Lampiran 3

STANDAR OPERASIONAL PROSEDUR (SOP)

PROSEDUR PERLAKUAN PADA HEWAN COBA

Sebelum Perlakuan :

Tikus yang disediakan adalah tikus yang sudah mendapatkan sertifikat

mengenai kondisi kesehatannya (bebas dari segala penyakit)

Tikus belum pernah diperlakukan sebagai hewan coba sebelumnya

Tikus berjenis kelamin jantan dengan berat + 200 g dan berusia 3 bulan

1. Dilakukan aklimatisasi sebelum mendapatkan perlakuan dalam rentang waktu

selama 7 hari. Pada saat ini hewan dikandangkan dengan kondisi secara

biologis optimal dan keperluan hidupnya memadai (nyaman fisik, fisiologis

dan biologis). Selanjutnya hewan uji dikelompokkan secara acak menjadi 5

kelompok, yaitu kelompok K(-), P1, P2, P3 dan K(+). Dan masing-masing

kelompok terdiri dari 5 ekor tikus

2. Standart ruang kandang : luas lantai ± 20 m2 berbentuk segiempat siku-siku,

dengan tinggi 2,5-3,0 m yang akan memberi kemudahan pemeliharaan

lingkungan, pengawasan hewan dan tidak mengganggu hewan yang

dipelihara di dalamnya.

Lampiran 3

3. Ukuran panjang dan lebar kandang adalah lebih panjang dari panjang tubuh

hewan termasuk ekornya. Konstruksi bangunan memiliki ventilasi yang baik

sehingga suhu dan kelembabannya disesuai dengan kebutuhan hewan.

4. Jika terdapat beberapa jenis intervensi maka hewan dikelompokkan dalam

beberapa kandang sesuai kelompok intervensinya hal ini untuk memudahkan

perlakuan dan kontrol.

5. Dilakukan pengamatan berat badan dan kondisi fisik sebelum perlakuan.

6. Selama adaptasi tikus diberi pakan standart (pellet) dan minum secara ad

libitum.

7. Kandang pemeliharaan diperhatikan kebersihannya. Ruang tempat kandang

dengan ventilasi yang baik, penyinaran normal, suhu dan kelembapan

diperhatikan.

8. Penggunaan hewan coba akan dilebihkan untuk tiap kelompoknya sesuai

dengan perhitungan secara statistik, bertujuan menghindari kondisi sakit atau

kematian sebelum perlakuan.

9. Mempersiapkan materi perlakuan dengan menghitung kebutuhan materi

untuk tiap kelompok perlakuan

Saat Perlakuan :

1. Pemberian perlakuan sesuai dengan prosedur dan tujuan penelitian tanpa

mengesampingkan standart pemeliharaan yang harus dipenuhi

2. Dilakukan kontrol dan pengamatan terhadap perubahan-perubahan yang

terjadi baik perilaku hewan, berat badan dan kondisi fisiknya

Lampiran 3

3. Pada hari ke-8 sampai dengan hari ke-35 Kelompok P1, P2, dan P3 diberi

ekstrak kulit buah naga super merah dan aquades ad libitum.

4. Pada hari ke- 36 masing-masing tikus tiap kelompok diambil darahnya

melalui jantung dan mengambil organ paru pada masing-masing tikus tiap

kelompok.

5. Pada hari ke -0 sampai dengan hari ke-35

Kelompok P1 : tikus diberi ekstrak kulit buah naga super merah 1,757

gr/ml dan mulai hari ke-8 diberi paparan asap rokok.

Kelompok P2 : tikus diberi ekstrak kulit buah naga super merah 3,15

gr/ml dan mulai hari ke-8 diberi paparan asap rokok.

Kelompok P3 : tikus diberi ekstrak kulit buah naga super merah

4,725 gr/ml dan mulai hari ke-8 diberi paparan asap rokok.

Kelompok K(+) : tikus diberi paparan asap rokok mulai hari ke-8

sampai hari ke-35.

