi dengan

menggunakan spektrofotometri. Tujuan dari dilakukannya percobaan ini adalah

agar dapat melakukan analisis kuantitatif dan kualitatif DNA mamalia hasil

isolasi menggunakan spektrofotometri UV. Sampel DNA hasil isolasi dipipet

sebanyak 5µl dan ditambahkankan aquades steril hingga volume akhir 1 ml

sehingga didapatkan pengenceran sebanyak 200 kali. Blangko yang digunakan

adalah aquadest steril sebanyak 1 ml. Blanko atau larutan contoh dimanfaatkan

untuk menstabilkan absorban akibat perubahan voltase atau intensitas cahaya dari

sumber(4).

Spektrofotometri sinar UV digunakan untuk mengukur tingkat kemurnian

DNA hasil isolasi merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada

pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada

panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau

kisi difraksi dengan detektor fototube. Dalam analisis secara spektrofotometri

terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu

daerah UV  (200 – 380 nm), daerah visible (380 – 700 nm), daerah inframerah

(700 – 3000 nm) (5). Keuntungan utama pemilihan metode spektrofotometri

bahwa metode ini memberikan metode sangat sederhana untuk menetapkan

kuantitas zat yang sangat kecil(6) .

Untuk menganalisa DNA dapat dilakukan dengan uji kualitatif yaitu dengan

gel elektroforesis, atau dengan uji kuantitatif menggunakan spektrofotometer.

Analisis yang kita lakukan terhadap sampel kali ini menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 260nm, DNA di baca pada serapan

panjang gelombang tersebut karna merupakan panjang gelombang optimal DNA

yang dapat dibaca pada spektrofotometer. DNA murni jika memiliki nila

α260/α280 = 1,8. Jika nilainya > 1,8 maka pada sampel masih terdapat RNA,

namun jika nilainya <1,8 maka pada sampel masih terdapat pengotor atau

proteinnya(7,8) .

Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan

protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang

gelombang 260 nm terhadap 280 nm. DNA memiliki nilai tingkat kemurnian

6

yang tinggi dan terbebas dari kontaminan jika Rasio OD260/OD280 nilai

absorbannya antara 1.8 sampai 2. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260

nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug

DNA untai ganda tiap ml. Penentuan panjang gelombang maksimum perlu

dilakukan untuk mengetahui dimana terjadi absorpsi maksimum dan untuk

meningkatkan proses absorpsi larutan terhadap sinar (9).

Dilakukan pengukuran ansorbansi pada 2 panjang gelombang yang berbeda

adalah pada panjang gelombang yang digunakan untuk mengetahui kandungan

DNA menggunakan spektrofotometri UV adalah 260 nm, sedangkan untuk

mengetahui kandungan protein menggunakan spektrofotometri UV dengan

panjang gelombang 280 nm.

Dari hasil perhitungan yang kami peroleh di dapat kemurnian DNA hasil

isolasi dari rasio perbandingan absorbansi 260/280 sebesar 0,8181dan

menunjukkan hasil yang diperoleh terdapat pengotor karena masuk dalam batas

range antara <1,8. Jika melebihi nilai 1,8-2.0 maka sampel yang diuji murni dari

kontaminan dari protein membran atau senyawa lainnya. Jika >2,0 maka masih

terdapat RNAnya.

VI. KESIMPULAN

Telah dilakukan analisis kuantitatif/kualitatif DNA mamalia hasil isolasi,

Panjang gelombang yang digunakan untuk mengetahui kandungan DNA

menggunakan spektro UV adalah 260 nm. Hasil nilai rasio kemurnian yang

diperoleh dari percobaan yang dilakukan adalah 0,8181(<1,8). Dari hasil ini

dapat diambil kesimpulan bahwa isolat DNA yang dianalisis masih mengandung

pengotor berupa protein atau fenol.

7

VII. DAFTAR PUSTAKA

(1) Mader,S.S.1993.Biology . Wm.C Brown Publishers: Lowa(2) Wilson,keith and john walker,2010.Principles and Techniques of Biochemistry and

molecular Biology.Cambridge University Press,New York(3) Teare,J.M., Islam,R., Flanagan,S. et al. 1997. Measurement of Nucleic Acid

concentration Using the DyNA Quant TM and the GeneQuant TM . Hoefer Pharmacia Biotech, San Francisco, Ca, USA ; Pharmacia Biotech (Biochrom), Cambridge, England, UK. J BioTechniques 22 : 1170-1174.

(4) Hayani, E dan Fatimah, T, 2002,Teknik Penentuan Kadar Vanilin Secara Spektrofotometri . Buletin Teknik Pertanian Vol.7. No 1.

(5) Khopkar, S.M. 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta(6) Riyadi, W Riyadi, Wahyu, 2009, Macam Spektrofotometri dan Pebedaannya, Milis

Kimia Indonesia(7) Passi, N., Kumar Garg, R., et al, 2012, Effecf of Luminol and Bleaching Agent On The

Serological and DNA Analysis From Bloodstain , Egyptian Journal of Forensic Science, 2:54-61

(8) Zain hasan,Sayed M.,Safe.M,muhammad, et al., 2009, Genomic DNA Extraction Method from Wormood Capilary for PCR-RAPD Studies, New york Science Journal

(9) Suharsono dan Widyastuti, U. 2006, Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen , Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB

8