LAPORAN RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI VIROLOGIPerhitungan Jumlah Bakteri denganMetode Angka Lempeng Total (ALT)

Dosen Pengampu : Ganet Eko Pramukantoro, M.Si., Apt.

Teori: EAnggota: Wilujeng Sulistyorini(191338 A) Fitri Jaya Santi(191338 A) Wahyu Purwanjani(191338 A)

PROGRAM STUDI S1 FARMASIFAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SETIA BUDISURAKARTA2015I. JudulPerhitungan Jumlah Bakteri dengan Metode Angka Lempeng Total (ALT)

II. Tujuan Melakukan perhitungan jumlah bakteri secara tidak langsung dengan metode tertentu dengan menggunakan media kultur. Dapat mengetahui dan memahami cara pengujian ALT dengan benar.

III. Dasar TeoriMetode kuantitatif digunakan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu sampel, umumnya dikenal dengan Angka Lempeng Total (ALT). Uji Angka Lempeng Total (ALT) dan lebih tepatnya ALT aerob mesofil atau anaerob mesofil menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara visual berupa angka dalam koloni (CFU) per ml/g atau koloni/100ml. Cara yang digunakan antara lain dengan cara tuang, cara tetes dan cara sebar (BPOM, 2008). Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFUs) per ml. Koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya.Prinsip pengujian Angka Lempeng Total menurut Metode Analisis Mikrobiologi (MA PPOM 61/MIK/06) yaitu pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah cuplikan diinokulasikan pada media lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. Pada pengujian Angka Lempeng Total digunakan PDF (Pepton Dilution Fluid) sebagai pengencer sampel dan menggunakan PCA (Plate Count Agar) sebagai media padatnya. Digunakan juga pereaksi khusus Triphenyl Tetrazalim Chlotide 0,5 % (TTC).Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut :a) Satu koloni dihitung 1 koloni.b) Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.c) Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.d) Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni.e) Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidak dihitung.f) Koloni yang besarnya kurang dari setengah cawan dihitung 1 koloni.Hal-hal penting yang harus dipikirkan matang sebelum menganalisa sampel untuk diketahui jumlah mikroorganismenya yaitu memperkirakan jumlah mikroorganisme yang ada dalam sampel per satuan volume, memilih metode yang cocok sehingga dihasilkan data yang akurat, mengetahui jenis atau golongan mikroorganisme yang akan dihitung, menentukan media pertumbuhan yang cocok, mengetahui perbedaan morfologi koloni antara bakteri, serta mencari tahu standar atau batas ambang atau jumlah maksimum aman jika sampel yang dianalisa memerlukan referensi tersebut.Interpretasi hasil Angka Lempeng Total yaitu dapat diuraikan sebagai berikut :1. Bila salah satu cawan petri menunjukkan jumlah koloni 30 atau kurang dari 300 koloni, dihitung jumlah koloni, kemudian dikalikan faktor pengencernya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap g atau mL contoh.2. Jika terdapat cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah koloni antara 30-300, maka dihitung jumlah koloni dari masing-masing tingkat pengenceran kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Apabila hasil perhitungan pada tingkat yang lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata lebih besar dari 2 kali jumlah koloni rata-rata pada pengenceran bawahnya, maka Angka Lempeng Total dipilih dari tingkat pengenceran yang lebih rendah.3. Bila hasil perhitungan pada pengenceran lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata kurang dari 2 kali jumlah koloni rata-rata kedua tingkat pengenceran, maka Angka Lempeng Total dijumlah lalu dibagi dua.4. Bila tidak ada satupun koloni dalam cawan maka Angka Lempeng Total adalah dinyatakan sebagai kurang dari satu dikalikan faktor pengencer terendah.5. Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni lebih dari 300, dipilih cawan dari tingkat pengenceran tertinggi kemudian dibagi-bagi menjadi beberapa sektor dan dihitung jumlah koloni dari satu sektor. Angka Lempeng Total adalah jumlah koloni dikalikan dengan jumlah sektor, kemudian dihitung rata-rata dari kedua cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran.6. Jika jumlah koloni rata-rata dari1/8 bagian cawan lebih dari 200, maka Angka Lempeng Total dinyatakan lebih besar dari 200x8 dikalikan faktor pengenceran.7. Perhitungan dan pencatatan hasil Angka Lempeng Total hanya ditulis dlam dua angka. Angka berikutnya dibulatkan ke bawah bila kurang dari 5 dan dibulatkan ke atas bila lebih dari 5.Keuntungan lainnya dapat diketahui adanya mikroba jenis lain yang terdapat dalam contoh, dapat mengetahui jumlah mikroba yang dominan sederhana, mudah dan sensitive karena menggunakan koloni counter sebagai alat hitung dan dapat digunkan untuk menghitung mikroorganisme pada sampel makanan, air, ataupun tanah. Adapun kelemahan dari metode ini adalah :1) Kemungkinan terjadinya koloni yang berasal lebih dari satu sel mikroba, seperti pada mikroba yang berpasangan, rantai atau kelompok sel.2) Kemungkinan ini akan memperkecil jumlah sel mikroba yang sebenarnya. Kemungkinan adanya jenis mikroba yang tidak dapat tumbuh karena penggunaan jenis media agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen selama masa inkubasi.3) Kemungkinan ada jenis mikroba tertentu yang tumbuh menyebar diseluruh permukaan media agar sehingga menghalangi mikroba lain. Hal ini akan mengakibatkan mikroba lain tersebut tidak terhitung.4) Penghitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi mikrobanya antara 30-300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari 30 koloni akan menghasilkan penghitungan yang kurang teliti secara statistik, namun bila lebih dari 300 koloni akan menghasilkan hal yang sama karena terjadi persaingan diantara koloni.5) Penghitungan populasi mikroba dapat dilakukan setelah masa inkubasi yang umumnya membutuhkan waktu 24 jam atau lebih (Buckle, 1987).

