PEWARNAAN GRAM

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan

gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini

diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram

(1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk

membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (filzahazny,

2008).

Pewarnaan gram termasuk pewarnaan diferensial yang digunakan untuk

membedakan bakteri gram negative dan bakteri gram positif.

Perbedaan gram (+) dan gram (-)

Sifat Gram (+) Gram (-)

• Komposisi Kandungan lipid rendah Kandungan lipid tinggi

• Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitif Lebih tahan

• Penghambatan warna Lebih dihambat Kurang dihambat

• Ketahanan terhadap fisik Lebih tahan Kurang tahan

• Kebutuhan Nutrien Kompleks Relatif

Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pewarna basa,yaitu kristal violet.Lalu

digunakan larutan iodin pada tahap ini,seluruh bakteri akan berwarna biru.Lalu sel

akan diberi alkohol.sel gram positif akan mempertahankan kompleks kristal

violet-iodin sehingga tetap berwarna biru;sedangkan sel gram negatif akan

kehilangan warna birunya karena alkohol.pada langkah terakhir digunakan

counterstain (misalnya,pewarna merah safranin ) sehingga sel gram negatif yang

tadinya kehilangan warna akan memiliki warna yang kontras;sel gram positif

sekatang akan berwarna ungu.

Pewarnaan gram merupakan prosedur yang sangat membantu dalam mikrobiologi

diagnostik.Sebagian besar spesimen yang diserahkan ketika dicurigai terjadi

infeksi oleh bakteri,harus diapus pada slide kaca ,diberi pewarnaan gram dan

diperiksa dibawah mikroskop.Pada pemeriksaan mikroskop reaksi gram dan

morfologi bakteri harus diperhatikan.Gambaran bakteri pada apusan yang

diwarnai gram tidak memungkinkan identifikasi spesies.

Adapun metode pewarnaan gram yaitu:

1. Fiksasi apusan dengan pewrnaan gram

2. Lapisi dengan larutan ungu kristal

3. Bilas dengan air,jangan membeku.

4. Lapisi dengan larutan yodium Gram

5. Bilas dengan air,jangan membeku.

6. Kaburkan warna selama 10-30 detik dengan agitasi perlahan dalam aseton

(30 mL dan alkohol 70 mL)

7. Bilas dengan air,jangan membeku.

8. Lapisi dengan larutan safranin selama 10-30 detik(larutan 2,5 % dalam

alkohol 95 %)

9. Bilas dengan air dan biarkan mengering.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

Zat warna utama (violet kristal)

Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk

mengintensifkan warna utama.

Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang

digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai

kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga

alcohol.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu

1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

PEWARNAAN TAHAN ASAM

Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok

Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini

disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama

(carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan

asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam

karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol

fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay, 1994).

Uji bakteri tahan asam (BTA) pada praktikum kali ini menggunakan prosedur

pewarnaan Ziehl Neelson yaitu dengan memberi larutan pewarna carbol fuchsin,

alkohol asam, dan methylen blue. Hasil yang diperoleh saat praktikum yaitu

positif 1 dan positif 2 yang dilaporkan secara kuantitatif menurut IUAT, yaitu:

Negatif: apabila tidak ditemukan BTA.

Positif: apabila terdapat 1 – 9 BTA / 100 lapang pandang.

Positif 1: apabila terdapat 10 – 90 BTA / 100 lapang pandang.

Positif 2: apabila terdapat 1 – 9 BTA / 1 lapang pandang.

Positif 3: apabila terdapat > 10 BTA / 1 lapang pandang.

Tujuan pemberian carbol fuchsin 0,3% adalah untuk mewarnai seluruh sel bakteri.

Tujuan pemberian alkohol asam 3% adalah meluruhkan warna dari carbol fuchsin,

tetapi pada golongan BTA tidak terpengaruh pemberian alkohol asam 0,3%

karena memiliki lapisan lipid yang sangat tebal sehingga alkohol sukar menembus

dinding sel bakteri tersebut dan warna merah akibat pemberian carbol fuchsin

tidak hilang. Tujuan pemberian methylen blue adalah memberi warna background

(Pelczar dan Chan, 1986).

Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan asam karbolfuchsin

(fuchsin basa yang terlarut dalam campuran fenol-alkohol-air)bahkan jika dicuci

dengan asam hidroklorat dalam alkohol dalam alkohol.sediaan apapun apus sel

pada pada slide dimasukkan dalam karbolfuchsin dan dipanaskan dengan uap

panas.Dalam hal ini pelunturan wrna akan terjadi akibat alkohol-asam,dan pada

tahap akhir digunakan pewarna pembalik (counterstain)yang kontras.Bakteri

tahan asam akan berwarna merah yang lain akan berwarna sama dengan pewarna

pembalik.

Metode pewarnaan tahan asam Ziehl-Neelsen yaitu:

1. Fiksasi apusan dengan pemanasan

2. Lapisi dengan larutan karbolfuchsin,panaskan hati-hati selama 5 menit

diatas diatas api langsung (atau selama 20 menit dengan water bath)

3. Bilas dengan air

4. Kaburkan warna dengan asam-alkohol sampai warna merah mudah pucat

menetap

5. Bilas dengan air

6. Warnai lagi selama 10-30 detik dengan larutan metilen biru Loeffler

7. Bilas dengan air dan biarkan mengering.

PEWARNAAN SPORA

Spora adalah bahan refraktil intraselular yang paling mudah diamati pada suspensi

sel yang tidak diwarnai,atau tampak seperti area yang tak berwarna pada sel-sel

yang diwarnai dengan pewarna konvensional.Dinding spora relatif tidak

permeabel,namun zat warna dapat menembusnya dengan cara memanaskan

preparat.Impermeabilitas ini juga mencegah pelunturan warna spora akibat

pemakaian alkohol dalam jangka waktu yang cukup untuk melunturkan warna sel-

sel vegetatif.

Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa,

diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora

yang paling banyak digunakan. Hasil pewarnaan : badan bakteri berwarna

biru, spora berwarna merah.

Caranya :

1. Buat suspensi biakan bakteri berumur 72 jam dalam larutan NaCl

Fisiologik di dalam tabung, tambahkan ke dalam suspensi tadi larutan

karbol-fukhsin dalam jumlah yang sama banyak dan panaskan di atas api

kecil selama 5 menit

2. buatlah sediaan oles dari campuran tersebut

3. setelah kering dan difiksasi tuangi larutan H2SO4 1 % selama 2 detik

4. beri alkohol 96% selama 2 detik kemudian cuci dengan air bersih

5. beri larutan biru-metilen dan biarkan selama 3 menit

6. cuci lagi dengan air lalu keringkan dengan kertas saring

Untuk mempermudah pengamatan, terutama pada spora bakteri dilakukan metode

pewarnaan spora agar peneliti ataupun pengamat mampu melihat spora,

membedakan dengan vel vegetatif ataupun mengamati bentuknya. Menurut

Waluyo (2004) endospora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada

umumnya. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan endospora

dengan larutan Hijau Malakit. Metode Shaeffor, foton endospora diwarnai

pertama dengan larutan Hijau Malakit. Pada pengecatan ini, sifatnya kuat karena

dapat berpenetrasi ke dalam endospora dengan perlakukan larutan Hijau Malakit.

Teknik ini akan menghasilkan warna hjau pada endospora dan merah pada sel

vegetatif.

Prosedur pewarnaan spora bakteri adalah sebagai berikut:

1.      Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan di atas nyala api spritus.

2.      Teteskan setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut

3.      Secara aseptic ambillah inokulum bakteri yang akan diperiksa lalu letakkan

di atastetesan aquades itu kemudian ratakan perlahan-lahan

4.      Ambillah kaca benda lain yang bersih lalu letakkan di ats kaca benda

sediaan tersebut sehingga membentuk sudut 450

5.      Geserkan kaca benda yang tegak ini, sehingga sediaan menjadi tipis dan

merata, biarkan sampai mengering

6.      Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut di atas nyala api

lampu spritus dengan cepat

7.      Teteskan larutan hijau malakit di atas sediaan itu lalu panaskan sediaan

tersebut diatas nyala api spritus selama 3 menit, jagalah jangan sampai sediaan

mendidih atau mengering, jika mengering, tambahkan tetesan larutan hijau

malakit. Selama pemanasan jepitlah sediaan dengan pinset.

8.      Letakkan larutan hijau malakit di atas kawat penyangga yang diletakkan di

atas mangkuk pewarna, lalu biarkan sampai dingin

9.      Cucilah kelebihan larutan hijau malakit dengan air kran dalam botol

penyemprot

10.  Teteskan larutan safranin di atas sediaan tersebut, lalu biarkan selama satu

menit

11.  Cucilah kelebihan larutan safranin pada sediaan itu

12.  Keringkan seiiaan dengan kertas penghisap dan amatilah di bawah

mikroskop.

Jika pewarnaan ini berhasl dengan baik, maka sel vegetatif bakteri akan

berwarna merah, jika sel membentuk spora maka spora akan Nampak

berwarna hijau

PEWARNAAN NEGATIF

Prosedur ini melibatkan pewarnaan latar belakang dengan pewrna

asam,menyebabkan sel yang diuji jelas tak berwarna.Pewarna hitam nigrosin

kerap digunakan.Metode ini dipakai pada sel atau struktur yang sulit diwarnai

secara langsung.

Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau

negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus

atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan

bakteri.oleh karena itu,sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang

berwarna.

Pada pengecatan ini digunakan cat asam nirosin (tinta cina). Pengecatan ini

dilakukan untuk mewarnai latar belakang preparat sedangkan bakteri sendiri tidak

terwarnai serta untuk mengamati ukuran, bentuk, dan tata letak sel. Setelah

pengamatan dibawah mikroskop diperoleh preparat mikroba berwarna hitam

sedangkan bakteri sendiri tidak berwarna (berwarna putih) dan berbentuk basil

(batang).

