PROPOSAL MINI PROJECTBIOREAKSI

Oleh:

Kelompok 8

Jamiyatul Fitria

(111810301018)Marga Romadhona

(111810301022)Linda Kartikawati

(111810301026)Putri Zakiyatul Fadhilah (111810301038)JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS JEMBER

2014

BAB I

PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Semua makhluk hidup agar dapat melangsungkan kehidupannya membutuhkan energi. Energi ini diperoleh dari biomolekul seperti karbohidrat, protein, lemak, vitamin, dan mineral. Dalam keadaan normal makhluk hidup mendapatkan energi dari katabolisme karbohidrat yang menghasilkan energi dalam bentuk ATP. Dalam keadaan kekurangan karbohidrat energi dapat diperoleh dari selain karbohidrat seperti, lemak kemudian protein.Lemak dibagi menjadi dua yaitu, lemak sederhana dan lemak kompleks. Lemak sederhana adalah lemak yang terdiri dari gliserol dan asam lemak, contohnya tripalmitin, trioleil, trimiristin dan lain-lain. Lemak kompleks adalah lemak yang tidak hanya tersusun dari gliserol dan asam lemak, tetapi juga terdiri dari glukosa, protein, fosfat, kolin dan lain-lain, contohnya adalah glikolipid, fosfolipid, Phosphatidylcholines dan lain-lain.Phosphatidylcholines (Lesitin) adalah kelas fosfolipid yang menggabungkan kolin sebagai sebuah kepala gugus. Lesitin adalah komponen utama dari membran biologis dan dapat dengan mudah diperoleh dari berbagai sumber mudah tersedia seperti kuning telur atau kacang kedelai dimana Lesitin dapat diekstrak secara mekanik maupun secara kimia dengan menggunakan ekstrak metanol.Untuk menggunakan Lesitin ini sebagai sumber energi maka tubuh harus memecahnya menjadi komponen-komponen yang lebih kecil seperti gliserol dan asam lemak. Untuk menghidrolisis Lesitin menjadi senyawa yang dapat dikonversi menjadi energi maka digunakan enzim fosfolipase D. Enzim ini dapat diperoleh dari kubis. Untuk mengetahui aktivitas dari enzim fosfolipase D maka dilakukanlah percobaan ini dengan menggunakan substrat lesitin yang berasal dari kedelai sebagai suber nabati dan kuning telur sebagai sumber hewani.1.2Tujuan Praktikum- Mampu mengisolasi enzim fosfolipase D dari kubis.-Mempelajari reaksi enzimatis fosfolipase D dari kubis dengan subtrat fosfolipid dari kedelai.-Mempelajari reaksi enzimatis fosfolipase D dari kubis dengan subtrat fosfolipid dari kunin telur.BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

1.1 Enzim Fosfolipase D

Fosfolipase D mengkatalisis hidrolisis ikatan fosfodiester dari glycerophospholipids untuk menghasilkan asam phosphatidic dan headgroup contohnya adalah Phosphatidylcholine. Aktifitas Fosfolipase D telah terdeteksi sederhana untuk organisme yang kompleks dari virus dan bakteri ragi, tumbuhan, dan mamalia. Meskipun enzim dengan selektivitas yang lebih luas ditemukan di beberapa organisme yang lebih rendah, pabrik, ragi, dan enzim mamalia yang selektif untuk fosfatidilkolin. Kedua mamalia fosfolipase D isoform diatur oleh protein kinase dan protein mengikat GTP dari ribosylation-ADP dan keluarga Rho. Mamalia dan phospholipases ragi D juga potently dirangsang oleh phosphatidylinositol bisphosphate 4,5-. Tinjauan ini membahas identifikasi, karakterisasi, struktur, dan peraturan fosfolipase D. genetik dan pendekatan farmakologis melibatkan D fosfolipase dalam berbagai proses seluler yang meliputi reseptor sinyal, kontrol transportasi membran intraseluler, dan reorganisasi dari sitoskeleton aktin. Kebanyakan ide-ide tentang fungsi D fosfolipase menganggap bahwa produk asam phosphatidic adalah utusan lemak intraselular. Calon target untuk asam phosphatidic fosfolipase-D-dihasilkan termasuk phosphatidylinositol 4-5-fosfat kinase dan protein kinase raf. asam Phosphatidic juga dapat dikonversi menjadi dua mediator lipid lainnya, diasilgliserol dan asam phosphatidic lyso. Terkoordinasi aktivasi dari jalur fosfolipase-D-tergantung kemungkinan account untuk peran pleitropic untuk enzim-enzim dalam banyak aspek regulasi sel. Fosfolipase DE dapat diperoleh dari tanaman seperti kubis.Fosfolipase yang terletak di membran sel atau di dalam lisosom menguraikan gliserolosfolipid. Fosfolipase A1 mengeluarkan gugus asil lemak pada karbon 1 gliserol, dan fosfolipase A2 mengeluarkan asam lemak pada karbon 2. Asam lemak C2 pada fosfolipid membran sel biasanya adalah asam arakidonat. Asam lemak ini dikeluarkan sebagai respon terhadap sinyal untuk pembentukaneikosanoid. Ikatan yang menyatukan karbon 3 gliserol ke fosfat diputuskan oleh fosfolipase C. Rangsangan hormon mengaktifkan fosfolipase C, yang menghidrolisis PIP2 menjadi caraka kedua (second messenger) DAG dan inositol trifosfat (IP2). Ikatan antara fosfat dan gugus kepala diputuskan oleh fosfolipase D.2.2 LesitinLesitin adalah nama lain dari fosfatidilkolina. Phosphatidylcholines (PC) adalah kelas fosfolipid yang menggabungkan kolin sebagai sebuah headgroup T. Lesitin adalah komponen utama dari membran biologis dan dapat dengan mudah diperoleh dari berbagai sumber yang tersedia di alam. Lesitin pada kuning telur dan kacang kedelai menjadi sumber kandungan fofatidilkolina yang tinggi.

Phosphatidycoline lebih umum ditemukan dalam exoplasmic dari membran sel. Fosfolipid ini terdiri dari kelompok kepala kolin dan asam glycerophosphric dengan berbagai asam lemak, yang saah satunya adalah asam lemak jenuh (dalam contoh,asam palmitat atau heksadekonat).2.3 Kubis

Kubis segar mengandung air, protein, lemak, karbohidrat, serat, kalsium, fosfor, besi, natrium, kalium, vitamin (A, C, E, tiamin, riboflavin, nicotinamide), kalsium, dan beta karoten. Selain itu, juga mengandung senyawa sianohidroksibutena (CHB), sulforafan, dan iberin yang merangsang pembentukan glutation, suatu enzim yang bekerja dengan cara menguraikan dan membuang zat-zat beracun yang beredar di dalam tubuh. Tingginya kandungan vitamin C dalam kubis dapat mencegah timbulnya skorbut (scurvy). Adanya zat antosianin menyebabkan warna kubis dapat berubah menjadi merah. Kandungan zat aktifnya, sulforafan dan histidine dapat menghambat pertumbuhan tumor, mencegah kanker kolon, dan rektum, detoksikasi senyawa kimia berbahaya, seperti kobalt, nikel dan tembaga yang berlebihan di dalam tubuh, serta meningkatkan daya tahan tubuh untuk melawan kanker. Kandungan asam amino dalam sulfurnya, juga berkhasiat menurunkan kadar kolesterol yang tinggi, penenang saraf, dan membangkitkan semangat.

2.4Kedelai

Kedelai (kadang-kadang ditambah "kacang" di depan namanya) adalah salah satu tanaman polong-polongan yang menjadi bahan dasar banyak makanan dari Asia Timur seperti kecap, tahu, dan tempe. Berdasarkan peninggalan arkeologi, tanaman ini telah dibudidayakan sejak 3500 tahun yang lalu di Asia Timur. Kedelai putih diperkenalkan ke Nusantara oleh pendatang dari Cina sejak maraknya perdagangan dengan Tiongkok, sementara kedelai hitam sudah dikenal lama orang penduduk setempat. Kedelai merupakan sumber utama protein nabati dan minyak nabati dunia. Penghasil kedelai utama dunia adalah Amerika Serikat meskipun kedelai praktis baru dibudidayakan masyarakat di luar Asia setelah 1910.

