Wirda Hanum240210120074V. PEMBAHASAN

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Pada prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi (Cupritabu, 2010).Kegunaan umum HPLC adalah untuk: pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hamper sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry, HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif (Cupritabu, 2010).HPLC adalah sebuah instrumen yang menggunakan prinsip kromatografi (pemisahan) dengan menggunakan fase gerak cair yang dialirkan melalui kolom yang merupakan fase diam menuju ke detektor dengan bantuan pompa. Sampel dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan senyawa-senyawa dalam kolom akan keluar atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi antara senyawa terhadap fase diam. Senyawa-senyawa yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar terlebih dahulu, dan sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan keluar lebih lama. Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Dari kromatogram tersebut akan dapat diidentifikasikan waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak. Informasi tR digunakan untuk analisis kualitatif, sedangkan informasi luas area atau tinggi puncak untuk analisis kuantitatif.

Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat konsentrasi maksimum. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat pembuatan pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, bufer, dan reagen dengan kemurnian yang tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk HPLC berderajat HPLC (HPLC grade). Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada system kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini (Gandjar dan Rohman, 2008). Praktikum kali ini dilakukan proses pemisahan komponen kafein dari sampel dua sampel yang berbeda. Sebelum dilakukan proses pemisahan, dilakukan preparasi sampel terlebih dahulu sehingga untuk mengurangi komponen yang tidak diinginkan. Banyaknya komponen akan menyebabkan banyaknya peak yang muncul pada kromatogram bahkan tidak jarang antar peak saling bertumpuk( overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi.Hal selanjutnya yang dilakukan adalah pengkondisian kolom. Pengkondisian kolom HPLC meliputi pengaturan tekanan kolom, laju alir fase gerak, serta pencucian kolomdengan menggunakan metanol-air. Proses ini dilakukan untuk meningkatkankepekaan kolom dan menghindari pengotor atau sisa analit yang masih tertahan pada kolom pada analisis sebelumnya agar tidakmenggangguanalisisdan merusak kolom. Setelah dilakukan pengkondisian kolom. Selanjutnya dilakukan analisis sampelSampel yang sudah dipreparasi disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik. Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Penyuntik ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untukautosamplerpada HPLC (Gandjar dan Rohman, 2008).Setelah injeksi sampel dilakukan, kemudian sampel akan dipisahkan sesuai dengan interaksinya dengan fase diam. Komponen yang memiliki sedikit interaksi dengan fase diam akan lebih dahulu keluar daripada komponen yang banyak berinteraksi. Selanjutnya, komponen yang keluar akan dideteksi oleh detektor dan dihasilkan keluaran berupa kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik antara intensitas komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi.Berdasarkan kromatogram yang dihasilkan pada sampel 1 dan sampel 2, grafik yang dihasilkan menghasilkan peak walaupun tidak terlalu banyak. Seharusnya tampilan kromatogram ini berupa grafik lurus, lancip, dan simetris. Hal ini disebabkan karena preparasi sampel yang kurang sempurna dan disebabkan oleh adanya difusi longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu sendiri disebabkan oleh penyebaran komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer massa disebabkan oleh kecepatan komponen yang tidak merata. Berdasarkan analisis kualitatif, jika dibandingkan antara grafik sampel 1 dengan grafik sampel 2, grafik sampel memiliki tinggi pucak dan luas daerah yang lebih tinggi dibandingkan grafik sampel 2. Hal ini menunjukkan konsentrasi komponen yang diamati (dalam hal ini kafein) pada sampel sampel lebih tinggi dari pada sampel sampel 2, karena semakin tinggi puncak dan semakin luas daerahnya, maka konsentrasi komponennya semakin besar. Dari analisis standar yang dilakukan, didapatkan bahwa konsentrasi standar adalah 100 ppm (100 mg/kg). Luas permukaan standar kafein adalah 1649943, dengan waktu retensi 5,102 menit. Terdapat dua sampel yang diujikan, yaitu sampel 1 dan sampel 2. Sampel 1 memiliki waktu retensi 5,041 menit dengan luas permukaan 856830. Sedangkan sampel 2 memiliki waktu retensi 5,063 menit, dengan luas permukaan 805063. Kita dapat menghitung kosentrasi kafein yang terdapat pada sampel dengan menggunakan rumus :

Berikut merupakan perhitungan untuk sampel 1 :

sehingga didapat C sampel adalah 51,93 ppmBerikut merupakan perhitungan untuk sampel 2:

sehingga didapat C sampel adalah 48,79 ppm.

Berdasarkan hasil perhitungan, konsentrasi kafein pada sampel 1 lebih tinggi dari pada sampel 2. Hal ini selaras dengan hasil analisis kualitatif pada grafik atau kroatogram yang dihasilkan.HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain:1. Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran2. Mudah melaksanakannya3. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi4. Dapat digunakan bermacam- macam detector5. Kolom dapat digunakan kembali6. Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.7. Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena HPLC dilakukan pada suhu kamar.8. Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas

Sedangkan kekurangannya adalah:1. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu2. Hanya bisa digunakan untuk asam organic3. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi4. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

VI. KESIMPULAN1. Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector, pengolahan data.2. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu campuran.3. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, sedangkan kekurangannya adalah larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas4. Konsentrasi kafein pada sampel 1 adalah sebanyak 51,93 5. Konsentrasi kafein pada sampel 2 adalah sebanyak 48,79

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, M., dan Suherman. 1991.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University Press. Surabaya.

Cupritabu, 2010. Menghitung Kadar Parasetamol dalam Obat dengan HPLC.

Gandjar, G.H., dan Rohman, A., (2007). Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar: Yogyakarta: hal.120, 164, 166.

Khopkar, S.M., 1990.Konsep Dasar Kimia Analitik. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta.