JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 1

Laporan Pembahasan Jurnal Nama : Addy Prasetyo

Kromatografi II Ainaro Claudia

Gilang Pramana

Natalia Debora P

PJP Dewi Anggraeni, S.Si

Kelas KIM B – P2 – Kel.1

SENSITIFITAS PERBANDINGAN ANALISIS KOLESTEROL DENGAN KROMATOGRAFI GAS,

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI DAN METODE SPEKTROFOTOMETRI

Pendahuluan

Kolesterol merupakan steroid hewani yang terdapat paling meluas dan dijumpai

dalam hampir semua jaringan hewan. Kolesterol merupakan zat antara yang diperlukan

dalam biosintesis hormon storoid namun tak merpakan keharusan dalam makanan

(Fessenden 1986). Kolesterol memiliki struktur kimia yang mengandung 27 atom

karbon, sering ditemukan sebagai komponen dalam membran sel. Kolesterol, dalam

jumlah tertentu dibutuhkan oleh tubuh manusia terutama sebagai prekursor

pembentukan hormon steroid dan asam empedu. Namun demikian dalam jumlah

berlebih dapat memberikan pengaruh yang kurang menguntungkan untuk kesehatan,

antara lain dikatakan sebagai penanggung jawab arteroskeloris (penyempitan pembuluh

darah), penyakit jantung koroner maupun darah tinggi. Sedangkan kelompok sterol lain

sampai saat ini masih belum jelas pengaruhnya terhadap kesehatan.

Penentuan kolesterol dianggap penting karena korelasi yang erat terhadap

terjadinya koroner penyakit jantung. Metode analisis kolesterol sebelumnya sangat

bergantung pada metode spektroskopi dan gravimetri1. Metode yang didasarkan pada

enzimatik, ditambah dengan spektrofotometri untuk analisis kolesterol dari darah yang

tidak cocok untuk diaplikasikan pada makanan2,3.

Metode kromatografi lebih handal, selektif, dan akurat4,5 karena gangguan dari

sterol lainnya dapat dengan mudah diselesaikan. Namun, data dari berbagai teknik

kromatografi sangat tergantung pada ekstraksi prosedur dan intensitas langkah-langkah

saponifikasi8,9,10,11,12. Selanjutnya, para peneliti sebelumnya batas mereka investigasi ke

salah perbandingan metode ekstraksi atau pada jenis peralatan analisis yang

digunakan13,14,15.

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 2

Tujuan

Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan efisiensi dari tiga prosedur

ekstraksi yang dipublikasikan (yaitu kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi

dan metode spektrofotometri) dan kontribusi mereka dalam mempengaruhi sensitivitas

analisis kolesterol.

Bahan-bahan dan Metode

a. Standar kolesterol

Standar kolesterol (5-α-cholestan-3-β-ol, grade kromatografi; Sigma Chemical

Inc, USA), larutan dibuat dengan pengenceran dari larutan stok (3 mg /

mL). Larutan stok digunakan untuk menyiapkan larutan standar yang

mengandung 0,03, 0,15, 0,30 dan 0,60 mg/mL kolesterol. Larutan standar

tersebut diekstraksi untuk menentukan batas deteksi (Limit Of Detection-LOD),

batas kuantisasi (Limit Of Quantitation-LOQ) dan linieritas dari setiap

metode. Pengujian setiap prosedur ekstraksi diuji dengan melarutkan standar

diencerkan dengan minyak matriks (murni kelapa sawit)

b. Analisis menurut Bohac13

Standar kolesterol tersebut disaponifikasikan dengan menggunakan 10 ml

ethanolic 2% KOH dan 0.3mL larutan pirogalol. Campuran tersebut diinkubasi

pada 80oC selama 15 menit. Setelah pendinginan, 5 mL air suling ditambahkan

ke dalam campuran sedangkan bagian yang tidak tersaponifikasi diekstraksi

dengan heksana 2x10mL. Ekstrak heksana yang dihasilkan dipanaskan sampai

kering dalam penangas air (45oC)

c. Analisis menurut Beyer & Jensen5

Larutan standar yang telah disaponifikasi menggunakan 2% KOH beralkohol dan

selama 1 jam, fraksi yang tidak tersaponofikasi diekstraksi dengan heksana

2x10mL. Ekstrak digabungkan dan dicuci dengan 5 ml air suling lalu ekstrak

dipanaskan sampai kering dalam penangas air (45oC)