Kandungan Kedelai dalam 100 gram

- Protein 34,9 gram- Kalori 331 kal

- Lemak 18,1 gram

- Hidrat Arang 34,8 gram

- Kalsium 227 mg

- Fosfor 585 mg

- Besi 8 mg

- Vitamin A 110 SI

- Vitamin B1 1,07 mg

- Air 7,5 gram.

Hidrolisis lemak

BAB IIIMETODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat Blender Lemari es Sentrifuge Pipet volum 5 mL Pipet volum 25 mL Pipet tetes Ball pipet Labu ukur 50mL Labu ukur 250 mL Beaker glass 50 mL Penangas

Gelas ukur 250 mL Tabung reaksi Corong buchner Kertas saring Spatula Botol gelap Botol Semprot Neraca Spektrofotometer

pH meter Termometer Inkubator3.1.2 Bahan

Kubis Kedelai Telur

Larutan NaCl Larutan HCl Larutan NaOH

Buffer Fosfat

Amonium sulfat

95 % alkohol Metanol Kloroform KCl FeSO4 Eter CaCl2 Substrat Lesitin Substart Kolin Reagen iodin Reagen molibdat 3.2 Skema Kerja3.2.1 Ekstraksi Enzim pada Kubis

direndam dalam air dibekukan pada suhu 4(C ditambahkan 50 ml NaCl pH 7 pada suhu 4(C diblender disentrifugasi 10 menit dengan kecepatan 9000 rpm difiltrasi diambil 20 mL ditambahkan 2,68 gram NH4SO4 tahap 1, tahap 2 dan 3 2,92 gram NH4SO4 disentrifugasi 8000 ppm

dibekukan 4(C diberi NaCl pH 5 ditambahkan 100 mL buffer fosfat 0,1 pH 5 difiltrasi3.2.2 Ekstraksi Fosfolipid pada Kedelai

- ditimbang sebanyak 5 gram-dihaluskan dengan penambahan 10 mL metanol -disaring dengan kertas saring-ditampung filtrat dalam gelas beaker-ditambah 30 mL campuran metanol-kloroform (1: 2) v/v-diaduk dan didiamkan selama 10 menit

-ditambah larutan Na2CO3 20 %-dimasukkan ke dalam corong pisah dan dikocok sampai terbentuk dua lapisan-diambil lapisan bawah sebanyak 10 mL dan ditampung dlam vial 25 mL

3.2.3 Ekstraksi Fosfolipid pada Telur

- dipisahkan kuningnya-dimasukan kuning telur ke dalam gelas kimia yang berisi campuran 50 ml alkohol 95 % dan 25 ml eter-diaduk sampai homogen-didiamkan selama 10 menit dan sewaktu-waktu diaduk-disaring dengan kertas saring yang telah dibasahi dengan alkohol ke dalam gelas kimia yang kering-dikeringkan filtrat (hasil saringan) dengan memanaskannya di atas penangas uap

3.2.4 Uji Kolin

dimasukkan kedalam tabung reaksi. ditambahkan 0,1 mL enzim, 0,3 mL buffer asetat 0,05 M pH 5,6 , 0,1 CaCl2 0,1 M dan 3,5 mL eter dan di kocok sampai terbentuk emulsi. di inkubasi pada suhu 25(C selama 90 menit ditambah eter sampai volumenya menjadi 5mL. di kocok dan ditutup selama 45 menit. di setrifuge dan lapisan air yang diperoleh dipisahkan dari lapisan eter. diambil 1 mL lapisan air dan ditambahkan 0,5 mL reagen iodin, dicampur dan ditempatkan dalam ice bath selama 15 menit. di sentifuge dan endapan dilarutkan dengan kloroform sampai volumenya 5 mL. di ukur absorbansinya pada panjang gelombang optimum 365 nm. 3.2.5 Uji Fosfotidat

dimasukkan kedalam tabung reaksi. ditambahkan 0,1 mL enzim ditambah dengan reagen molibdat dan didapat larutan menjadi kuning keruh. ditambah FeSO4 agar membentuk kompleks. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan dan memberikan warna biru (ortofosfat).