Setelah Perlakuan :

1. Dilakukan kontrol dan pengamatan, sesuai dengan prosedur dan tujuan

penelitian maka hewan diperlakukan sedemikian sehingga dari hewan

tersebut dapat diambil sebagai sampel penelitian.

2. Pada hari ke-36 dilakukan pengambilan sampel darah pada siang hari untuk

menghindari perubahan karena ritme diurnal, yang mana pemangambilan

darah diambil melalui jantung, setelah ditampung pada eppendorf dan diukur

kadar MDA masing-masing tikus tiap kelompok.

Lampiran 3

3. Pada proses pembedah di hari ke-36 dilakukan pengambilan sampel organ

paru untuk dilakukan pemeriksaan makrofag alveolar dengan cara pembacaan

menggunakan mikroskop.

Manajemen Produk:

1. Darah yang terambil ditampung pada tabung vacutainer 3 cc disposable dan

diletakkan dalam rak posisi vertikal, dibiarkan beberapa saat hingga serum

tampak terpisah.

2. Darah disentrifuge dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit.

3. Serum yang terpisah diambil dan ditampung dalam penampung serum (vial)

dengan menggunakan pipet disposable.

4. Sebelumnya vial serum telah dilabel (diberikan identitas) dan label dilapis

dengan selotip. Tutup vial ditutup rapat dan diatasnya (sekeliling tutup) dilapis

dengan parafilm untuk menghindari tumpahan serum saat pengiriman.

5. Vial yang terisi serum dikumpulkan dalam box tertutup yang didalamnya telah

berisi ice pack dingin (+ suhu 5˚C) dan siap dikirim ke laboratorium untuk

segera dianalisa kadar MDA-nya.

6. Sisa darah dibuang dalam alat penampung limbah medis dan nantinya akan

mendapat perlakuan sesuai SOP pembuangan limbah (infeksius).

Tehnik pengambilan Sampel Histopatologi

Saat nekropsi dilakukan, ingat dua hal : kualitas spesimen yang dijadikan

bahan pemeriksaan histopatologi (studi mikroskopis) akan lebih baik jika

diperhatikan cara penyimpanannya dan apabila timbul keraguan maka potong

Lampiran 3

sebagian dan simpan serta awetkan. Hal berikut harus dijalankan untuk menjamin

kualitas spesimen yang antara lain dengan:

1. Jaringan yang telah disimpan dalam formalin adalah berasal dari hewan yang

baru mati.

2. Paling tidak gunakan 10x volume buffer formalin 10% dari jumlah jaringan

yang diambil untuk preparat histopatologi.

3. Hanya gunakan kontainer yang dapat terbuka lebar. Sebaiknya tempatkan

kontainer formalin ditempat yang tertutup rapat saat diperjalanan.

4. Hindari jaringan yang dibekukan dalam freezer baik sebelum dan sesudah

difiksasi dalam formalin.

5. Jaringan sebaiknya hanya setebal ¼ inchi (0,5 cm).

6. Potong hati, atau organ lain sesuai kebutuhan, pada satu sisi yang sama,

kemudian difiksasi dengan pengawet (formalin 10%).

Lampiran 3

PENGAMBILAN DAN PENGIRIMAN SPESIMEN UNTUK

PEMERIKSAAN LABORATORIUM

Guna menegakan diagnosa yang pasti kausa penyakit atau kematian dari

hewan, diperlukan pemeriksaan lanjutan berdasakan perubahan makroskopis yang

ditemukan, dan analisis dari anamnesa.

Untuk bahan penelitian, sampel atau organ diambil sesuai kebutuhan.

Pedoman Umum

1. Semua meterial, harus diberi lebel yang jelas tentang : jenis organ /

jaringannya, tanggal pengambilan, species hewannya, bahan pengawetnya,

yang ditulis dalam dengan jelas pada surat pengantarnya.( terlampir )

2. Pot / plastik tempat spesimen, ditulis kode / jenis hewannya/ identitas yang

lain, sesuai dengan surat pengantarnya.