d. Analisis menurut bagian Ilmu Kesehatan Queensland Institut16

Larutan standar yang telah disaponifikasi menggunakan 2% KOH beralkohol,

fraksi yang tidak tersaponifikasi diekstraksi dengan petroleum eter 4x10mL dan

semua ekstrak kemudian digabungkan. Ekstrak dicuci dengan 0.5N NaOH dan

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 3

berulang kali dan dengan air suling sampai larutan menjadi netral (pH

netral). Sisa air yang masih terikat dihilangkan dengan penambahan natrium

sulfat anhidrat secukupnya, kemudian ekstrak dipanaskan dalam penangas air

menghilangkan petroleum eter.

e. Analisis spektrofotometri

Persiapan reagen pewarna:

Larutan stok dibuat dengan melarutkan 10g FeCl3.6H2O dalam asam asetat

glasial menggunakan labu takar 100 ml, sebelum digunakan, 1.0mL dari larutan

stok dipindahkan ke dalam labu 100 ml dan ditambahkan H2SO4 pekat ke dalam

larutan.

Warna Reaksi:

Ekstrak kering dari (a), (b) dan (c) disuspensikan dalam 3ml asam asetat glasial,

2mL pereaksi pewarna FeCl3, larutan berwarna yang dihasilkan itu dibaca

serapannya pada panjang gelombang 565nm. Besarnya serapan yang dihasilkan

pan ini dibandingkan dengan standar kolesterol eksternal dan

kadar kolesterol dihitung menggunakan persamaan berikut :

Dimana:

c = konsentrasi kolesterol (dari kurva standar);

DF = faktor pengenceran;

W = berat sampel

f. Metode kromatografi gas

Sebelum analisis, semua kering ekstrak dari (a), (b) dan (c) disuspensikan dalam

0.8ml petroleum eter. Analisis dilakukan dengan HP 5890 Series II Plus Gas

Chromatograph (dilengkapi dengan split/splitless injektor dan kontrol tekanan

elektronik, EPC); detektor yang digunakan adalah FID (Flame Ionization Detector

atau Detektor Ionisasi Nyala); menggunakan kolom kapiler (0.25mm x 25m

panjang) dilapisi dengan fasa temperatur tinggi 007-65HT (Alltech, USA).

Kondisi GC adalah sebagai berikut:

Injeksi volume : 1.0μl

Suhu injektor : 300oC

Temperatur detektor : 350oC

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 4

Suhu pemrograman : 65oC - 200oC (dengan laju 40oC/min) - 280oC

(dengan laju 10o C/min)

Laju aliran gas pembawa (He) : 1.6mL/min

g. Metode KCKT

Ekstrak kering dari (a), (b) dan (c) disuspensikan dalam 0.8ml

isopropanol. Analisis isokratik (50% asetonitril: 50% isopropanol) dilakukan

dengan menggunakan kolom C18 Waters Symmetry (4.6mm x 250mm) pada

sistem HPLC, yang terdiri dari 980 Jasco PU-HPLC Pump, Waters 480 UV-VIS

Detector, dan data pengolahan dari perangkat lunak.

h. Ketepatan instrumen pengukur

Presisi tersebut didasarkan pada keakuratan konsentrasi kolesterol diukur

terhadap konsentrasi kolesterol yang diketahui17. Berdasarkan empat kali

pengulangan yang dilakukan, pengukuran koefisien variasi (CV) dihitung.

i. Penentuan LOD dan LOQ

Perkiraan didasarkan pada metode yang diusulkan oleh peneliti17,18, sebelumnya

di mana LOD dicapai ketika sinyal/noise (S/N) rasionya adalah 3, sedangkan

batas kuantisasi didefinisikan sebagai titik di mana S/N = 10.

Hasil dan Pembahasan

Kepekaan yang dihasilkan jika spektrofotometer, kromatografi gas dan

kromatografi cair kinerja tinggi digunakan dalam analisis larutan standar

kolesterol, hasilnya ditunjukkan dalam Tabel 1. Presisi atau ketepatan setiap alat

pengukur didefinisikan oleh Dyson17 sebagai pengukuran yang ditentukan dengan CV

kurang dari 5%; jika CV yang dihasilkan 10%, maka presisi atau ketepatan dari instrumen

dianggap baik.