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.1.1 Uji Fosfotidat Telur

Penambahan ReagenKeteranganGambar

+ reagen molibdatBerwarna Kuning

+ FeSO4Positif berwarna biru kehijauan

4.1.2 Uji Fosfotidat Kedelai

Penambahan ReagenKeteranganGambar

+ reagen molibdatBerwarna Kuning

+ FeSO4Positif berwarna biru kehijauan

4.1.3 Uji Kolin Pada Telur

4.1.4 Uji Kolin Pada Kedelai

4.2 Pembahasan

Praktikum mini projek bioreaksi yang telah dilakukan oleh kelompok 8 adalah mengenai Isolasi dan Uji Aktivitas Enzim Fosfolipase D dari Kubis dengan Substrat Lesitin dari sumber Kedelai dan Telur. Tahapan yang dilakukan pertama kali adalah preparasi sampel untuk mengekstraksi enzim fosfolipasi D dari kubis. Berikut gambarnya:

Gambar 1. Proses preparasi sampel enzim Fosfolopase DSetelah itu sampel kubis yang akan di blender, ditimbang sebanyak 100 gram dan direndam selama 1 hari didalam freezer lemari es. Lalu sampel yang sudah disimpan dalam freezer dicairkan dalam suhu ruang dan siap diblender dengan 50 ml larutan NaCl dengan pH 7. Enzim seperti halnya protein mengandung sejumlah besar gugus karboksil dan amina yang mempengaruhi kelarutan dan sifat asam basanya. Garam netral tertentu seperti NaCl dapat mengurangi kelarutan protein dalam air. Proses ini disebut salting out dan dapat digunakan untuk mengisolasi enzim. Digunakan larutan garam ber pH netral bertujuan untuk mempertahankan enzim agar tidak cepat mati.

Gambar 2. Struktur Fosfolipase D

Gambar 3. Hasil proses pemblenderan didapatkan slory kubis

Setelah didapat slory, slory tersebut dimasukkan dalam tabung reaksi mini untuk dilakukan sentrifugasi 8000 rpm selama 15 menit. Proses sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan supernatan dengan peletnya.

Gambar 4. Hasil proses sentrifugasi

Gambar 5. Supernatan (kiri), Pelet (kanan)Pada supernatannya ditambahkan dengan (NH4)2SO4 yang bertujuan untuk mengendapkan enzim. Sedangkan pada peletnya ditambah larutan NaCl pH 5 dan buffer fosfat pH 5 sebanyak 100 ml karena enzim bekerja pada pH 5 dan buffer digunakan untuk mengkondisikan reaksi pada isolasi enzim fosfolipase D, tetapi sebelum ditambahkan larutan tersebut pelet harus dibekukan selama 1 hari pada 4oC.

Selanjutnya dilakukan ekstraksi enzim fosfolipase D dari Kubis. Berikut gambarnya:

Gambar 6. Hasil Ekstraksi Enzim Fosfolipase DGambar tersebut merupakan pelet dari kubis dimana pelet tersebut dilarutkan dalam 20 ml NaCl pH 5 dan 100 ml larutan buffer fosfat 0,1 M pH 5. Tujuan ditambahkannnya larutan NaCl untuk mengendapkan enzim fosfolipase D pada pelet sehingga enzim bisa terekstraksi, sedangkan penambahan buffer fosfat pH 5 untuk mengkondisikan enzim karena enzim fosfolipase D bekerja pada pH 5. Berikut gambar ekstraksi enzim fosfolipase D:

Gambar 7. Hasil Ekstraksi Enzim Fosfolipase D

Selanjutnya praktikum dilanjutkan dengan pembuatan substrat enzim fosfolipase D yaitu lesitin dari kedelai. Kedelai ditimbang sebanyak 5 gram setelah itu dihaluskan dengan mortar disertai penambahan 10 ml metanol.

Gambar 8. Penambahan metanolSetelah ditambahkan metanol, filtrat ditambung dalam beker gelas dan ditambahkan campuran metanol dan kloroform 1:2 sebanyak 30 ml.