Cara pewarnaan negatif

- Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskop

Adapun metode pewarnaannya yaitu:

1.Membersihkan gelas objek dengan alcohol 70 % agar bebas lemak.

2. Mengambil 1 ose yang digunakan umntuk mengambil biakan, meletakkan

biakan pada objek gelas kemudian mencampur dengan 1-2 tetes nigrosin.

3. Dengan menggunakan objek gelas lain menyentuhkan sisi objek gelas

C,tersebut pada sampel tersebut sehingga membentuk sudut 300 selanjutnya

menarik objek gelas tersebut dengan arah yang berlawanan hingga membentuk

film tipis.

4. Membiarkan hingga mengering lalu mengamati diubawah mikroskop dengan

pembesaran 100x dan menggunakan minyak imersi.

PEWARNAAN KAPSUL

Prosedur seperti pewarna kapsul (metode welch) melibatkan penggunaan larutan

kristal violet panas yang dilanjutkan dengan pembilasan menggunakan larutan

tembaga sulfat.proses pembilasan ini dimaksudkan untuk menghilangkan warna

yang berlebihan karena pembilasan konvensional dengan air bisa melarutkan

kapsul.Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang,dan memberikan

tampakan hasil berupa latar belakang berwarna biru pucat.

Pada beberapa jenis bakteri adanya kapsul sebagai petunjuk virulensi. Semua

kapsul bakteri tampaknya dapat larut dalam air. Komposisi kimiawi kapsul ada

yang berupa glukosa ( misalnya dektrosa pada leokonostok mesendteroides),

polimer gula amino (misalnya asam hialuronat pada Staphylococcus piogenik),

polipeptida (misalnya polimer asam D-glutamat pada Bacillus antraksis) atau

kompleks polisakarida protein ( misalnya B disentri).

Simpai biasanya diperlihatkan dengan cara pewarnaan negatif atau modifikasi dari

cara itu. Salah satu pewarnaan simpai (kapsul) ini ( metode Welch) meliputi

pemberian larutan kristal ungu panas disusul kemudian dengan pencucian dengan

larutan tembaga sulfat. Tembaga sulfat ini digunakan untuk menghilangkan zat

warna berlebihan karena pencucian biasa dengan air akan melarutkan simpai.

Garam tembaga memberi pula warna pada latar belakang, sehingga sel dan latar

belakang akan tampak biru tua dan simpai berwarna biru yang lebih muda.

Cara Kerja :

• Persiapkan 2 buah objek glass yang bersih dan bebas lemak

• Letakkan 1 ose tinta cina pada bagian pinggir objek glass

• Diambil 1 ose suspensi bakteri, campurkan dengan tinta cina sampai homogen

• Dengan ujung objek glass yang lain, buat hapusan, dibiarkan kering dan fiksasi

• Ditambahkan carbol fuchsin 1/10 selama 1 menit

• Sisa cat dibuang dan dikeringkan..

• Diperiksa dibawah mikroskop.

Interpretasi hasil : Kapsul: transparan dan Badan bakteri : warna merah.

PEWARNAAN SEDERHANA

Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan

larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah

difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.Pewarnaan sederhana, merupakan

pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya

digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri

telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat

basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan

sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif).

Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan

bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan

lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo, 1990).

Pengecatan sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras

antara sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel

mikroba itu sendiri, dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna

khususnya warna Kristal violet. Dan Menggunakan suatu zat warna seperti

methylen blue,air fuchsin,gentian violet,kristal ungu, biru methylen lofer.

Pada pengecatan sederhana digunakan bakteri Bacillus cereus dan Salmonella

typii. Setelah pengecatan diperoleh bakteri tersebut berwarna ungu, yang berarti

bakteri tersebut menyerap zat warna cat tersebut sehingga Nampak pada

mikroskop. Zat warna yang umunya digunakan yakni yang bersifat alkalin

(kromatofornya bermuatan +).

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang

kemudiandifiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi

jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari

bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan

melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell

dan Reece, 2005)).

Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan

pelarut.Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat

morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak

digunakan adalag biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-

karbol (5 detik).

Caranya :

1. buat sediaan oles dan simpan di atas 2 batang kawat horisontal atau

menggunakan bak pewarnaan.

2. beri zat warna sehingga seluruh sediaan tertutup penuh

3. biarkan selama waktuyang diperlukan, seperti di atas.

4. sediaan dicuci dengan air sampai bersih, lalu keringkan di antara dua kertas

saring. Lalu dapat dilihat di bawah mikroskop dengan lensa objektif 100x

menggunakan minyak imersi.

Daftar Pustaka:

Jawetz, Melnick, Adelberg, 2008, Mikrobiologi Kedokteran, edisi 23, Penerbit

Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Prescott, Harley, Klein’s, 2008, Microbiology 7th edition, Published by McGraw-Hill, Boston.

Bailey and Scott’s, 2007, Diagnostic Microbiology 12th edition, Mosby Elsevier, Houston

http://microorganisme.blogspot.com

www.fkugm2008.com

http://01-bakteri.html