3. Sertakan hasil nekropsi yang tampak, dalam lampiran tersebut.

4. Untuk spesimen keperluan pemeriksaan bakeriolgi, virologi, parasit harus

dalam pengawet yang benar, dan sampai di laboratorium dalam keadaan

yang baik.

Beberapa Cara pengiriman Spesimen dan Pengawetnya.

Untuk pemeriksaan histopatologi.

Tujuan :

Mengetahui perubahan morfologi secara makroskopis /

mikroskopis dari jaringan tersangka hewan sakit/ mati , guna menentukan

Lampiran 3

penyebab/ kausanya. Sedang untuk keperluan penelitian, hasil

pemeriksaan histopatologik apapun yang adalah yang akan dijadikan hasil

dari penelitian tersebut.

Hasil nekropsi dapat secara langsung mengetahui kausanya,

berdasarkan adanya perubahan morfologis yang pasti / patognomonis.

Cara :

Spesimen hendaknya diambil secepat mungkin, setelah kematian.

Keterlambatan dalam pengambilan spesimen (lebih dari 8 jam),

mengakibatkan autolisis sel-selnya. Setiap potongan spesimen, ambil jaringan

yang tampak patologis dan sehat, dipotong kurang lebih 1cm sampai 2cm,

dengan ketebalan 1 cm. Masukkan dalam larutan fiksasi : buffer formalin 10

%, dengan perbandingan jumlah specimen dan larutan adalah 1 : 10,

sebelumnya, dicuci dulu. Bila langsung dimasukan dalam alkohol akan

mengerutkan jaringan.

PROFIL HEWAN COBA

 Tikus

Filum : Chordata

Subfilum : Vertebrata

Classis :Mammalia

Subclassis : Placentalia

Ordo : Rodentia

Familia : Muridae

Lampiran 3

Genus : Rattus

Species : Rattus Novergicus

1. Sangat cerdas

2. Tidak begitu fotofobik

3. Aktivitasnya tidak terhambat dengan kehadiran manusia

4. Bila diperlakukan kasar atau dalam keadaan defisiensi nutrisi, cendrung

menjadi galak dan sering menyerang

5. Dapat hidup sendiri di kandangnya

Cara memperlakukan tikus :

1. Angkat dengan cara memegang bagian ujung ekor, letakkan pada kawat

kandang.

2. Tangan kiri bergerak dari belakang dengan jari tengah dan telunjuk

“mengunci” tengkuknya, sementara ibu jari menjepit kaki depan.

3. Untuk perlakuan yang hanya memerlukan ekor, masukkan  ke dalam “holder”.

DATA BIOLOGIK NORMAL TIKUS

Konsumsi pakan per hari : 5 g/100 g bb

Konsumsi air minum per hari : 8-11 ml/100 g bb

Diet protein : 12%

Ekskresi urine per hari : 5,5 ml/100 g bb

lama hidup : 2,5- 3 tahun

Bobot badan dewasa : Jantan : 300-400 gr

Betina: 250-300 g

Lampiran 3

Bobot lahir : 5-6 g

Dewasa kelamin (jantan=betina) : 50+10 hari

Siklus estrus (menstruasi) : 5 hari (polyestrus)

Umur sapih : 21 hari, 40-50 g

Mulai makan pakan kering : 12 hari

Rasio kawin : 1 jantan – 3 atau 4 betina

Jumlah kromosom : 42

Suhu rektal : 37,5oC

Laju respirasi : 85 x/mn

Denyut jantung : 300 – 500 x/mn

Pengambilan darah maksimum : 5,5 ml/Kg

Jumlah sel darah merah (Erytrocyt) : 7,2-9,6 X 106 / μl

Kadar haemoglobin(Hb) : 15,6 g/dl

Pack Cell Volume (PCV) : 46%

Jumlah sel darah putih (Leucocyte) : 14 X 103 /μl

Lampiran 3

Penyiapan hewan coba diawali dengan proses aklimatisasi atau adaptasi dengan

pemeliharaan. Prosesnya dilakukan selama 3-7 hari dalam kondisi laboratorium.

Prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut :

Tiap hewan coba yang akan digunakan dalam penelitian ditandai dengan penandaan

tertentu sesuai SOP identifikasi hewan coba.

Masing-masing berat badan tikus ditimbang menggunakan timbangan analitik, sesuai

dengan SOP penimbangan hewan coba.

Tikus yang telah ditimbang dimasukkan kedalam kandang, pemeliharaan dan

perawatan sesuai SOP pemeliharaan dan perawatan hewan coba.

Tikus diberi pakan standar dan minuman yang diganti setiap hari.

Tikus dipantau kondisi kesehatannya dengan cara mengamati keaktifan perilaku tikus

setiap harinya.

Apabila tikus mengalami sakit maka dipisahkan dalam kandang berbeda kemudian

dilakukan pengobatan. Setelah tikus dinyatakan membaik, maka kembali

digabungkan ke dalam kandang semula.

Ditimbang kembali Masing-masing tikus pada akhir masa aklimatisasi. (Tikus

dikeluarkan dari kelompok percobaan jika mengalami penurunan berat badan

sebesar 10% dari berat badan semula).

Standar Operasional Prosedur

Aklimatisasi

Standar Operasional Prosedur

Aklimatisasi

Lampiran 3

Dilakukan untuk mengetahui kelompok hewan yang diperlakukan berbeda dengan

kelompok lain.

Disiapkan sejumlah larutan penanda, bisa menggunakan carbol fuschin, methylen

blue, gentian fiolet, malachite green dll

Tikus diambil satu persatu dari dalam kandang, pertama pegang seluruh tubuh

tikus dengan telapak tangan di atas punggung, jari telunjuk diletakkan dibelakang

kepala, ibu jari dan jari kedua dibawah ketiak yang berlawanan. Letakkan ibu jari

dibawah rahang untuk mencegah gigitan.

Beri warna pada tikus dibagian tertentu pada tubuhnya (kepala, punggung,

telinga, kaki depan dan kaki belakang), dan dilakukan penandaan kembali setiap 2-

4 hari.

Standar Operasional Prosedur

Penandaan (Identifikasi) Hewan Coba

Standar Operasional Prosedur

Penandaan (Identifikasi) Hewan Coba

Lampiran 3

Disiapkan kandang untuk hewan coba dengan ukuran 30x40x40 cm yang terbuat dari bak

plastik dan ditutup anyaman kawat

Bagian lantai kandang dialasi dengan sekam untuk menyerap kotoran tikus dan

menggantinya setiap selang waktu 2 hari.

Pakan standar dan minuman diletakkan pada bagian atas kandang. Air minum harus selalu

tersedia untuk hewan coba setiap saat kecuali kontraindikasi oleh protokol penelitian.

Makanan dan air minum dalam wadah diganti dengan air minum bersih yang baru setiap

hari.

Tikus dirawat dalam ruangan yang memiliki ventilasi yang baik, sumber cahaya yang

memadai dan terlindung dari gangguan hewan lain.

Melakukan kegiatan pemeliharaan dan perawatan di pagi hari.

Standar Operasional Prosedur

Pemeliharaan dan Perawatan Hewan Coba

Standar Operasional Prosedur

Pemeliharaan dan Perawatan Hewan Coba

Lampiran 3

Timbangan analitik disiapkan dalam posisi ON

Hewan uji dimasukkan satu persatu ke dalam pinggan timbangan (berbentuk baskom)

Data berat badan tikus dari hasil penimbangan tersebut, dicatat dalam kertas tabel.

Lakukan penimbangan pada pagi hari sebelum masa adaptasi, akhir adaptasi dan 1

minggu sekali selama penelitian (hari ke-7, 14, 21 dan 28)

Standar Operasional Prosedur

Penimbangan Berat Badan

Standar Operasional Prosedur

Penimbangan Berat Badan