IV. Alat dan BahanAlat Bahan Lampu spirtus- Air ledeng Korek- Air fisiologis Cawan petri- NaCl fisiologis 0,9% Pipet ukur- Media Nutrien Agar (NA) Pipet pump- Spirtus

V. Cara Kerja1. Menyiapkan alat dan bahan.2. Melakukan pengenceran bertingkat dengan cara memipet 1 cc sampel lalu dimasukkan kedalam tabung reaksi pertama yang sudah berisi pengencer sebanyak 9 cc kemudian dihomogenkan.3. Setelah homogen, memipet 1 cc dari tabung reaksi pertama, kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi kedua yang sudah berisi 9 cc pengencer lalu dihomogenkan.4. Memipet 1 cc sampel, dimasukkan kedalam cawan petri yang pertama, memipet 1 cc dari tabung reaksi yang pertama kemudian dimasukkan ke cawan petri yang kedua. Lalu memipet 1 cc dari tabung reaksi yang kedua kemudian dimasukkan kedalam cawan petri yang ketiga.5. Mengambil media Nutrien Agar yang telah dicairkan kedalam masing-masing cawan petri tersebut.6. Mencampurkan secara merata antara sampel dengan media yang telah cair dengan cara memutar cawan petri setelah itu didiamkan hingga mengeras.7. Setelah mengeras, lalu diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam.