Gambar 9. Penambahan campuran metanol dan kloroform 1:2

Lalu filtrat diekstraksi dengan Na2CO3 20% dan KCl dengan dimasukkan kedalam corong pisah, dikocok hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan bawah diambil dan ditampung dalam beker gelas. Berikut gambarnya:

Gambar 10. Proses ekstraksi menggunakan Na2CO3 20% dan KCl

Setelah substrat lesitin kedelai dibuat, dilanjutkan dengan pembuatan substrat lesitin dari kuning telur. Langkah pertama dipisahkan kuning telur dari putihnya dilanjutkan dengan memasukan kuning telur ke dalam gelas kimia yang berisi campuran 50 ml alkohol 95 % dan 25 ml eter. Fungsi penambahan alkohol dan eter adalah untuk mengemulsikan lesitin dimana didalam lesitin tersebut mengandung fosfatidilkolin, lalu diaduk sampai homogen didiamkan selama 10 menit dan sewaktu-waktu diaduk.

Gambar 11. Telur dengan penambahan alkohol 95 %disaring dengan kertas saring yang telah dibasahi dengan alkohol ke dalam gelas kimia yang kering dan dikeringkan filtrat (hasil saringan) dengan memanaskannya di atas penangas uap.

Gambar 12. Hasil substrat lesitin pada telur

Setelah diperoleh substrat lesitin dari kedelai dan kuning telur, dilanjutkan dengan uji fosfatidat dan kolin.

fosfatidilkolin (lesitin)Asam Fosfatidat + kolin (basa)

fosfolipase D

Fosfatidilkolin merupakan bagian dari fosfolipid. Fosfatidilkolin dikenal juga sebagai lesitin, banyak diekstrak dari kuning telur atau kacang kedelai. Dalam percobaan yang telah dilakukan pada uji fosfatidat, langkah-langkahnya adalah substrat dan enzim yang telah diinkubasi pada suhu kamar selama 90 menit, ditambahkan reagen molibdat dan FeSO4 akan membentuk warna kompleks ortofosfat berwarna biru kehijauan yang menandakan terdapatnya fosfatidat didalam substrat tersebut, terbukti dengan hasil yang didapat dari percobaan yang telah dilakukan (lihat bagian hasil).

Sedangkan untuk uji kolin pada percobaan ini kami gagal melakukannya, kemungkinan pada saat pengenceran untuk mengukur nilai absorbansi kolin dengan spektrometer UV sample yang digunakan terlalu encer untuk sample kedelai dan kuning telur. Selain itu, pada uji kolin ini tidak menggunakan standar kolin sehingga hanya bersumber pada literatur, dimana pada literatur tersebut panjang gelombang maksimal dari kolin adalah 365 nm. Kurva absorbansi uji kolin bisa dilihat di bagian hasil.BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Dari percobaan yang telah dilakukan uji substrat lesitin pada kuning telur dan kedelai yaitu uji fosfatidat pada percobaan yang dilakukan berhasil dilakukan dengan terbentuknya kompleks ortofosfat yang ditandai dengan terbentuknya warna biru kehijauan pada substrat lesitin kedelai san kuning telur,

Sedangkan untuk uji kolin, hasil dari percobaan yang telah dilakukan masih belum mendeteksi adanya kolin dengan bantuan spektrometer UV, kemungkinan terjadi kesalahan sehingga gagal mendeteksi adanya kolin pada sample.

BAB VI

DAFTAR PUSTAKA

Sugiartadi. 2009. Isolasi dan uji aktivitas spesifik Fosfolipase dari Kubis Bunga (Brasica Oleracea Var Botrytis Lam) pada sistem Ampifatik. Jurnal FMIPA, Universitas Diponegoro.

Gupta, M.N., Teotia, S. 2003. Purification of Phospholipase Dby Two Phase ffinity Extraction. Journal of Chemistry Department, Indian Institute of Technology.ISOLASI DAN UJI REAKSI ENZIMATIS FOSFOLIPASE D DARI KUBIS DENGAN SUBSTRAT LESITIN DARI KEDELAI DAN KUNING TELUR

Kubis

Filtrat

Pelet

supernatan

Filtrat

Hasil

Kedelai

Hasil

Telur

Hasil

1 mL lesitin

Hasil

1mL Lesitin

Hasil