Tabel 1 Sensitifitas Instrumen untuk Analisis Kolesterol

Instrumen

Jumlah

Sebenarnya

(mg)

Presisi (n=8) LOD

(µg/mL)

LOQ

(µg/mL) Pengukuran (mg) CV (%)

Spektrofotometer 0,27 0,203 ± 0,032 5,76 14,00 15,00

KCKT 0,27 0,263 ± 0,013 4,94 0,08 0,60

Kromatografi Gas 0,27 0,202 ± 0,048 23,76 4,00 13,00

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 5

Peralatan yang paling konsisten bedasarkan percobaan adalah KCKT yang

memberikan nilai LOD dan LOQ terendah. Bahkan pada LOD yang rendah, respon yang

dihasilkan jelas berbeda (Gambar 1).

Gambar 1 Kromatogram Analisis Kolesterol dengan KCKT

Sebaliknya, LOD kromatografi gas lebih tinggi dan kurang reprodusibel, yang

ditunjukkan oleh CV yang lebih tinggi. Kolesterol telah dianalisis tanpa derivatisasi

terlebih dulu dan puncak yang dihasilkan lebih tajam. TMS-derivatised cholesterol akan

mengganggu linieritas karena adanya pengendapan silikondioksida pada detektor

(FID)22,23. Kinerja spektrofotometer, lebih baik daripada GC dalam hal reproduktibilitas,

tetapi kepekaannya kurang (LOD = 14 µg/mL) dibandingkan dengan metode KCKT. Tidak

seperti yang telah dikemukakan oleh Bachman dkk24, KCKT juga kembali menunjukkan

nilai kolesterol yang paling dekat (0,263 mg/mL), relatif terhadap nilai sebenarnya dari

standar uji (0,270 mg/mL). Berdasarkan data ini, KCKT adalah metode yang dianggap

sebagai metode pilihan untuk penentuan kolesterol.

Gambar 2 Kromatogram Analisis Kolesterol Dengan Kromatografi Gas

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 6

Pada konsentrasi yang lebih tinggi (Gambar 2) respon yang diperoleh sangat

tepat dan reprodusibel. Kisaran konsentrasi dipilih untuk seri pengenceran yang sesuai

dengan kisaran normal kolesterol yang ditemukan dalam matriks makanan, Tanggapan

deteksi dan linieritas standar diekstraksi dari minyak matriks sangat bagus untuk analisis

dengan KCKT. Relatif baik terhadap standar (Gambar 3).

Gambar 3 Kurva Standar Analisis Kolesterol dengan berbagai metode preparasi

Tabel 2 Kolesterol yang di dapatkan dari Matriks Minyak

Metode Konsentrasi

sebenarnya (mg/mL)

Ekstrak Kolesterol*

(mg/mL) CV (%)

Perolehan

kembali (%)

1. Spektrofotometri

Bohac 0,30 0,26 6,66 86,67

B & J 0,30 0,11 18,17 36,67

QSE 0,30 0,38 18,42 126,67

2. KCKT

Bohac 0,30 0,29 7,50 96,67

B & J 0,30 0,22 9,10 73,33

QSE 0,30 0,33 9,56 110

3. Kromatografi Gas

Bohac 0,30 0,25 28,57 83,33

B & J 0,30 0,18 51,23 60,00

QSE 0,30 0,44 34,38 146,67

Perolehan kembali kolesterol standar menggunakan semua tiga metode

diperlihatkan pada Tabel 2. Berdasarkan hasil dari Gambar. 3 dan Tabel 2, jelas bahwa

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 7

metode ekstraksi yang diusulkan oleh Bohac et al.,13 lebih unggul daripada dua metode

lainnya. Kolesterol yang di dapatkan kembali jumlahnya sangat dekat dengan jumlah

kolesterol ditambahkan. Metode Queensland16 selalu menghasilkan nilai-nilai yang lebih

tinggi (terlalu tinggi), seperti yang diperhatikan sebelumnya oleh peneliti, kadar

kolesterol dapat dipengaruhi oleh metode ekstraksi dan analisis5,6.

Referensi

1 Sweeney, J. & Weihrauch, J. 1976. Summary of available data for cholesterol in food

and methods for its determination. CRC Crit. Rev. Food Nutr. 8, 131 – 159.

2 Touchstone, J.C. 1986. CRC Handbook of Chromatography. CRC Press Inc., Florida, USA.

pp 21-218.