VI. Hasil Pengamatan

J u m l a h K o l o n i P e n g e n c e r a n

10010-110-2

2652

IIIIII

VII. Pembahasan Pada percobaan ini dilakukan percobaan analisa perhitungan kuantitas mikroba dengan menggunakan teknik pour plate yaitu teknik penanaman dengan cara mencampurkan sampel yang mengandung sel mikroba dengan media pertumbuhan (agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan agar atau di dalam agar. Konsekuensinya adalah tidak semua jenis mikroorganisme dapat tumbuh di dalam agar (bersifat mikro aerofilik). Volume yang dipakai pada umumnya adalah 1-2 ml pada cawan dengan diameter 9 cm dan dengan penambahan media 5-10 ml. Sebaiknya sampel yang dipakai untuk teknik ini memiliki densitas sel > 30 sel/ml sehingga didapatkan kisaran 30-300 koloni/cawan.Semakin besar ukuran sampel berarti semakin kecil konsentrasi komposisi media semakin encer) dengan penambahan media yang semakin berkurang jika digunakan ukuran cawan yang sama. Selain itu, semakin besar ukuran sampel dan jika ditambah dengan volume media yang sama maka pada saat pencampuran (swirl) dapat beresiko tumpah dan membasahi celah antara tutup dan dasar cawan petri yang akhirnya mempertinggi kontaminasi karena bakteri kontaminan yang menempel pada tempat itu dapat tumbuh. Ketiga alasan inilah yang menjadi keterbatasan metode pour plate.Dalam percobaan ini juga dilakukan pengenceran untuk menipiskan konsentrasi mikroorganisme yang terdapat dalam suatu sample sehingga pertumbuhan koloni tidak terlalu rapat satu sama lain. Sehingga mempermudah pengamatan pada waktu perhitungan ALT kapang dan bakteri dan juga kita akan melilhat bagaimana pertumbuhan jumlah koloni tiap-tiap konsentrasi pengenceran yang berbeda. Pengenceran sampel juga dimaksudkan untuk menginaktifkan pengawet yang ada dalam sediaan tersebut karena dikhawatirkan akan mempengaruhi pengujian sehingga data yang diperoleh tidak akurat.Pada metode ALT bakteri menggunakan prinsip yakni perhitungan jumlah koloni mikroba dengan menggunakan media NA berdasarkan adanya pertumbuhan mikroba pada cawan petri setelah diinkubasi pada inkubator suhu 37C selama 1 x 24 jam. Digunakan medium NA (Nutrien Agar) karena mengandung banyak protein yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri. Dari hasil pengamatan untuk sampel marjan ternyata memenuhi persyaratan menurut literature yang terdapat di SNI.Pada perhitungan mikroba dengan menggunakan metode Angka Total Lempeng dengan pengenceran 100, 10-1, 10-2 menghasilkan jumlah koloni yang berbeda beda. Pada tingkat pengenceran 100, jumlah koloni bakteri yang ditemukan adalah 26 koloni. Pada tingkat pengenceran 10-1, jumlah koloni yang ditmukan adalah 5 koloni. Pada pengenceran 10-2, koloni yang ditemukan adalah 2 koloni. Jumlah keseluruhan bakteri yang ditemukan dari tingkat pengenceran terendah (100) hingga tingkat pengenceran tertinggi (10-2) berjumlah 31 koloni bakteri.Jumlah tersebut mempengaruhi perhitungan ALT koloni. Koloni yang ditemukan pada praktikum ini < 30 sehingga ALT koloni yang dihitung adalah dari koloni yang ada pada tingkat pengenceran terendah yaitu 100. Sehingga, ALT koloni pada praktikum ini adalah : ALT koloni= < 30 x = < 30= < 3,0 x (2,6 x )Berdasarkan hasil pengamatan, diketahui bahwa semakin tinggi tingkat pengenceran maka jumlah koloni bakteri semakin sedikit. Hal ini dapat dilihat pada pengenceran 100 memiliki jumlah koloni yang terbanyak dan pengenceran 10-2 memiliki jumlah koloni paling sedikit. Jumlah koloni yang berkurang seiring dengan peningkatan pengenceran disebabkan karena jumlah bakteri yang terkandung dalam tiap 0,1 mL volume inokulan yang dipindahkan semakin berkurang akibat pengenceran yang dilakukan. Pada praktikum ini, didapatkan jumlah koloni kurang dari 30 maka kemunkinan penyebabnya yaitu : Akibat kesalahan statistik, Mikroba sangat sensitif terhadap kontaminan (jumlah bakteri kontaminan yang tidak sengaja masuk, besar pengaruhnya terhadap jumlah akhir koloni per cawan), Kerja aseptis yang tidak teliti.

VIII. KesimpulanDari percobaan yang telah dilaksanakan diperoleh kesimpulan sebagai berikut :1. Tujuan dari pengenceran adalah pada setiap sampel adalah untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan sehingga membantu untuk mempermudah perhitungan jumlah mikroba.2. Semakin tinggi tingkat pengenceran, maka jumlah koloni bakteri semakin sedikit.3. Jumlah perhitungan bakteri yang dihasilkan disetiap sampel berbeda, tergantung air yang digunakan ataupun jumlah bakteri yang terdapat dalam sampel.

IX. Daftar PustakaJutono, J. S, Hartadi, S, Kabirun . S.S, Suhadi, D, Judoro dan Soesanto. 1973. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM. YogyakartaPratiwi, Sylvia. 2008.Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : ErlanggaLay, B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Raja Grafindo PersadaCurtis, Helena, Barnes, N. Sue. 1999.Biology 5th edition. New York : Worth Publisher IncHadioetomo, RS. 1993.Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi. Jakarta : Gramedia