3 Jiang, Z., Fenton, M. & Sim, J.S. 1991. Comparison of four different methods for egg

cholesterol determination. Poult. Sci. 70(4), 1015 – 1018

4 Maxwell, R.J. & Schwartz, D.P. 1979. A rapid quantitative procedure for measuring the

unsaponified matter from animal, marine and plant oil. J.Am. Oil Chem. Soc. 56(6),

636 – 635

5 Beyer, R.S. & Jensen, L.S. 1989. Overestimation of cholesterol content of eggs.

J.Agric.Food Chem. 37, 917 – 920

6 Kritchevsky, D. & Dehoff, J.L. 1978. Sterol content of seafood as a function of analytical

method. J.Food Sci. 43(6), 1786 – 1789

7 Folch, J.,Lees, M. & Sloane, G.H. 1956. A simple method for the isolation and

purification of total lipids from animal tissues. J. Biol.Chem. 226, 497 - 509

8 Hubbard, W.D., Sheppard, A.J., Newkirk, D.R. & Osgood, T.J. 1977. Gas liquid

chromatographic determination of cholesterol and other sterols in foods. J. Assoc.

Off. Anal. Chem. 60(6), 1302 – 1305

9 Punwar, J.K. 1976. Gas liquid chromatographic determination of total cholesterol in

multi-component foods. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 58(4), 804-809

10 Sheppard, A.J., Newkirk, D.R., Hubbard, W.D. & Osgood, T. 1977. Gas liquid

chromatographic determination of cholesterol and other sterols in foods.

J.Assoc.Off. Anal. Chem. 60(6), 1302 - 1306

11 Oles, P., Gates, G. Kensinger, S., Patchell, J., Schumacher, T. & Silcox, A. 1990.

Optimization of the determination of cholesterol in various food matrices. J.Assoc.

Off. Anal. Chem. 73(3), 724 - 727

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 8

12 Bitman, J. & Wood, D.L. 1980. Comparison of two extraction of cholesterol in egg

yolk. Poult.Sci. 59(7), 2014 – 2017

13 Bohac, C.E., Rhee, K.S., Cross, H.R. & Ono, K. 1984. Assessment of methodologies for

colorimetric cholesterol assay of meat. J.Food Sci. 53(6), 1642 – 1693.

14 Elswyk, R.D., Schake, L.S. & Hargis, P.S. 1991. Research Note: Evaluation of two

extraction methods for the determination of egg yolk cholesterol. Poult. Sci. 70(4),

1528

15 Guiochon, C.G. & Siouffi, A. 1979. Comparison of various systems for separation of

free sterols by HPLC. J.Anal.Chem. 51(11), 1661 – 166

16 Queensland Health Science Institute (1995) Method QSE-CAM-004.

17 Dyson, N. 1992. Chromatographic Integration Methods. The Royal Society of

Chemistry, Cambridge, United Kingdom. 1-67, 87-156.

18 Smith, J.S. 1994. Evaluation of analytical data. In: Nielsen, S.S. 1994. Introduction to

the chemical analysis of food. Jones & Bartlett Publ., London. pp 53-59.

19 Fenton, M. & Sim, J.S. 1991. Determination of egg yolk content by on-column

capillary gas chromatography. J.Chromatogr. 540, 323 – 329

20 Duncan, I.W., Culbreth, P.H. & Burtis, C.A. 1979. Determination of free, total and

esterified cholesterol by HPLC. J.Chromatogr. 162, 281-292

21 Ballesteros, E., Gallego, M. & Valcarcel, M. 1996. Gas chromatographic determination

of cholesterol and tocopherol in oils and fats with automatic removal of

interfering triglyderides. J.Chromatogr. 719, 221- 227

22 Kovacs, M.I.P., Anderson, W.E. & Ackman, R.G. 1979. A simple method for the

determination of cholesterol and some plant sterols in fishery-based food

products. J.Food Sc. 44 , 1299 – 1300

23 Al-Hasani, S.M., Shabany, H. & Hlavac, J. 1993. Rapid determination of cholesterol in

selected frozen foods. J.Assoc. Off. .Anal.Chem. 73(5), 817 – 820

24 Bachman, K.C., Lin, J.H. 7 Wilcox, C.J. 1976. Sensitive colorimetric determination

cholesterol in dairy products. J.Assoc. off.Anal.Chem. 59(5), 1146-1149